整合素β4通過PI3K/AKT/mTOR促進(jìn)HCC增殖和遷移

唐小龍,曹念蝶,宋雪翼,邵倩倩

(安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院,安徽 淮南 232001)

肝癌是一種高致死性的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[1]。據(jù) 2020 年全球癌癥發(fā)病率、死亡率和患病率數(shù)據(jù)顯示,全球肝細(xì)胞癌排名第6,其相關(guān)死亡情況也是癌癥的常見原因[2]。雖然近年來對(duì)于肝癌治療的研究取得了一些進(jìn)展,但由于復(fù)雜的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,肝癌的治療仍然具有極大的挑戰(zhàn)性[3]。因此,尋找新的治療方法和藥物顯得至關(guān)重要。

整合素β4(integrin β4,ITGB4)是一種跨膜受體蛋白,它在多種惡性腫瘤中被過度表達(dá),包括肝癌[4-5]。有研究證明ITGB4可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和遷移,并且與肝癌的預(yù)后密切相關(guān)[6-7]。在肝癌中ITGB4的高表達(dá)水平與較差的預(yù)后相關(guān)聯(lián),其可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)附著和細(xì)胞周期進(jìn)程來促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。抑制ITGB4的表達(dá)能有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[8-9],說明ITGB4是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是一個(gè)廣泛存在于各種生物體中的重要信號(hào)通路,它參與了多種生物學(xué)過程的調(diào)控,包括細(xì)胞增殖、代謝和凋亡等[10-11]。在肝癌中,PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路也被發(fā)現(xiàn)與肝癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),抑制該信號(hào)通路可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[12-13]。新近研究顯示ITGB4可以通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖和遷移等生物學(xué)過程[14],但其在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中對(duì)增殖和遷移的調(diào)控以及機(jī)制仍然不明。

本研究旨在探討ITGB4在HCC進(jìn)展過程中的生物學(xué)效應(yīng)與機(jī)制,利用RNAi和過表達(dá)ITGB4的技術(shù),通過克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)等分析ITGB4對(duì)HCC增殖、遷移的影響,并通過Western blot探討ITGB4調(diào)控HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,以期更深入了解肝癌的發(fā)生發(fā)展,為肝癌的治療提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源和培養(yǎng)

HepG2和SK-HEP-1細(xì)胞系來自明金生物科技有限公司(上海)。Huh7細(xì)胞系來自上海青旗有限公司。所有細(xì)胞系均使用RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco,美國)進(jìn)行培養(yǎng),并添加了15%的胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。這些細(xì)胞系在37℃、保持5%CO2的條件下培養(yǎng),隔天換液1次,以確保細(xì)胞生長的良好狀態(tài)。

1.2 試劑和化學(xué)品

p-PI3Kp85(#4228)、t-PI3Kp85(#4292)、p-AKT(Ser473) (#4060)、t-AKT (#4691)、p-mTOR(Ser2448) (#2971)和t-mTOR(#2972)抗體和Integrin β4 (#14803) XP? Rabbit mAb以及BeyoClickTMEdU-594細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒主要購自Cell Signaling Technology (美國)和MCE生物有限公司(美國)。所有抗體在使用前用PBS按照一定比例稀釋。LV-ITGB4-shRNA1、2、3敲低ITGB4慢病毒來自吉滿生物科技(上海)有限公司;ADV-ITGB4過表達(dá)腺病毒載體來自通用生物(安徽)有限公司。

1.3 Western blot

用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞和組織的總蛋白,然后將蛋白與5×蛋白上樣緩沖液按4∶1的比例混合,在沸水中變性20min。定量樣品注入10% SDS-PAGE膠孔中進(jìn)行電泳,條件為80mV 30min的濃縮、80min的分離。電泳完成后,將膠內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,并在5%脫脂牛奶中室溫封閉3h。PVDF膜置入TBST溶液中清洗3次,每次10min。將PVDF膜放入一抗工作液中4℃孵育過夜,次日放入二抗工作液中,室溫孵育1h,TBST溶液中清洗3次。最后在PVDF膜上均勻涂上顯影液,經(jīng)顯影儀檢測(cè)和拍照。

1.4 細(xì)胞增殖分析

將1×105個(gè)細(xì)胞均勻種植在24孔板中,在37℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,棄培養(yǎng)液并注入500μL含有EdU-594(10μM)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2h后,用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min,0.3%Triton透化10min。根據(jù)試劑說明書加入配制好的500μL click反應(yīng)液避光孵育30min。用含3% BSA的PBS洗滌細(xì)胞3次后,DAPI染核10min,洗滌細(xì)胞3次后置熒光顯微鏡下檢測(cè)紅色熒光細(xì)胞核的比例,以評(píng)估細(xì)胞增殖活力。

1.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

將5×105個(gè)細(xì)胞均勻接種于12孔板中,使其生長至鋪滿底部。然后用10μL槍頭在每個(gè)孔中垂直劃3道相互平行的痕跡,吸棄培養(yǎng)液后換成無血清培養(yǎng)基,并在0h和48h置顯微鏡下采圖。使用Image J軟件測(cè)量痕跡大小,以評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。

1.6 Transwell檢測(cè)

用8μm孔徑的Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲分析。將無血清培養(yǎng)基(100μL)中的3×105細(xì)胞接種到Transwell的上室;同時(shí)在下室中添加含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基,總體積為 500μL;37℃培養(yǎng)48h后,去除膜上側(cè)未遷移的細(xì)胞;遷移的細(xì)胞用甲醇固定30min,結(jié)晶紫溶液染色,并在顯微鏡下觀察和拍照。通過計(jì)算3個(gè)隨機(jī)視野中的細(xì)胞數(shù)評(píng)估跨膜遷移的情況。

1.7 克隆形成能力分析

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞以1 000個(gè)細(xì)胞/孔水平接種于6孔板中,并在37℃下培養(yǎng)兩周。當(dāng)細(xì)胞形成肉眼可見的集落時(shí),用4%多聚甲醛固定15min,結(jié)晶紫染色30min后,拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞集落。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)都至少進(jìn)行了3次重復(fù),并且數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用未配對(duì)雙尾Student’s t檢驗(yàn)或單因素方差分析來衡量各數(shù)值之間的差異。P<0.05則認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有的分析都使用了SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。ImageJ 1.44P軟件用于免疫印跡的定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITGB4在HCC中高表達(dá)

應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示,ITGB4在不同腫瘤中均有一定水平的表達(dá),其中在肝細(xì)胞性肝癌(LIHC)中的表達(dá)水平比DLBC、KICH等其他類別的腫瘤表達(dá)量高(見圖1a)。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫分析,肝細(xì)胞性肝癌中ITGB4的表達(dá)量也顯著高于肝細(xì)胞性肝癌的癌旁組織,如圖1(b)所示。進(jìn)一步應(yīng)用Western blot分析發(fā)現(xiàn)ITGB4在HCC細(xì)胞株中的表達(dá)狀況,結(jié)果顯示HepG2細(xì)胞系中ITGB4水平低于Huh7和SK-HEP-1細(xì)胞系(P<0.01),但顯著高于正常肝細(xì)胞系L02 (見圖1c)。免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)Huh7細(xì)胞系中ITGB4水平高于HepG2細(xì)胞系,且ITGB4主要富集于肝癌細(xì)胞膜上,部分存在于胞核中(見圖1e)。為探討ITGB4在肝癌中的生物學(xué)效應(yīng),用ITGB4的3個(gè)不同基因序列敲低慢病毒載體轉(zhuǎn)入Huh7中,發(fā)現(xiàn)ITGB4-shRNA1轉(zhuǎn)染效率最好,因此應(yīng)用ITGB4敲低慢病毒(ITGB4-shRNA1)構(gòu)建了ITGB4敲低表達(dá)的肝癌細(xì)胞系Huh7ITGB4-(見圖1f)。再用ITGB4過表達(dá)腺病毒載體構(gòu)建了ITGB4高表達(dá)的肝癌細(xì)胞系HepG2ITGB4+,如圖1(h)所示。應(yīng)用ADV-ITGB4過表達(dá)腺病毒載體處理后,顯著上調(diào)了HepG2ITGB4+細(xì)胞中ITGB4水平,而構(gòu)建的Huh7ITGB4-中ITGB4的表達(dá)相對(duì)于親代Huh7則顯著下調(diào)(P<0.01)(見圖1i)。

2.2 ITGB4促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖

應(yīng)用EdU-594分析ITGB4對(duì)HCC細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的影響,結(jié)果如圖2(a)所示,與Huh7細(xì)胞相比,Huh7ITGB4-細(xì)胞中增殖指數(shù)陽性率顯著下降(P<0.01);而HepG2ITGB4+細(xì)胞相對(duì)于親代細(xì)胞HepG2,EdU標(biāo)記陽性率則顯著升高(見圖2c)。在克隆形成實(shí)驗(yàn)中,Huh7ITGB4-較Huh7克隆成團(tuán)率低,而HepG2ITGB4+細(xì)胞相比HepG2克隆形成率則顯著升高(P<0.01),結(jié)果如圖2(e)所示。這些結(jié)果說明ITGB4促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖。

2.3 ITGB4促進(jìn)HCC細(xì)胞遷移和侵襲

通過劃痕愈合和Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究ITGB4對(duì)HCC遷移和侵襲性能的影響,與Huh7細(xì)胞相比,Huh7ITGB4-細(xì)胞劃痕愈合性能顯著下降(P<0.01)(見圖3a)。而HepG2ITGB4+細(xì)胞劃痕愈合性能則比HepG2細(xì)胞顯著上調(diào)(P<0.01)(見圖3c)。同樣,在Transwell實(shí)驗(yàn)中HepG2ITGB4+細(xì)胞穿過Transwell的細(xì)胞率比HepG2細(xì)胞顯著增加(P<0.001);而Huh7ITGB4-細(xì)胞穿過Transwell的細(xì)胞占比顯著低于Huh7細(xì)胞(P<0.01)(見圖3e)。以上結(jié)果表明,ITGB4有利于促進(jìn)HCC細(xì)胞遷移和侵襲性能。

圖3 ITGB4促進(jìn)細(xì)胞遷移和增殖

2.4 ITGB4激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路

為了探究ITGB4介導(dǎo)HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)效應(yīng)的具體調(diào)控機(jī)制,通過Western blot檢測(cè)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的活化水平,結(jié)果如圖4所示,在Huh7和HepG2細(xì)胞中,下調(diào)ITGB4表達(dá)(Huh7ITGB4-)導(dǎo)致p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平顯著下調(diào)(P<0.01);而上調(diào)ITGB4表達(dá)(HepG2ITGB4+)導(dǎo)致p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平顯著增加(P<0.01)。這些結(jié)果表明ITGB4可能通過PI3K/AKT/mTOR介導(dǎo)HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)功能。

圖4 ITGB4可調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR通路的異常激活

2.5 抑制PI3K/AKT/mTOR通路下調(diào)HCC的增殖和遷移

為了探討ITGB4調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路活化水平的生物學(xué)效應(yīng),本研究比較了HepG2和HepG2ITGB4+細(xì)胞中PI3Kp85、AKT和mTOR的活化水平,結(jié)果如圖5(a)所示,ITGB4過表達(dá)導(dǎo)致p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平增加。進(jìn)一步應(yīng)用PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑(PKI-587)處理顯著抑制了HepG2ITGB4+細(xì)胞中的PI3Kp85、AKT和mTOR活化(P<0.01)。為了研究PKI-587對(duì)HCC增殖與遷移性能的影響,本文分別應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PKI-587對(duì)HepG2細(xì)胞增殖和遷移能力的抑制作用。如圖5(c)所示,在HepG2ITGB4+細(xì)胞中添加PKI-587能有效地抑制HepG2ITGB4+細(xì)胞增殖(P<0.01);如圖5(f)所示,劃痕愈合實(shí)驗(yàn)同樣證明添加PKI-587處理組顯著抑制了HepG2ITGB4+的遷移能力(P<0.01)。這些結(jié)果表明,ITGB4可以通過激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路上調(diào)HCC細(xì)胞的增殖性能和促進(jìn)HCC細(xì)胞的遷移。

圖5 PKI-587逆轉(zhuǎn)了ITGB4誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的增殖,遷移

3 討論

肝癌是一種高致死性的腫瘤,其發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多因素共同作用的過程。ITGB4作為一種跨膜糖蛋白受體可介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞基質(zhì)之間的粘附,并轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞生長的信號(hào)。本研究證實(shí)在肝癌細(xì)胞中ITGB4的表達(dá)量顯著高于正常肝細(xì)胞,且能通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)肝癌的進(jìn)展。

已有研究證實(shí),ITGB4在肺癌等多種癌癥中都表達(dá)上調(diào),然而ITGB4在肝癌組織中的表達(dá)狀況、具體功能和分子機(jī)制還不完全清楚[15]。有文獻(xiàn)表明,和其他腫瘤一樣,肝細(xì)胞癌中也存一定水平的ITGB4表達(dá)且顯著高于癌旁組織[16]。本研究證實(shí),相對(duì)于正常肝細(xì)胞,ITGB4在HCC的細(xì)胞系中存在不同程度的上調(diào)表達(dá)。而ITGB4在人肝癌細(xì)胞系Huh7和HCCLM3中高表達(dá),并且在這兩株細(xì)胞株中敲低ITGB4則會(huì)抑制HCC的遷移和侵襲[17]。不過也有研究表明相對(duì)于高侵襲性HCC細(xì)胞株(HLF,MHCC97L,MHCC97H,HCCLM3),ITGB4在低侵襲性Huh7細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)。但是也有文獻(xiàn)指出ITGB4在肝癌組織中高表達(dá),而在癌旁組織中低表達(dá)或不表達(dá)[18]。本研究比較的是ITGB4在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)量,結(jié)果顯示相對(duì)于正常肝細(xì)胞,ITGB4在肝癌細(xì)胞Huh7和HepG2中高表達(dá),且在Huh7細(xì)胞中的表達(dá)量高于HepG2細(xì)胞。此外,由于Huh7肝癌細(xì)胞在培養(yǎng)過程中具有較高的遺傳變異率,不同的代次可能有不同的表達(dá)模式,這也可能導(dǎo)致不同研究之間存在一定差異性。總而言之,眾多研究均已表明ITGB4在肝癌細(xì)胞中普遍存在,有可能在肝癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。其中已有文獻(xiàn)報(bào)道肝癌組織中的ITGB4水平高于癌旁組織,HCC細(xì)胞中的ITGB4水平高于正常肝細(xì)胞,并且ITGB4的表達(dá)與肝癌的分級(jí)和侵襲性呈正相關(guān)[19]。以上文獻(xiàn)報(bào)道為本研究結(jié)果提供了一定的支撐和驗(yàn)證,未來本課題組將在此研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步收集更多不同組織類型的臨床肝癌標(biāo)本,分析ITGB4的表達(dá)及其與患者預(yù)后相關(guān)指標(biāo)之間的關(guān)系,以探討ITGB4作為肝癌潛在治療靶點(diǎn)的價(jià)值。

細(xì)胞遷移、侵襲和增殖是肝癌惡性進(jìn)展的重要特征。ITGB4能與ECM基質(zhì)等成分結(jié)合,調(diào)節(jié)膠原酶等酶的活性,促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移[20]。本研究通過過表達(dá)/敲低ITGB4表達(dá)實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明下調(diào)ITGB4可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲;而上調(diào)ITGB4則增強(qiáng)了HepG2細(xì)胞的相關(guān)生物效應(yīng),說明ITGB4的表達(dá)可以促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)移和惡性進(jìn)展。ITGB4的高表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后不良相關(guān),同時(shí)ITGB4還可以通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[21],這些研究有力地證實(shí)了ITGB4在肝癌中的促進(jìn)作用。

PI3K/AKT/mTOR途徑是腫瘤細(xì)胞中最為重要的信號(hào)途徑之一,其異常激活參與了肝癌細(xì)胞的生長、遷移和抗凋亡等生物學(xué)過程[22]。本研究結(jié)果表明ITGB4上調(diào)PI3K/AKT/mTOR的激活,且AKT/mTOR信號(hào)通路的抑制劑(PKI-587)可以有效抑制ITGB4活化的PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,并逆轉(zhuǎn)了ITGB4介導(dǎo)的HCC增殖、遷移和侵襲;應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默ITGB4同樣可以有效地抑制HCC細(xì)胞中的PI3K/AKT/mTOR通路活化及其驅(qū)動(dòng)的HCC增殖、遷移和侵襲等生物效應(yīng),這些研究都支持了本文所述的PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在肝癌中的重要作用。顯然,深入探討ITGB4和PI3K/AKT/mTOR通路之間的相互作用,對(duì)治療和預(yù)防HCC的臨床應(yīng)用具有重要意義。

綜上可知,ITGB4至少部分參與介導(dǎo)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活,進(jìn)而參與調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖和遷移等生物學(xué)效應(yīng)。因此,干預(yù)ITGB4表達(dá)有望成為治療該癌癥的潛在靶點(diǎn)。未來需要進(jìn)一步開展相關(guān)實(shí)驗(yàn),以探究ITGB4在肝癌治療中的應(yīng)用價(jià)值,并尋找更加有效的干預(yù)策略。