穆棱林區(qū)野生東北馬鹿種群冬季食物組成模式與植物代謝產(chǎn)物的關系

王 琳,周良俊,魏楷麗,張明海,張瑋琪

東北林業(yè)大學野生動物與自然保護地學院 哈爾濱 150040

動物通過取食和消化食物獲得維持生命活動的營養(yǎng)物質(zhì)和能量。廣食性大型有蹄類動物的食物組成復雜,是各種營養(yǎng)、非營養(yǎng)物質(zhì)和生態(tài)因子綜合作用的結(jié)果[1—2]。植物中維持生命活動的蛋白質(zhì)、脂肪、可消化纖維素等營養(yǎng)物質(zhì),以及植物化學防御所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物即非營養(yǎng)物質(zhì)都是影響植食性動物食物組成模式的重要因素[3—4]。

植物次生代謝產(chǎn)物(PSMs)是由初生代謝產(chǎn)物在植物組織中通過一系列代謝途徑衍生而來的、非植物生長發(fā)育所必需的小分子化合物,是植物在長期生長進化過程中與環(huán)境相互作用的適應性結(jié)果[5—7]。根據(jù)代謝物的化學結(jié)構(gòu)及合成途徑主要可分為萜類、 酚類和含氮化合物[8—9],代謝物具有多種理化作用,被認為是防止植食性動物過度采食的防御機制,例如,某些次生代謝產(chǎn)物能夠降低植物適口性或抑制植食性動物的生理功能[10—11],從而影響種群內(nèi)不同個體,呈現(xiàn)出特定的食物組成模式。

東北馬鹿(Cervuselaphusxanthopygus)為國家II級重點保護動物,屬于典型的廣食性食草動物,在對次生代謝產(chǎn)物的處理方式上,與專性食草動物從生理上形成特定的生物轉(zhuǎn)化途徑不同[12],廣食性食草動物會通過調(diào)整食物單次攝入量、攝食時間間隔等方式改變?nèi)∈巢呗?以減少或避免采食過量有毒次生代謝產(chǎn)物[13—15]。分布于黑龍江穆棱紅豆杉自然保護區(qū)的野生東北馬鹿,冬季主要以木本植物嫩枝為食[16—17],而北方冬季低溫寒冷,食物可獲得性和質(zhì)量降低,營養(yǎng)限制嚴重,使動物處于食物缺乏的環(huán)境。為保證種群中多數(shù)個體達到營養(yǎng)需求,種群內(nèi)可能會形成某種食物組成模式。同時,植物中高含量代謝產(chǎn)物會直接影響動物對食物的利用,此時,動物對植物次生代謝產(chǎn)物的攝入與平衡在冬季便顯得尤為重要[18]。植物在不同生理時期能合成數(shù)百甚至上千種代謝物,以往在次生代謝產(chǎn)物和動物營養(yǎng)相關的研究中,主要關注單寧、黃酮等大類物質(zhì)總量對食草動物的影響[19—20],而植物中其他類別次生代謝產(chǎn)物,以及各物質(zhì)的相對含量如何影響廣食性食草動物食物組成模式的相關研究尚未得到充分關注。

鑒于此,本研究對分布于黑龍江穆棱林區(qū)野生東北馬鹿種群冬季食物組成進行研究,通過結(jié)合廣泛靶向代謝組技術[21],廣泛覆蓋馬鹿采食植物中所有次生代謝產(chǎn)物、并測定每種物質(zhì)的相對含量,揭示分布于黑龍江穆棱林區(qū)野生東北馬鹿種群內(nèi)的食物組成模式,以及次生代謝產(chǎn)物在不同植物類別下的差異情況,探討各類次生代謝產(chǎn)物與馬鹿種群中不同食物組成模式的關系,本研究將為植食性哺乳動物與植物相互作用關系的研究和植物化學防御理論的驗證與延伸提供基礎。

1 研究方法

1.1 研究地區(qū)

黑龍江穆棱國家級紅豆杉自然保護區(qū)(130°0′—130°28′E;43°49′—44°6′N) 位于黑龍江省南部牡丹江市境內(nèi), 總面積約356.48km2,保護區(qū)地貌以山地為主,呈條帶狀分布,海拔在500—900m之間,屬于典型的溫帶大陸性季風氣候,四季溫差較大,年平均氣溫約-2℃。林區(qū)內(nèi)植被主要是以紅松(Pinuskoraiensis)、東北紅豆杉(Taxuscuspidata)、紅皮云杉(Piceakoraiensis)、落葉松(Larixgmelinii)、白樺(Betulaplatyphylla)、紫椴(Tiliaamurensis)、山楊(Populusdavidiana)、蒙古櫟(Quercusmongolica)等為優(yōu)勢種的針闊混交林,同時也包括衛(wèi)矛屬、榛屬等豐富的灌叢資源。研究地區(qū)復雜的植被資源造就了野生動物種類的多樣性,代表動物除東北馬鹿外,還有東北虎(Pantheratigrisaltaica)、野豬(Susscrofa)、狍(Capreoluspygargus)、黃喉貂(Martesflavigula)、黑熊(Ursusthibetanus)、長尾林鸮 (Strixuralensis),狗獾(Melesleucurus)等[22]。

1.2 糞便和植物樣品采集與裝片制備

2020年11月,在黑龍江穆棱國家級東北紅豆杉保護區(qū)進行野外樣品采集,根據(jù)馬鹿分布及活動情況(馬鹿的日活動半徑為1.5—2.0km)[23],設計間隔為2km以上的不同采樣區(qū)域,在不同區(qū)域上尋找新鮮馬鹿足跡鏈,發(fā)現(xiàn)足跡鏈后,根據(jù)足跡周圍雪殼軟硬或松弛情況判斷其新鮮程度,越軟或雪被越松,表示足跡鏈新鮮。根據(jù)雪地足跡的步距及蹄印大小區(qū)別馬鹿與其他有蹄類動物,馬鹿足跡行距較寬,其蹄印相較于其他鹿科動更大,但后蹄瓣較小并呈圓形。沿新鮮足跡鏈進行反向跟蹤,通過非損傷性取樣方法采集糞樣,每堆糞便采集約30粒,當采集1—2堆時返回,尋找新的足跡鏈再跟蹤,使糞便樣本盡可能代表不同個體(圖1)。佩戴聚乙烯(PE)手套采集糞便并置于封口袋中,并將糞便樣品盡快帶回實驗室置于-20℃冰箱保存。

圖1 研究區(qū)域地理位置及采樣點示意圖Fig.1 Map of the study area and sampling sites

在跟蹤馬鹿足跡鏈時,以有啃食痕跡的植物為中心設置10m×10m樣方,采集樣方內(nèi)未被啃食過的植物枝條。采集木本植物時選擇2m以下當年生枝條的嫩莖,落葉和禾本科植物選擇雪被以上部分。將植物樣品分成兩部份,一份裝入牛皮紙袋中用于馬鹿食性分析實驗;另一份裝入離心管中,并用液氮處理,以淬滅植物次生代謝過程,后置于-80℃冰箱保存,用于植物次生代謝產(chǎn)物測定。

野外采集的動物糞便與植物樣本烘干至恒重,分別粉碎、研磨,再用10%的次氯酸鈉溶液浸泡,洗滌后制備裝片,具體樣品裝片制備及拍攝法參照周良俊等[24]。

1.3 植物次生代謝產(chǎn)物含量測定

根據(jù)食物組成的結(jié)果,且為了保證廣泛靶向代謝組測定代謝物的準確性,選擇啃食痕跡樣方內(nèi),存在3株及以上的部分植物樣本進行次生代謝產(chǎn)物的測定。將用液氮處理過的植物樣品進行真空冷凍干燥處理,并研磨成粉末狀,稱取100mg粉末溶于1.2mL 70%甲醇提取液中,進行6次渦旋振蕩,每次間隔30min,以提高提取率;然后置于4℃冰箱過夜后再離心10min,取上清液用0.22μm微孔濾膜進行過濾,并保存于進樣瓶中,后續(xù)的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測與分析委托邁維生物技術有限公司進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

采用頻率轉(zhuǎn)換法分析糞便顯微裝片,先獲得每個糞樣中每種植物可辨認角質(zhì)碎片出現(xiàn)頻率F,通過公式:F=100(1-e-Di)[25],計算出每種植物平均密度(Di),再通過相對密度(RD)=Di/∑Di(∑Di指各種植物可辨認角質(zhì)碎片之和)轉(zhuǎn)換為相對密度RD。通過k-means[26]對食物組成數(shù)據(jù)進行聚類,以分析東北馬鹿種群內(nèi)不同個體冬季食物組成的相似性及差異性。

基于自建數(shù)據(jù)庫(MWDB),根據(jù)二級譜信息對物質(zhì)進行定性;利用多反應監(jiān)測模式(MRM)對物質(zhì)進行定量。采用主成分分析(PCA)與層次聚類分析(HCA),判斷不同植物的次生代謝物相對含量差異及相似情況。根據(jù)多變量分析的正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)模型的重要性投影(VIP),同時結(jié)合單變量分析的差異倍數(shù)值(FC)篩選出不同比較組之間的差異代謝物。

將11種植物中次生代謝產(chǎn)物相對含量原始數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換后,與馬鹿對相應植物的采食頻率進行Spearman相關檢驗,分析各代謝物與馬鹿種群食物組成的關系。再通過Mantel test檢驗[27]進一步分析各代謝物相對含量差異對種群內(nèi)不同個體食物組成模式的影響。

2 結(jié)果

2.1 穆棱東北馬鹿冬季食物組成

2020年11月,于黑龍江穆棱國家級紅豆杉自然保護區(qū),共采集糞便樣品41份,通過鏡檢,辨認植物組織碎片12300個,發(fā)現(xiàn)在該時間段下穆棱野生東北馬鹿采食30種植物。其中,東北紅豆杉(18.08%)等針葉喬木占比18.80%;簇毛槭(Acerbarbinerve)(10.34%)、山楊(7.91%)、榆樹(Ulmuspumila)(7.39%)、白樺(6.73%)、蒙古櫟(6.49%)、紫椴(4.21%)等闊葉喬木共占55.12%;灌木植物占比18.56%,主要包括毛榛子(Corylusmandshurica)(10.73%)、瘤枝衛(wèi)矛(Euonymusverrucosus)(2.82%)、忍冬(Loniceramaackii)(2.18%)等。草本植物在馬鹿冬季食物組成中占7.44%,包括粗莖鱗毛蕨(Dryopteriscrassirhizoma)(4.02%)、木賊(Equisetumramosissimum)(3.07%)等(圖2)。其中臭冷杉(Abiesnephrolepis)占比過少,不足0.02%,因此并未在圖2中體現(xiàn)。穆棱東北馬鹿冬季食物組成以木本植物為主(占比92.48%),而對草本植物采食較少。

圖2 穆棱東北馬鹿冬季食物組成Fig.2 Food composition of red deer in Muling in winter

將41份馬鹿糞便樣本的食物組成數(shù)據(jù)進行聚類分析,結(jié)果顯示,樣本聚類分為三組,其中第1組東北紅豆杉的聚類均值最高為1.1895,包括14個樣本;毛榛子與簇毛槭分別在第2、3組中聚類均值最高,各為0.9901、1.0312,分別包括12與15個樣本;各組內(nèi)樣本食物組成相似,組間差異較大,表明三組馬鹿群體分別呈現(xiàn)出以東北紅豆杉,毛榛子和簇毛槭為主要食物的不同取食模式(圖3)。

圖3 東北馬鹿冬季食物組成k-means聚類圖Fig.3 K-means clustering of the food composition of the red deer in winterM1,2,3…41:馬鹿個體糞便樣本 Red deer faeces sample

2.2 植物次生代謝產(chǎn)物成分分析

根據(jù)馬鹿的食物組成,將11種符合次生代謝產(chǎn)物采樣測定條件的植物分為針葉喬木、落葉喬木、灌木。包括紅豆杉、簇毛槭、毛榛子,山楊,取食比例均大于5%;紫椴、瘤枝衛(wèi)矛、衛(wèi)矛(Euonymusalatus),取食比例大于1%但不足5%;以及取食比例小于1%的暴馬丁香(Syringareticulata)、赤楊(Alnusjaponica)、紅松、珍珠梅(Sorbariasorbifolia)。通過廣泛靶向代謝組學對11種植物中次生代謝產(chǎn)物相對含量進行分析,共鑒定出638種代謝物,可將其分為8個大類,包括酚酸類173種,黃酮類196種,生物堿22種,鞣質(zhì)29種,醌類物質(zhì)5種,木脂素和香豆素70種,萜類物質(zhì)111種,以及其他類別的物質(zhì)32種。

對植物樣品中次生代謝產(chǎn)物相對含量進行主成分分析(PCA),圖4中,PC1、PC2分別表示第一、二主成分,除落葉喬木山楊外,其他植物距離較近,說明物種間代謝物成分差異變化較小;而山楊與其他物種距離最遠,說明山楊與其他植物之間代謝成分存在較大差異。采用層次聚類分析(HCA)進一步分析代謝物的含量,對植物物種與代謝物相對含量分別聚類,結(jié)果顯示,東北紅豆杉與紅松兩種針葉喬木聚在一起,瘤枝衛(wèi)矛和衛(wèi)矛兩種同一科屬的灌木聚在一起,說明其代謝物表達模式一致性較高,相對含量較為相似;山楊與落葉喬木組內(nèi)其他植物相距較遠,這一結(jié)果與PCA得到的結(jié)果一致,說明山楊與其他植物代謝物成分存在較高異質(zhì)性;圖中顏色越深,表示代謝物相對含量越高(圖5)。

圖4 11種馬鹿采食植物中代謝物的主成分分析 Fig.4 Principal component analysis of metabolites in 11 species of red deer foraging plants

圖5 11種馬鹿采食植物中代謝物的層次聚類分析Fig.5 Hierarchical clustering analysis of metabolites in 11 species of red deer foraging plants

根據(jù)VIP值與差異倍數(shù)值結(jié)合,將不同類別植物進行兩兩比較,篩選不同比較組間的差異代謝物,結(jié)果表明,與針葉喬木相比,闊葉喬木與灌木分別具有187和208種差異代謝物,其中分別有89和120種代謝物下調(diào),表示這些代謝物在針葉喬木中相對含量較高;闊葉喬木與灌木之間也有208種差異代謝物,其中68種上調(diào),140種下調(diào),表示68種代謝物在灌木中相對含量較高,140種代謝物在闊葉喬木中相對含量較高(圖6)。

圖6 不同類別植物差異代謝物火山圖Fig.6 Volcanoes of differential metabolites of different plant classes上調(diào)下調(diào)后面的數(shù)字是代謝物的種數(shù),如68代表有68種代謝物上調(diào); 橫坐標中fold change(FC)表示某代謝物在兩組樣品中相對含量差異倍數(shù);log2FC表示差異倍數(shù)對數(shù)值進行標準化

2.3 植物次生代謝物相對含量與食物組成的關系

Spearman相關性檢驗結(jié)果表明,有25種代謝物與馬鹿種群對植物的取食頻率顯著相關,說明植物中代謝物相對含量會影響種群整體對植物的采食。相關系數(shù)絕對值越接近1,相關性越強,反之則越弱。25種與之具有相關關系的代謝物中,萜類物質(zhì)有14種(表1),占比56%,除斷馬錢子苷半縮醛內(nèi)酯這一物質(zhì)外,均與取食頻率呈現(xiàn)顯著的負相關,即代謝物在植物中的含量較高時,馬鹿對該植物的取食頻率越低。

表1 與馬鹿采食頻率有相關性的25種代謝物質(zhì)分類及其組間差異Table 1 Classification of 25 metabolites correlated with feeding frequency of red deer and their differences between groups

將不同馬鹿糞便樣本食物組成與植物次生代謝產(chǎn)物相對含量進行Mantel test分析,進一步分析代謝物含量對種群內(nèi)不同個體的影響。結(jié)果顯示,不同個體食物組成相關性與聚類結(jié)果相似,且部分代謝物與個體食物組成顯著相關(P<0.05)(圖7)。圖中三角陣位置為馬鹿群體間食物組成相關性熱圖,顏色越深表示彼此相關性越強,即具有類似的食物組成模式,如樣本M11—15,熱圖色塊顏色較深,彼此相關性較強,且在食物組成上均以東北紅豆杉為主要食物,這與k-means聚類結(jié)果一致,說明這部分馬鹿群體表現(xiàn)出以東北紅豆杉為主要食物的食物組成模式。圖中不同顏色連線表示各代謝物與不同個體食物組成的相關性情況,其中酚酸、木脂素、生物堿類物質(zhì)與馬鹿群體食物組成的相關性并不顯著(P≥0.05),說明這幾類物質(zhì)不是影響個體食物組成、造成馬鹿群體間食物組成模式差異的主要原因;而部分鞣質(zhì)(單寧)、黃酮、萜類物質(zhì)相對含量與不同群體的食物組成的相關性達到顯著水平(P<0.05),且這種相關性有一定的差異,其中黃酮類物質(zhì)與部分以東北紅豆杉為主要食物的馬鹿群體的食物組成顯著相關;而鞣質(zhì)、萜類物質(zhì)含量與部分以簇毛槭,毛榛子為主要食物的群體的食物組成顯著相關,說明上述代謝物性質(zhì)與含量的差異會影響個體的食物組成,從而造成種群內(nèi)呈現(xiàn)不同的食物組成模式。

3 討論

3.1 東北馬鹿冬季食物組成

冬季是馬鹿食物資源匱乏,食物質(zhì)量下降的時期,早期研究表明,食草動物在面臨食物資源水平下降時,會使其食性逐漸趨于泛化[28]。2020年冬季穆棱東北馬鹿取食30種植物,馬鹿對木本植物有較強的選擇性,占其食物組成90%以上,主要包括東北紅豆杉、簇毛槭、毛榛子、蒙古櫟、白樺、山楊等,與以往穆棱東北馬鹿冬季食物組成研究結(jié)果相似[14,29],這反映了馬鹿在冬季時期的主要食物種類較為穩(wěn)定。這種食物組成與保護區(qū)以針闊混交林為主的植被類型相符合。產(chǎn)生這種食物組成的原因,一方面,林區(qū)內(nèi)冬季積雪嚴重,草本植物被覆蓋,阻礙了動物對草本植物的利用,而毛榛子、簇毛槭、白樺等木本植物在林區(qū)內(nèi)可獲得性會相對較高;另一方面,林區(qū)內(nèi)狍、梅花鹿等植食性動物與馬鹿的食物組成有一定的重疊性[23,30],存在對有限食物資源的競爭,并且馬鹿屬于混飼者,具有更高的消化率,使其能夠靠采食纖維含量較高的木本植物滿足生存需求[31—32];同時,東北紅豆杉幼苗木質(zhì)化程度較低[13],并且冬季時期針葉樹種中粗蛋白、粗脂肪等營養(yǎng)成分相對較高,更容易滿足動物的營養(yǎng)需求[14,33—34],由此東北紅豆杉、毛榛子、簇毛槭等木本植物成為馬鹿冬季的主要食物。

3.2 植物次生代謝產(chǎn)物對東北馬鹿食物組成模式影響

植食性動物采食更多種類的食物,一方面為了維持正常生命活動以實現(xiàn)更好地營養(yǎng)平衡,另一方面稀釋食物成分中的一些有毒的次生代謝物質(zhì)[35]。有研究表明一些萜類物質(zhì)會抑制動物激素分泌、動物個體的生長以及消化道微生物的活力;另外,一些植物中的萜類物質(zhì)可能會具有刺激氣味,從而可阻止植食性動物的取食[36]。本研究檢測出的物質(zhì)中,2α-羥基熊果酸和2-羥基齊墩果酸均屬于三萜類化合物,是一種α-葡萄糖苷酶抑制劑,攝入過量會抑制體內(nèi)碳水化合物的分解,從而可能導致代謝問題[37],并且這兩種物質(zhì)在暴馬丁香和珍珠梅等灌木植物中相對含量較高,因此馬鹿可能會為避免過量攝入該物質(zhì)而減少對這兩種植物的取食,從而使其在食物組成中占比較低。

酚類化合物會與蛋白質(zhì)結(jié)合,降低酶活性,導致蛋白質(zhì)的可利用性降低,影響動物體的消化能力,但由于代謝物的理化性質(zhì)、濃度以及動物體對代謝物反應的不同,代謝物也可能會表現(xiàn)出對動物體生長發(fā)育的促進作用[38]。例如,鞣料云實素,鞣質(zhì)類物質(zhì),具有抗氧化、保護肝臟、抑制金黃色葡萄球菌等多種理化作用[39],這一物質(zhì)在簇毛槭、毛榛子中相對含量較高,同時這兩種植物在馬鹿食物組成中均占有較高比例(均大于10%),可見該物質(zhì)對馬鹿采食存在一定的正向作用。咖啡酸乙酯,一種天然酚酸類物質(zhì),具有調(diào)節(jié)腸道微生物群的組成,影響微生物活性,抗纖維化的能力[40];其相對含量在山楊中最高,由此可能促進馬鹿對山楊的采食,使其成為馬鹿冬季主要食物之一。此外,黃酮類物質(zhì)花旗松素-3′-O-葡萄糖苷和楊梅素-3-O-半乳糖苷-3′-O-鼠李糖苷具有一定的抗炎、抗自由基防止器官損傷的作用[41—42],并且兩種物質(zhì)在紫椴和山楊中含量較高,從而可能影響馬鹿對其的采食頻率。

本研究結(jié)合Mantel test分析,進一步明確了不同種類代謝物與種群內(nèi)形成的不同食物組成模式具有一定的相關性,其中鞣質(zhì)、萜類物質(zhì)主要影響以簇毛槭,毛榛子為主要食物的群體;黃酮類物質(zhì)對以東北紅豆杉、紫椴、山楊等為主要食物的食物組成模式的群體影響較大,由于各次生代謝產(chǎn)物理化性質(zhì)與含量的差異,會造成動物體消化及代謝等生理機能差異,并且種群中不同個體對食物信息的處理以及對次生代謝產(chǎn)物的接受程度也存在區(qū)別[43],基于這些個體差異,使種群內(nèi)不同個體面對外界環(huán)境干擾,可能會選擇在滿足自身營養(yǎng)需求的同時攝入更多對機體有益的物質(zhì)以抵御冬季極端天氣,從而導致種群內(nèi)呈現(xiàn)出不同的食物組成模式。

4 結(jié)論

研究結(jié)果顯示,冬季穆棱東北馬鹿種群內(nèi)呈現(xiàn)出不同的食物組成模式,分別以東北紅豆杉,簇毛槭,毛榛子為主要食物。馬鹿采食植物中除山楊外,各植物中代謝物成分含量差異變化較小;馬鹿食物中次生代謝物種類較多,其中25種代謝物與馬鹿采食頻率具有相關性,萜類物質(zhì)占比較大,多數(shù)與馬鹿采食頻率呈負相關關系,且大部分在灌木植物中含量較高。其中鞣質(zhì)類物質(zhì)主要影響以簇毛槭,毛榛子為主要食物的馬鹿群體,是使其在食物組成模式上與其他群體存在差異的原因之一;而黃酮類物質(zhì)對呈現(xiàn)以東北紅豆杉、紫椴等為主要食物的食物組成模式的馬鹿群體影響較大。綜上,馬鹿取食受多種因素影響,在不同成分作用下使種群呈現(xiàn)出不同的取食模式,以滿足冬季極端環(huán)境下的越冬需求。