東北虎豹國(guó)家公園梅花鹿的空間遺傳格局及其影響因素

段興漢,吳 峰,張素青,鮑 蕾,王紅芳,*

1 生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100875 2 東北虎豹國(guó)家公園保護(hù)生態(tài)學(xué)國(guó)家林草局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100875 3 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100875

空間遺傳格局是物種在種群內(nèi)或種群間遺傳多樣性的空間分布格局,種群遺傳學(xué)過(guò)程是空間遺傳格局形成的基礎(chǔ),而景觀中斑塊、基質(zhì)的空間配置、物種性狀差異可能增加了空間遺傳格局的復(fù)雜性[1]。然而,在不同物種或者不同生境下,這一期望格局的強(qiáng)度卻存在較大變異,主要原因是景觀基質(zhì)可能影響種群間的功能連通度。多項(xiàng)研究表明,地理距離、地形、人造景觀、土壤類型、溫度、濕度等都對(duì)動(dòng)植物分布有顯著的影響[2—5]。因此,探究物種的空間遺傳格局,分析格局形成的過(guò)程,有效識(shí)別可能的基因流障礙,可為制定有效種群保護(hù)策略提供依據(jù)。

東北梅花鹿(Cervusnipponhortuloru)是我國(guó)僅存梅花鹿三個(gè)亞種之一,種群數(shù)量相對(duì)較大。主要分布于我國(guó)吉林省、黑龍江以及俄羅斯濱海邊疆區(qū)連片的廣大地區(qū)。然而東北梅花鹿的空間分布十分不均勻。在我國(guó),東北梅花鹿種群密度最高的地區(qū)為吉林省琿春市境內(nèi)的中俄邊境線附近,而在其他大部分地區(qū)東北梅花鹿種群密度低[6]。梅花鹿作為食物鏈的初級(jí)消費(fèi)者,該物種對(duì)植物群落的結(jié)構(gòu)與功能具有很強(qiáng)的塑造作用[7]。此外,梅花鹿也是該地區(qū)旗艦物種東北虎(Pantheratigrisaltaica)、遠(yuǎn)東豹(Pantherapardusorientalis)主要獵物,大型有蹄類動(dòng)物的可獲得性與捕食者密度增加直接相關(guān)[8],因此梅花鹿對(duì)虎豹種群的分布與密度具有一定的限制作用。

本研究基于非損傷樣品對(duì)虎豹國(guó)家公園的梅花鹿進(jìn)行遺傳多樣性和空間遺傳格局分析,以期了解該種群現(xiàn)有遺傳多樣性水平以及影響其空間遺傳格局的環(huán)境因素和人為因素。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

本研究于2018年8月至2020年1月多次在東北虎豹國(guó)家公園東部的中俄邊境附近采集梅花鹿糞便樣品110份(圖1)。為了滿足本研究需要,本研究采取嵌套式采樣策略[9],即在大、中、小不同距離等級(jí)下確保采集到的一定數(shù)量的樣品。

圖1 梅花鹿糞便樣品分布圖Fig.1 Map of the sika deer fecal samples

糞便樣品采集時(shí)佩戴一次性聚乙烯手套(PE手套)或使用一次性筷子,為防止交叉污染,采樣工具用后即換。采集的樣品原則上僅采集新鮮的糞便。每堆糞便挑取5—8粒,裝入50ml離心管中,記錄全球定位系統(tǒng)(GPS)坐標(biāo),避光處理;為了更好保存糞便樣品中的DNA,需要對(duì)樣品盡快干燥處理:(1)倒入適量95%無(wú)水乙醇,液面高度以沒(méi)過(guò)管內(nèi)樣品為宜;(2)浸泡24h后將無(wú)水乙醇倒出,加入足量變色硅膠,加入無(wú)水乙醇或變色硅膠后,樣品可以常溫保存,否則應(yīng)當(dāng)?shù)蜏鼗蚶鋬霰４?(3)每隔一周檢查離心管內(nèi)硅膠的顏色,應(yīng)在硅膠完全變紅之前及時(shí)更換,多數(shù)樣品在更換1—3次即可保持硅膠不再變色。

樣品質(zhì)量信息的現(xiàn)場(chǎng)判斷較為重要,因?yàn)闃悠吩叫迈r,DNA降解越少,質(zhì)量較差的樣品往往導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。在野外可根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)判斷梅花鹿糞便樣品的新鮮程度:

a)分散程度。糞球不成堆分布的,形態(tài)大小明顯不同的幾堆糞便混雜在一起的,應(yīng)當(dāng)舍棄。

b)表面物理特征。新鮮糞便表面一般呈現(xiàn)黃色或深褐色,糞球形狀飽滿,表面光亮、黏滑,沒(méi)有裂紋,不長(zhǎng)霉。糞便在野外暴露一定時(shí)間后表面一般會(huì)變黑、變硬,表面出現(xiàn)裂紋,裂紋越多說(shuō)明在野外暴露時(shí)間越久。

c)軟硬程度。一般來(lái)說(shuō)糞便越軟越新鮮。

d)被枯枝落葉、積雪等覆蓋的一般不新鮮,可根據(jù)降雪時(shí)間判斷糞便質(zhì)量。

e)梅花鹿臥跡內(nèi)或1m范圍內(nèi)、撥雪取食痕跡附近一般可尋獲糞便,因此可根據(jù)臥痕、咬痕、足跡等新鮮程度判斷糞便新鮮程度。

f)冬季采集的糞便一般都能夠滿足樣品DNA提取和分型的需要,但是冬季采集時(shí)要注意不要采集表面開(kāi)裂、位于落葉層以下或與土壤黏連的糞便。

1.2 糞便基因組提取、個(gè)體鑒定

本研究使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (QIAamp)進(jìn)行糞便基因組提取。為確認(rèn)糞便樣品所屬物種,選用Riaz等[10]開(kāi)發(fā)的鹿科動(dòng)物通用引物12srRNA對(duì)糞便DNA進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下,F: TAG AAC AGG CTC CTC TAG;R: TTA GAT ACC CCA CTA TGC。PCR反應(yīng)體系為40μL:20μL 2×EasyTaq PCR SuperMix,0.8μL BSA,引物各0.8μL(10μMol),4μLDNA模板,加13.6μL超純水補(bǔ)足。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,51℃退火30s,72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。本研究測(cè)序和引物合成由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。測(cè)序結(jié)果質(zhì)量使用Codoncode Aligner 6.0.2進(jìn)行檢測(cè)。利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),設(shè)置匹配度100%,確定糞便樣品所屬物種。

1.3 微衛(wèi)星的篩選和分型

本研究根據(jù)過(guò)去使用率較高的有蹄類動(dòng)物微衛(wèi)星序列,篩選出9對(duì)穩(wěn)定擴(kuò)增且多態(tài)性較高的引物(表2)。擴(kuò)增體系:Takara Taq HS 0.5μL,10X PCR Buffer (Mg2+Plus) 2μL,dNTP Mixture 2μL,引物各0.5μL,BSA 1μL,DNA模板 3μL,加超純水至20μL。擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s,退火30s,72℃延伸1min,進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72℃終延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用ABI 3730測(cè)序儀測(cè)序。微衛(wèi)星數(shù)據(jù)的讀取和校正在Genemapper 4.0中完成。

表1 各種變量對(duì)梅花鹿種群遺傳格局影響的假設(shè)Table 1 Hypothesis of the influence of different variables on genetic pattern of sika deer population

表2 野生東北梅花鹿種群9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析Table 2 The analysis of 9 microsatellites locus in wild sika deer population

由于糞便DNA質(zhì)量差,等位基因容易丟失。為了避免這種現(xiàn)象,本研究采用多管擴(kuò)增法(multi-tube PCR)進(jìn)行個(gè)體基因型確定[11],基本方法如下:雜合子由至少兩次相同的分型結(jié)果確定,而純合子則由3次相同分型結(jié)果確定。每份樣品每個(gè)位點(diǎn)先進(jìn)行4次重復(fù)擴(kuò)增,判斷基因型結(jié)果;對(duì)仍然無(wú)法確定分型情況的樣品再進(jìn)行3次獨(dú)立擴(kuò)增,判斷基因型。此后仍無(wú)法確定基因型的樣品,則將該個(gè)體的該位點(diǎn)處理為缺失數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1遺傳多樣性

利用GIMLET 1.3.1[12]計(jì)算微衛(wèi)星位點(diǎn)的鑒別能力:同一性概率(PID)和同懷群同一性概率(PIDsibling);使用MICRO-CHECKER[13]檢查各微衛(wèi)星位點(diǎn)是否存在無(wú)效等位基因、等位基因丟失的現(xiàn)象。使用CERVUS和FSTAT 2.9.3.2[14]計(jì)算位點(diǎn)等位基因數(shù)量(Na)、有效等位基因數(shù)量(Ne)、觀測(cè)雜合度(HE)、期望雜合度(HO)、多態(tài)信息含量(PIC)等種群遺傳學(xué)指標(biāo);使用Genepop 3.4[15]檢查每個(gè)位點(diǎn)的哈溫平衡和連鎖平衡。

使用CERVUS[16]進(jìn)行個(gè)體鑒別。

1.4.2聚類分析

使用STRUCTURE 2.3.4[17]軟件對(duì)鑒定的所有梅花鹿個(gè)體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。計(jì)算過(guò)程采用混合祖先模型和等位基因關(guān)聯(lián)模型,開(kāi)始時(shí)的預(yù)迭代次數(shù)為105,馬爾可夫鏈蒙特卡羅迭代(MCMC)重復(fù)次數(shù)為104次,K值范圍定為K=1—6,對(duì)每個(gè)K進(jìn)行20次重復(fù)運(yùn)算。利用Structure Harvester最大似然值以及ΔK隨K值的變化,綜合判斷梅花鹿種群的最優(yōu)分組。

使用GenAlEx 6.5[18]對(duì)鑒定的所有梅花鹿個(gè)體做主坐標(biāo)分析。

1.4.3空間自相關(guān)分析

有限的擴(kuò)散能力常常導(dǎo)致種群在遺傳距離上具有顯著的空間自相關(guān)模式[19]。本研究首先使用MSA 4.05[20]軟件計(jì)算個(gè)體兩兩之間的遺傳距離,距離指標(biāo)為共有等位基因比例。個(gè)體間的地理距離,以及空間自相關(guān)檢驗(yàn)都在GenAIEx中進(jìn)行?？臻g自相關(guān)檢驗(yàn)的置換數(shù)設(shè)置為999次。

1.4.4空間變量對(duì)遺傳分化影響分析

本研究主要分析了海拔、坡度、坡向、地表起伏率(Surface Relief Ratio, SRR)、人類干擾5個(gè)變量對(duì)梅花鹿種群遺傳結(jié)構(gòu)的影響。這5個(gè)變量多被認(rèn)為與大中型哺乳動(dòng)物擴(kuò)散阻礙相關(guān)[21]。前四個(gè)變量來(lái)自于分辨率30m×30m的DEM 數(shù)據(jù)(http://www.usgs.gov/)。人類干擾使用道路、居民點(diǎn)圖層進(jìn)行模擬。

各種環(huán)境變量的阻力模型通過(guò)ArcGIS 10.1中的“空間分析工具”下的“重分類工具”建立。

(1)海拔:隨海拔升高溫度降低,因此海拔可能影響梅花鹿的食物可獲得性,對(duì)梅花鹿來(lái)說(shuō)可能存在一個(gè)最適海拔。本研究利用逆高斯方程模擬[22]海拔高度對(duì)擴(kuò)散的影響:

海拔高度分為9組,每組間距100m。Rmax為最大阻力值,分別設(shè)為2、10、100、500、1000。Eopt為梅花鹿擴(kuò)散最適海拔高度,分別設(shè)為200、300、400、500m。ESD分別設(shè)為50、100、200m?；谝陨?個(gè)參數(shù),建立60個(gè)海拔高度阻力模型。

(2)坡度:從運(yùn)動(dòng)時(shí)的能量消耗角度推測(cè),梅花鹿可能更傾向于利用較緩坡度。本研究用逆高斯方程模擬坡度對(duì)梅花鹿擴(kuò)散的阻礙作用:

坡度分為9組,每組間距7°。Rmax為最大阻力值,分別設(shè)為2、10、100、500、1000,θopt為梅花鹿擴(kuò)散最適坡度,分別設(shè)為5°、10°、15°、20°、30°,θSD分別設(shè)為2°、5°、10°?；谝陨?個(gè)參數(shù),建立75個(gè)坡度阻力模型。

(3)坡向:坡向不同,溫度、濕度等微生境不同,從而可能影響梅花鹿的生境選擇和擴(kuò)散通道的選擇。用熱負(fù)荷指標(biāo)函數(shù)模擬坡向?qū)γ坊沟臄U(kuò)散阻礙[22]:

坡向分為9組,8組為坡向組,一組為平面組(-1°)。坡向組每組范圍為45°,平面組賦值為Rmax/2,其他按上述函數(shù)進(jìn)行賦值。Rmax分別設(shè)為2、10、100、500、1000,θopt分別設(shè)為0°、45°、90°、135°、180°、225°、270°、315°。x設(shè)為0.5、2、10。基于以上3個(gè)參數(shù),建立坡向阻力模型120個(gè)。

(4)地表起伏率:地表復(fù)雜程度將影響梅花鹿運(yùn)動(dòng)時(shí)的能量消耗,地形復(fù)雜程度越高,梅花鹿擴(kuò)散時(shí)的能量消耗越大。SRR對(duì)動(dòng)物擴(kuò)散的阻力由以下函數(shù)進(jìn)行模擬[22]:

R=(SRRx)×Rmax+1

建立SRR阻力模型之前,首先下載Geomorphometry and Gradient Metrics 2.0工具(https://github.com/jeffreyevans/GradientMetrics),并使用ArcCatalog加載至工具箱中,然后打開(kāi)ArcMap,使用該工具中的Surface Relief Ratio工具對(duì)研究區(qū)域的DEM進(jìn)行重分類:分析窗口設(shè)置為“Circle”,半徑分別設(shè)置為2、10、25、50,分析單元為“Cell”。再對(duì)4個(gè)不同半徑的SRR柵格圖層分別進(jìn)行重分類,SRR值共分為10組,每組組距為0.1。Rmax分別設(shè)為2、10、100、500、1000,x分別為0.5、2、10。建立SRR阻力模型60個(gè)。

(5)建立人類干擾阻力模型6個(gè)。根據(jù)居民點(diǎn)、道路分布情況,首先在ArcMap中使用BufferWizard工具,對(duì)道路、村、鎮(zhèn)矢量分別設(shè)置1km、1.5km、3km緩沖區(qū);然后使用Union工具,將3個(gè)緩沖區(qū)圖層合并,在屬性表中新建一列,使用“Field calculator”將該列賦值為10,同時(shí)用同樣的方法將研究區(qū)矢量圖的該列賦值為1;再次使用Union工具將兩個(gè)圖層合并。最后使用“Circuitscape for Arcgis”工具,將矢量轉(zhuǎn)換為柵格格式。使用重分類功能,將不包含居民點(diǎn)和道路的柵格的阻力值設(shè)置為1,其他柵格的阻力值R分別設(shè)為2、10、100、250、500、1000。

(6)建立空間距離阻力模型1個(gè)。對(duì)DEM柵格進(jìn)行重分類,將所有柵格賦值為1,以便后續(xù)分析中排除空間自相關(guān)對(duì)遺傳距離的影響。

(7)利用生境適宜性模型建立15個(gè)阻力模型。首先使用MaxEnt 3.4.1[23]制作生境適宜性圖層,選取的變量為海拔、坡度、坡向、地表起伏率等4個(gè)環(huán)境變量以及與居民點(diǎn)距離、與省道距離2個(gè)人類干擾變量。這些變量數(shù)據(jù)來(lái)源及處理方法如上所述?？紤]到變量間可能存在相關(guān)性影響模型精度,先對(duì)所有變量因子做相關(guān)性分析,去除相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值大于0.75的變量。共計(jì)379個(gè)梅花鹿出現(xiàn)點(diǎn)數(shù)據(jù)來(lái)源于梅花鹿糞便樣品坐標(biāo)以及本實(shí)驗(yàn)室近幾年紅外相機(jī)數(shù)據(jù)。本研究選擇線性、二次方、乘積和多拐點(diǎn)閾值關(guān)系等4種運(yùn)算方法的綜合運(yùn)用;由于測(cè)試樣本比例對(duì)模型預(yù)測(cè)精度有一定影響,所以本研究首先以不同的測(cè)試樣本比例進(jìn)行模擬,每個(gè)比例重復(fù)10次,篩選出平均AUC最高(25%,0.861)的一個(gè)生境適宜性圖層。

隨后依據(jù)該模型建立15個(gè)阻力模型。由于該圖層取值范圍為H=0—1,值越大代表生境適宜性越高,所以根據(jù)以下方式進(jìn)行重分類:

R=(1-H)x×Rmax+1

生境適宜性值共分為10組,每組組距為0.1。Rmax分別設(shè)為2、10、100、500、1000,x分別為0.5、2、10。

阻力模型建立完成后,使用Circuitscape for ArcGIS工具生成各變量的不同模型的阻力矩陣。計(jì)算模式為成對(duì)的模式、連接附近8個(gè)柵格。

使用R包ecodist[24]進(jìn)行偏曼特爾檢驗(yàn),在排除空間自相關(guān)(IBD)的影響后,分析遺傳距離(GD)和景觀阻力(LR)的相關(guān)性。可表示為GD-LR|IBD,其中GD為遺傳距離,LR為景觀變量阻力,IBD為空間自相關(guān)。對(duì)任一景觀變量模型進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí),當(dāng)GD—LR|IBD的結(jié)果顯著,而GD—IBD|LR的結(jié)果不顯著時(shí),才認(rèn)定該模型能夠解釋個(gè)體間的遺傳變異模式[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 物種鑒定和微衛(wèi)星分型

使用12srRNA對(duì)110份糞便樣品進(jìn)行擴(kuò)增,其中101份樣品測(cè)序成功。通過(guò)基于局部比對(duì)算法的搜索工具(BLAST)分析,除了7份樣品為狍(Capreoluscapreolus)糞便外,其他94份樣品均為梅花鹿糞便樣品。利用Gimlet軟件計(jì)算發(fā)現(xiàn),這9對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)的聯(lián)合識(shí)別分辨率較高。PIDunbiased=7.892×10-10,PIDbiased=1.468×10-9,PIDsibling=3.663×10-4;通過(guò)Cervus軟件進(jìn)行個(gè)體鑒別,在成功擴(kuò)增的87份樣品中,鑒別出86個(gè)個(gè)體。在所使用的9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中,所有位點(diǎn)都符合遺傳連鎖平衡,RT1、RM188、BM6506顯著的偏離哈溫平衡,且可能存在無(wú)效等位基因。由于這三個(gè)位點(diǎn)在梅花鹿種群遺傳多樣性研究中廣泛使用,且RT1和RM188具有較高的等位基因數(shù)量和遺傳多樣性,為個(gè)體鑒定提供了更精準(zhǔn)的信息,本研究保留這三個(gè)位點(diǎn)。

2.2 種群遺傳多樣性

本研究所使用的9對(duì)微衛(wèi)星的等位基因數(shù)量在4—11之間,共擴(kuò)增出68個(gè)等位基因(表2)。平均每個(gè)位點(diǎn)有7.56個(gè)等位基因,其中RT1等位基因最多,有11個(gè)等位基因,BM6506位點(diǎn)等位基因最少,有4個(gè)等位基因。這9個(gè)梅花鹿微衛(wèi)星位點(diǎn)平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.683,除BM6506(PIC=0.410)之外,其余位點(diǎn)的多態(tài)信息含量都在0.631—0.798之間,由于PIC>0.5為高度多態(tài)性,0.25≤PIC≤0.5為中度多態(tài)性,因此,BM6506為中度多態(tài)性位點(diǎn),其余均為高度多態(tài)性位點(diǎn)。觀測(cè)雜合度位于0.346—0.886之間,平均觀測(cè)雜合度為0.689;期望雜合度位于0.472—0.842之間,平均期望雜合度為0.721。期望雜合度普遍高于觀測(cè)雜合度。

2.3 種群遺傳結(jié)構(gòu)

STRUCTURE得出聚類數(shù)量估計(jì)值。L(K)峰值出現(xiàn)在K=1(圖2),因此該地區(qū)梅花鹿最有可能的分群數(shù)量為K=1,當(dāng)K>1時(shí),種群中的個(gè)體被分到不同群的比例大致相當(dāng),說(shuō)明本研究的目標(biāo)種群棲息的景觀中不存在顯著的屏障效應(yīng)。

圖2 采用貝葉斯聚類分析方法得到的聚類數(shù)量估計(jì)值 Fig.2 Estimated number of clusters inferred using Bayesian clustering analysisL(K)的峰值出現(xiàn)在K=1處

主坐標(biāo)分析(PCoA)表明(圖3),所有樣品點(diǎn)未形成明顯的聚集分布。結(jié)合STRUCTURE和PCoA結(jié)果,推測(cè)該地區(qū)沒(méi)有明顯的遺傳分組,該種群處于哈溫平衡。

圖3 梅花鹿種群的主坐標(biāo)分析Fig.3 Principal Coordinates (PCoA) Analysis of the sika deer population圖中各點(diǎn)為本研究的全部樣品

Ta:退火溫度 Annealing temperature;N:樣本量 Sample Size;Na:等位基因數(shù)量 No. Alleles;Ne:有效等位基因數(shù)量 No. Effective Alleles;PIC:多態(tài)信息含量 Polymorphic Information Content;HO:觀測(cè)雜合度 Observed Heterozygosity;HE為期望雜合度 Expected Heterozygosity;*代表該位點(diǎn)偏離哈溫平衡并且存在無(wú)效等位基因

2.4 空間自相關(guān)分析

對(duì)該地區(qū)東北梅花鹿種群85km范圍內(nèi)的空間自相關(guān)分析表明,該地區(qū)的梅花鹿出現(xiàn)一定的空間結(jié)構(gòu)。在第一個(gè)(0—5km,r=0.017,P=0.003)、第二個(gè)(5—10km,r=-0.009,P=0.043)空間等級(jí)表現(xiàn)為顯著的空間自相關(guān)系數(shù)。在0—85km內(nèi)的所有距離等級(jí)內(nèi),r值有正有負(fù),呈現(xiàn)明顯的波動(dòng)格局(圖4)。

圖4 梅花鹿種群空間自相關(guān)分析Fig.4 Spatial autocorrelation analysis of sika deer population

對(duì)該地區(qū)東北梅花鹿種群10km范圍內(nèi)的空間自相關(guān)分析表明,該地區(qū)的梅花鹿出現(xiàn)一定的空間結(jié)構(gòu)。在第1個(gè)(0—1km,r=0.043,P=0.002)、第9個(gè)(8—9km,r=-0.030,P=0.039)、第10個(gè)(9—10km,r=-0.025,P=0.016)空間等級(jí)表現(xiàn)為顯著的空間自相關(guān)系數(shù)。在0—10km內(nèi)的所有距離等級(jí)內(nèi),r值有正有負(fù),呈現(xiàn)明顯的波動(dòng)格局(圖4)。

2.5 空間變量對(duì)遺傳分化影響分析

利用ArcGIS建立共計(jì)336個(gè)阻力模型,其中海拔阻力模型60個(gè),坡度阻力模型75個(gè),坡向阻力模型120個(gè),地表起伏率阻力模型60個(gè),人類干擾阻力模型6個(gè),生境適宜性阻力模型15個(gè)。

在所有336個(gè)模型中,依據(jù)海拔、坡向、地表起伏率、人類干擾假設(shè)建立的246個(gè)阻力模型與遺傳距離之間的關(guān)系并不顯著(P>0.05)。在依據(jù)坡度假設(shè)建構(gòu)的75個(gè)阻力模型中,只有1個(gè)模型與遺傳距離有顯著的正相關(guān)關(guān)系(P<0.05,表3),該模型同時(shí)也是在控制空間自相關(guān)影響后,在所有模型中與遺傳距離相關(guān)性最高(r=0.088)的模型。綜合所有變量的15個(gè)生境適宜性模型阻力模型與遺傳距離的關(guān)系也都不顯著。

表3 排除空間自相關(guān)影響后最佳阻力模型Table 3 Best resistance models when partialling out the effect of IBD

3 討論

3.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性是衡量生物種群健康程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn),虎豹國(guó)家公園梅花鹿種群每個(gè)位點(diǎn)平均有7.56個(gè)等位基因,平均觀測(cè)雜合度為0.689,平均期望雜合度為0.721。梅花鹿各地區(qū)亞種的遺傳多樣性已有許多報(bào)道(表4),劉鑫鑫[30]、王美楠[31]、朱明月[32]的目標(biāo)種群均為野生東北亞種,且采樣點(diǎn)與本研究采樣區(qū)域臨近,均位于東北虎豹國(guó)家公園內(nèi)或臨近區(qū)域。本研究期望雜合度數(shù)值略低于或等于以上三項(xiàng)研究。東北梅花鹿在琿春保護(hù)區(qū)、汪清保護(hù)區(qū)、黑龍江綏陽(yáng)老爺嶺保護(hù)區(qū)等地呈現(xiàn)連續(xù)分布的格局,該地區(qū)沒(méi)有阻礙梅花鹿擴(kuò)散的高速公路、大型山脈或大型河流。同時(shí),各項(xiàng)研究采樣時(shí)間也在5年之內(nèi),可認(rèn)為該地區(qū)梅花鹿種群沒(méi)有較大波動(dòng)。

表4 不同地區(qū)野生梅花鹿基于微衛(wèi)星的遺傳多樣性比較Table 4 Comparison of genetic diversity based on microsatellite of wild sika deer in different regions

通過(guò)與其他地區(qū)梅花鹿亞種對(duì)比發(fā)現(xiàn),東北梅花鹿期望雜合度普遍高于其他亞種(表4)。東北梅花鹿可能比其他地區(qū)梅花鹿亞種保存有更多的遺傳多樣性。

棲息地范圍以及生境質(zhì)量可能是影響梅花鹿遺傳多樣性的一個(gè)重要因素。我國(guó)境內(nèi)的野生東北梅花鹿種群靠近中俄邊境線,主要分布在東北虎豹國(guó)家公園東部地區(qū)。而在俄羅斯一側(cè)的濱海邊疆區(qū)(Primorsky Krai)存在著西南、中部、東南等3個(gè)相互聯(lián)系著的大型梅花鹿種群,其中,西南種群分布范圍位于中俄邊境附近[35]。經(jīng)粗略估計(jì),俄羅斯梅花鹿種群的分布面積約為中國(guó)境內(nèi)野生東北梅花鹿分布區(qū)的17倍。中國(guó)的梅花鹿種群很可能是俄羅斯一側(cè)梅花鹿的擴(kuò)散種群。同時(shí),俄羅斯濱海邊疆區(qū)人煙稀少,人類對(duì)生態(tài)環(huán)境的干擾較小,有利于梅花鹿種群的繁衍和擴(kuò)散。更大的分布面積和更小的人類干擾則意味著可以供養(yǎng)更大的梅花鹿種群,就可能會(huì)產(chǎn)生較高的遺傳多樣性。

在中國(guó)的其他梅花鹿分布區(qū),梅花鹿原有生境逐漸被人類擠占,棲息地破碎化不斷加劇。例如,梅花鹿四川亞種種群被限制在四川若爾蓋縣凍列、崇爾、熱爾、占哇、降扎5個(gè)地區(qū)[36];梅花鹿華南亞種種群分布區(qū)被分割為位于江西、安徽和浙江的桃紅嶺、天目山、黃袞山、大會(huì)山等多個(gè)相互隔離的區(qū)域內(nèi)[37]。

3.2 遺傳結(jié)構(gòu)及影響因素分析

通過(guò)分析該種群的遺傳結(jié)構(gòu)可知,本研究區(qū)梅花鹿種群沒(méi)有明顯的遺傳結(jié)構(gòu),這可以由研究區(qū)范圍內(nèi)的地理、水文、人類干擾情況所解釋。該地區(qū)不存在大型山脈、大型河流和高等級(jí)的道路,因此也沒(méi)有能夠影響梅花鹿擴(kuò)散的客觀障礙。在梅花鹿分布區(qū)內(nèi),雖然存在一些硬化道路,但在野外可經(jīng)常觀察到有鹿群穿越。此外,保護(hù)區(qū)內(nèi)的居民點(diǎn)規(guī)模較小,也不太可能影響梅花鹿擴(kuò)散。

對(duì)該地區(qū)東北梅花鹿種群10km范圍內(nèi)的空間自相關(guān)分析表明,在第1個(gè)(0—1km)、第9個(gè)(8—9km)、第10個(gè)(9—10km)空間等級(jí)表現(xiàn)為顯著的空間自相關(guān)系數(shù),而其他距離等級(jí)的個(gè)體之間沒(méi)有顯著的相關(guān)關(guān)系。這說(shuō)明遺傳相關(guān)性僅存在于臨近的個(gè)體之間。據(jù)此可推測(cè),該地區(qū)梅花鹿擴(kuò)散距離為1km左右。

利用GPS項(xiàng)圈方法,Kim等[38]得出韓國(guó)俗離山國(guó)家公園的梅花鹿的年度家域面積為(2.24±1.50)km2;Yu[39]在日本日光國(guó)立公園測(cè)得雄鹿夏季家域面積(1.93±0.51)km2,雌鹿夏季家域面積(1.12±0.57)km2;而Takafumi[40]發(fā)現(xiàn)日本釧路濕地的梅花鹿平均家域面積為(6.8±1.8)km2。有研究表明,梅花鹿家域面積隨著單位面積內(nèi)個(gè)體數(shù)量的增加而減小。雖然梅花鹿存在季節(jié)性遷徙現(xiàn)象,但是梅花鹿一般在生長(zhǎng)季又會(huì)遷回并利用原來(lái)的棲息地,具有較強(qiáng)的家域固定性[41],因此,梅花鹿在交配時(shí)可能也會(huì)選擇空間臨近的個(gè)體。本研究結(jié)果在一定程度上與前人研究相符。

在梅花鹿的棲息地,除空間距離以外,還有很多其他環(huán)境因素可潛在影響梅花鹿種群的遺傳模式。過(guò)去大量研究集中于梅花鹿的生境選擇偏好,而基本沒(méi)有研究探討環(huán)境因素對(duì)梅花鹿遺傳格局的影響。本研究中,只有坡度被證明與該地區(qū)梅花鹿種群遺傳多樣性的空間格局相關(guān)。對(duì)梅花鹿生境選擇和占域研究表明,梅花鹿傾向于利用坡度小于25°的區(qū)域[42],坡度平緩的區(qū)域,梅花鹿的占域率也相對(duì)較高[43]。這與梅花鹿生存策略相一致。梅花鹿傾向于在緩坡進(jìn)行求偶、交配等活動(dòng),為了節(jié)約能量,梅花鹿也傾向于從平緩地帶擴(kuò)散。

納入研究的其他幾個(gè)變量被認(rèn)為是影響動(dòng)物種群遺傳模式的潛在因素,如Ma等[21]發(fā)現(xiàn)地表起伏率和坡向影響了秦嶺大熊貓的遺傳格局;美洲旱獺的遺傳格局受到海拔、道路、樹(shù)木胸高直徑、植被覆蓋等因素的影響[44]。同時(shí),河流、坡向、水系等因素對(duì)美洲鼠兔種群的基因流造成顯著影響[22]。然而,當(dāng)棲息地高度連接或棲息地與非棲息地之間的阻力差異較小,即景觀結(jié)構(gòu)無(wú)法對(duì)基因流造成限制時(shí),往往無(wú)法檢測(cè)到景觀遺傳效應(yīng)[45]。

本研究雖然為每個(gè)變量構(gòu)建一系列不同的阻力模型,但仍然未能探明其余變量與梅花鹿遺傳格局的相關(guān)性。其他幾個(gè)環(huán)境變量對(duì)梅花鹿遺傳格局的影響可能受到遺傳取樣策略、景觀要素分布格局等因素的共同影響。由于國(guó)家公園西部梅花鹿分布較為稀少,糞便采集難度大,因此本研究未能將研究區(qū)向西拓展,未能將國(guó)家公園西部更大范圍、更為復(fù)雜的各種環(huán)境特征納入景觀遺傳學(xué)分析中,客觀限制了本研究的深度和廣度。Manel等[46]研究表明,樣本量的多少以及樣本的空間布局將極大地影響后續(xù)空間統(tǒng)計(jì)方法檢測(cè)模式的能力,非最佳采樣方案需要更高的樣本量。此外,有關(guān)模擬研究證明,一種景觀變量在棲息地和非棲息地間若存在較高的對(duì)比度,則對(duì)該變量對(duì)種群遺傳的影響的檢測(cè)將更容易[47],而本研究所在區(qū)域未見(jiàn)有明顯的邊界將梅花鹿種群相互分隔開(kāi)來(lái)。

遺傳位點(diǎn)取樣的偏差也可能引起檢驗(yàn)偏差。當(dāng)微衛(wèi)星位點(diǎn)存在無(wú)效等位基因時(shí),即在該位點(diǎn)存在不能成功擴(kuò)增的等位基因,一方面可能低估群體的遺傳多樣性,另一方面也容易使親緣關(guān)系分析結(jié)果產(chǎn)生偏差。盡管如此,本文的遺傳多樣性估計(jì)結(jié)果基本和文獻(xiàn)報(bào)道一致(表4)。因此,盡管少部分使用的微衛(wèi)星位點(diǎn)存在無(wú)效等位基因?qū)Y(jié)果存在影響,但這種影響是有限的。

若想進(jìn)一步驗(yàn)證梅花鹿的擴(kuò)散是否傾向于避開(kāi)陡坡或與其他變量相關(guān),研究可結(jié)合無(wú)線電項(xiàng)圈技術(shù)以及運(yùn)動(dòng)生理學(xué)相關(guān)研究,如將由項(xiàng)圈得到實(shí)際運(yùn)動(dòng)路徑與模型模擬路徑進(jìn)行比較分析,或從生理學(xué)角度探討穿越不同景觀要素時(shí)給動(dòng)物帶來(lái)的能量損耗。為進(jìn)一步研究東北虎豹國(guó)家公園各種環(huán)境變量對(duì)動(dòng)物遺傳格局的影響,可選擇旗艦物種東北虎、東北豹,或全域分布的狍、野豬等作為研究對(duì)象,可進(jìn)一步為野生動(dòng)物擴(kuò)散廊道設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為檢測(cè)大量遺傳標(biāo)記與環(huán)境變量之間的關(guān)聯(lián)提供技術(shù)支撐,景觀基因組學(xué)相關(guān)方法將彌補(bǔ)傳統(tǒng)景觀遺傳學(xué)方法的不足,可以更加高效和準(zhǔn)確地檢測(cè)動(dòng)物種群的微進(jìn)化格局。