小球藻對(duì)草魚生長(zhǎng)、免疫、消化酶活性和肌肉的影響

闕江龍,饒 毅,徐先棟,丁立云,章海鑫,張愛芳,李艷芳

( 1.江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所,江西 南昌 330039; 2.江西省水生生物保護(hù)救助中心,江西 南昌 330096 )

草魚(Ctenopharyngodonidella)因肉質(zhì)鮮美、生長(zhǎng)速度快、單位產(chǎn)量高、養(yǎng)殖成本低等優(yōu)勢(shì)備受養(yǎng)殖戶青睞,是我國(guó)最主要的養(yǎng)殖魚類。據(jù)《2021中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》統(tǒng)計(jì),2020年草魚產(chǎn)量達(dá)5.57×106t,是我國(guó)養(yǎng)殖量最大的淡水魚類[1]。

水產(chǎn)養(yǎng)殖中,飼料添加劑的應(yīng)用不僅可縮短養(yǎng)殖周期,還可以提高養(yǎng)殖動(dòng)物的生產(chǎn)水平和養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益[2]。為了解飼料添加劑對(duì)草魚的生長(zhǎng)作用,學(xué)者們?cè)陲暳现刑砑佑椭琜3]、生物素[4]、維生素[5]、植酸酶和蛋白酶[6]等,研究其對(duì)草魚生長(zhǎng)性能、肌肉品質(zhì)等影響,結(jié)果表明各飼料添加劑對(duì)草魚生長(zhǎng)均有一定的促進(jìn)作用。然而,在草魚飼料中添加小球藻(Chlorella)的研究尚未見報(bào)道。

小球藻為綠藻門單細(xì)胞小型藻類,細(xì)胞呈球形或橢球形,在自然界分布廣泛。小球藻有著很高的光合作用效率,生長(zhǎng)繁殖速度極快,是動(dòng)植物中唯一能在20 h增長(zhǎng)4倍的生物[7],因其體內(nèi)含有豐富的胡蘿卜素、多糖、脂類、微量元素、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和生物生長(zhǎng)因子等高價(jià)值的化合物[8-11],應(yīng)用價(jià)值非常高。目前,小球藻在水產(chǎn)飼料方面應(yīng)用廣泛,Mahmoud等[12-14]分別在尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosen-bergii)和黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)飼料中添加小球藻,發(fā)現(xiàn)適量添加小球藻對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)或消化酶活性等起到促進(jìn)作用。筆者通過在飼料中添加不同水平的小球藻,探討其對(duì)草魚生長(zhǎng)性能、非特異性免疫機(jī)能、消化酶活性及肌肉品質(zhì)的影響,旨在為開發(fā)適合草魚養(yǎng)殖的小球藻飼料提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚

試驗(yàn)于2020年10月在江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所養(yǎng)殖魚池進(jìn)行,試驗(yàn)魚為平均體質(zhì)量(105.92±2.79) g、體長(zhǎng)(18.46±0.57) cm、體格健壯、規(guī)格整齊的450尾6月齡草魚。

1.2 試驗(yàn)飼料及小球藻

試驗(yàn)所用小球藻購自深圳永晨實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)的破壁蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)粉,粗蛋白59.1%,粗脂肪13.4%,灰分5.59%。試驗(yàn)基礎(chǔ)飼料為自行配制,粗蛋白為28.7%,粗脂肪為7.6%(表1)。小球藻的添加量分別為0(對(duì)照組)、0.25%、0.50%、0.75%和1.00%,配制成5組試驗(yàn)飼料。飼料原料經(jīng)粉碎后過80目篩,按配比定量后混合均勻,加入適量的水揉勻,經(jīng)飼料加工機(jī)制成顆粒料,65 ℃烘干后貯存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料配方 %

表2 小球藻對(duì)草魚生長(zhǎng)的影響(n=30)

1.3 試驗(yàn)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所循環(huán)水系統(tǒng)中進(jìn)行。試驗(yàn)前,用2×10-5kg/L的高錳酸鉀對(duì)養(yǎng)殖用聚乙烯塑料圓桶(直徑80 cm)進(jìn)行消毒。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%食鹽溶液藥浴試驗(yàn)魚10 min,后將試驗(yàn)魚放入圓桶中暫養(yǎng)10 d,暫養(yǎng)期間每日投喂自行配制的基礎(chǔ)飼料2次(9:00和16:00)。試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)試驗(yàn)組,每組3桶,每桶放30尾試驗(yàn)魚。每組3個(gè)平行,每日9:00和16:00投喂。投喂量為草魚體質(zhì)量的3%,視攝食情況作調(diào)整。試驗(yàn)期間水溫24～26 ℃,24 h充氣,溶解氧質(zhì)量濃度7.0～8.0 mg/L,pH7.2～7.5。由室內(nèi)日光燈提供光照,每日光照10 h,飼養(yǎng)試驗(yàn)時(shí)間28 d。

1.4 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后,將試驗(yàn)魚饑餓處理24 h后撈出,稱量體質(zhì)量,計(jì)算質(zhì)量增加率(wWGR,%)、特定生長(zhǎng)率(RSG,%/d)和飼料系數(shù)(RFC)[15]。

wWGR=(mt-m0)/m0×100%

RSG=(lnmt-lnm0)/t×100%

RFC=mF/(mt-m0)

式中,m0為魚的初始總質(zhì)量(g),mt為魚的終末總質(zhì)量(g),t為試驗(yàn)天數(shù)(d),mF為飼料投喂量(g)。

1.5 非特異性免疫機(jī)能和消化酶活性測(cè)定

自每個(gè)平行隨機(jī)取6尾魚進(jìn)行尾靜脈采血,冰上解剖提取腸道,血清和腸道分別置于1.5 mL滅菌的離心管中,3000 r/min(離心半徑10 cm)離心2 min,制備血清樣品保存于-80 ℃冰箱中,腸道樣品于4 ℃保存。血清總蛋白含量使用日立7600-110型全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定。溶菌酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶、脂肪酶、胰蛋白酶、淀粉酶活性和總抗氧化能力采用南京建成生物工程研究所試劑盒檢測(cè),按說明書要求操作并計(jì)算。

1.6 肌肉氨基酸和脂肪酸測(cè)定

每組取3尾魚的背部?jī)蓚?cè)肌肉,冰上剪碎后混勻,存放于干冰中寄送至江西省分析測(cè)試中心,按GB/T 14965—1994的方法使用Biochrom 20型氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定氨基酸,按GB/T 5009.168—2003的方法使用Agilent 6890型氣相色譜儀測(cè)定脂肪酸[16]。

1.7 肌肉粗蛋白和粗脂肪測(cè)定

每組取3尾魚的背部?jī)蓚?cè)肌肉,冰上剪碎后混勻,采用凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)和索氏抽提法(GB 5009.6—2003)測(cè)定肌肉的粗蛋白和粗脂肪。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,并采用鄧肯多重比較檢驗(yàn)組間差異的顯著性,P<0.05即認(rèn)定為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小球藻對(duì)草魚生長(zhǎng)性能的影響

試驗(yàn)結(jié)束后,各組試驗(yàn)魚無死亡,成活率100%。在0.5%～1.0%添加組中,隨著飼料中小球藻添加量的增加,草魚的終末平均體質(zhì)量、質(zhì)量增加率和特定生長(zhǎng)率均逐漸上升,飼料系數(shù)逐漸下降,與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。當(dāng)添加量為0.75%時(shí),草魚的終末平均體質(zhì)量、質(zhì)量增加率和特定生長(zhǎng)率最高,顯著高于對(duì)照組(0)和0.25%、0.50%添加組(P<0.05),飼料系數(shù)最低,顯著低于對(duì)照組和0.25%、0.50%添加組(P<0.05)。當(dāng)小球藻添加量達(dá)到1.00%時(shí),草魚的終末平均體質(zhì)量、質(zhì)量增加率和特定生長(zhǎng)率又顯著下降,但仍顯著高于對(duì)照組,飼料系數(shù)雖然顯著上升,但顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2 小球藻對(duì)草魚血清非特異性免疫機(jī)能和抗氧化性能的影響

隨著小球藻添加量的增加,草魚血清的溶菌酶和堿性磷酸酶活性總體呈上升趨勢(shì),0.50%以上的添加組中溶菌酶活性與對(duì)照組差異顯著(P<0.05),0.75%和1.00%添加組的堿性磷酸酶活性顯著高于其他組(P<0.05)。各組間血清總蛋白含量差異不顯著(表3)。

在血清抗氧化性能方面,超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力隨著小球藻添加量的增加也呈上升趨勢(shì),0.50%、0.75%和1.00%添加組的超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力均顯著高于對(duì)照組和0.25%添加組,且3組間差異不顯著(表3)。

2.3 小球藻對(duì)草魚腸道消化酶活性的影響

0.25%添加組淀粉酶活性與對(duì)照組無顯著差異,但其他試驗(yàn)組皆顯著低于對(duì)照組(P<0.05);小球藻添加組胰蛋白酶活性顯著高于對(duì)照組,其中0.25%組最高,與其他各組差異顯著(P<0.05);各添加組脂肪酶活性高于對(duì)照組,0.25%、0.75%和1.00%添加組水平與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)(表4)。

表4 小球藻對(duì)草魚腸道消化酶活性的影響 U/g

2.4 小球藻對(duì)草魚肌肉成分和品質(zhì)的影響

各添加組草魚的肌肉粗蛋白、粗脂肪、灰分和水分與對(duì)照組均無顯著差異(表5)。在肌肉品質(zhì)方面,小球藻各添加組草魚的氨基酸組成與對(duì)照組也無顯著差異(表6)。1.00%添加組中,4種不飽和脂肪酸即亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸顯著高于對(duì)照組(P<0.05),分別比對(duì)照組高40.17%、21.20%、30.95%和46.70%,脂肪酸含量中,1.00%添加組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表7)。

表5 小球藻對(duì)草魚肌肉成分的影響 %

表6 小球藻對(duì)草魚肌肉氨基酸的影響 %

表7 小球藻對(duì)草魚肌肉不飽和脂肪酸的影響 %

3 討 論

3.1 小球藻對(duì)草魚生長(zhǎng)和成活的影響

添加組中試驗(yàn)魚未出現(xiàn)死亡,與對(duì)照組一致,成活率均為100%,表明添加小球藻對(duì)草魚的成活率無顯著影響。

小球藻富含蛋白質(zhì),營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)全面[10,17],可作為優(yōu)質(zhì)的添加劑應(yīng)用于動(dòng)物飼料中[18]。在飼料中加入一定量的小球藻,能增強(qiáng)仔豬對(duì)營(yíng)養(yǎng)的消化吸收,促進(jìn)生長(zhǎng)[19],可增加雞蛋中蛋黃色素含量,蛋殼變硬[20],肉雞的質(zhì)量增加率也會(huì)提高[21]。

水產(chǎn)飼料中,Bai等[22]在許氏平鲉(Sebastesschlegelii)飼料中添加0.5%的小球藻藻粉,發(fā)現(xiàn)其特定生長(zhǎng)率、蛋白質(zhì)效率明顯提高。張寶龍等[14]在飼料中添加0%～3.2%的小球藻后,黃顙魚質(zhì)量增加率、特定生長(zhǎng)率及蛋白質(zhì)效率最高,且餌料系數(shù)最低;崔青曼等[23]也證實(shí),飼料中添加小球藻能夠顯著促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)生長(zhǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)飼料中小球藻粉添加量達(dá)0.50%以上時(shí),草魚的質(zhì)量增加率、特定生長(zhǎng)率顯著高于對(duì)照組,飼料系數(shù)顯著降低,與上述研究結(jié)果相似。表明飼料中添加適量小球藻可提高草魚的生長(zhǎng)率。

本試驗(yàn)中,小球藻添加組表現(xiàn)出良好的促生長(zhǎng)效果,一方面可能是因?yàn)樾∏蛟搴^全面的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),蛋白質(zhì)中含有谷物類所缺乏的亮氨酸、精氨酸和賴氨酸[7],同時(shí),破壁小球藻的蛋白質(zhì)消化吸收率非常高(80%)[24]。飼料中添加小球藻,可解決植物蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值低,達(dá)到“氨基酸的互補(bǔ)作用”的目的,滿足草魚生長(zhǎng)要求。另一方面可能是小球藻所特有的促生長(zhǎng)因子能增強(qiáng)機(jī)體免疫力,降低飼料消耗[25-26],促進(jìn)草魚的健康生長(zhǎng)。

3.2 小球藻對(duì)草魚血清非特異性免疫機(jī)能和抗氧化性能的影響

魚體中溶菌酶和堿性磷酸酶是魚類非特異性免疫的主要組成因子,可通過其活性的高低衡量機(jī)體免疫狀態(tài)。溶菌酶是一類有溶菌活性的堿性蛋白,在水產(chǎn)動(dòng)物抵抗病原微生物感染中具有重要作用[27-28]。與溶菌酶一樣,堿性磷酸酶也是巨噬細(xì)胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ),它能形成水解酶體系,清除、破壞入侵的異物,在免疫中發(fā)揮重要作用[29]。Xu等[30]研究表明,小球藻添加于鯉(Cyprinuscarpio)的飼料中可提高其血清溶菌酶活性,溶菌酶活性隨小球藻添加量的增加而升高。崔青曼等[23]在飼料中添加1%小球藻,發(fā)現(xiàn)小球藻能夠顯著或極顯著提高凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)血淋巴中的溶菌酶和堿性磷酸酶的活性(P<0.05),明顯降低凡納濱對(duì)蝦的攻毒死亡率。本試驗(yàn)中,飼料中添加小球藻提高了草魚血清的溶菌酶和堿性磷酸酶活性,當(dāng)添加量達(dá)0.75%至1.00%時(shí),提升水平顯著(表3),表明飼料中添加小球藻能夠增強(qiáng)草魚的非特異性免疫機(jī)能。

超氧化物歧化酶是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶,廣泛存在于生物體的胞漿和線粒體基質(zhì)中,能清除機(jī)體新陳代謝中產(chǎn)生的有毒物質(zhì),也是機(jī)體內(nèi)部超氧自由基的清除因子[29-31]。Vijayavel等[32]研究表明,小球藻醇提物能提高小鼠超氧化物歧化酶活性和機(jī)體抗氧化能力。黃文慶等[15]對(duì)瓦氏黃顙魚(P.vachelli)研究也得到了相同結(jié)論。崔青曼等[23]在凡納濱對(duì)蝦飼料中添加小球藻,血清中超氧化物歧化酶活性和抗氧化能力隨添加水平的增加呈上升趨勢(shì)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,飼料中添加小球藻顯著提高了超氧化物歧化酶活性和機(jī)體抗氧化能力,與這些研究結(jié)果一致。

3.3 小球藻對(duì)草魚腸道消化酶活性的影響

魚類消化酶活性的高低能反映魚類對(duì)飼料消化利用的能力,消化酶活性越高,表明魚類的消化吸收能力越強(qiáng),飼養(yǎng)效果越好[33]。本試驗(yàn)中,添加組中草魚腸道脂肪酶和胰蛋白酶活性均高于對(duì)照組,小球藻添加量達(dá)0.50%時(shí),淀粉酶活性顯著低于對(duì)照組,說明此時(shí)脂肪和蛋白質(zhì)為草魚提供更多的能量,脂肪酶和胰蛋白酶活性升高,碳水化合物作為能量物質(zhì)的轉(zhuǎn)換相對(duì)減少,淀粉酶活性降低。

Radhakrishnan等[13]研究發(fā)現(xiàn),小球藻粉適量地替代飼料中魚粉可提高羅氏沼蝦消化道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性。而黃文慶等[15]研究結(jié)果表明,飼料中添加小球藻醇提物對(duì)瓦氏黃顙魚腸道內(nèi)消化酶活性均無顯著影響。本試驗(yàn)飼料中添加小球藻,草魚脂肪酶和胰蛋白酶活性升高,淀粉酶(除0.25%添加組)活性顯著減弱,與Radhakri-shnan等[13,15]研究結(jié)果存在差異性。這可能是因?yàn)轸~類消化酶不僅與其生活的水環(huán)境(溫度、鹽度、pH等)密切相關(guān)[34],而且還受其生理狀況及攝食餌料的影響[35]。小球藻對(duì)草魚消化酶活性的影響機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3.4 小球藻對(duì)草魚肌肉成分和品質(zhì)的影響

小球藻粉對(duì)魚體成分的影響存在差異。Kim等[36-37]研究發(fā)現(xiàn),飼料中添加小球藻粉可提高褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)機(jī)體粗蛋白質(zhì)含量,降低機(jī)體粗脂肪含量。而黃文慶等[15]研究表明,飼料中添加0.25%～2.00%小球藻醇提物,對(duì)瓦氏黃顙魚體成分中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分和水分含量均無顯著影響。本試驗(yàn)中,小球藻添加組中草魚的肌肉氨基酸含量與對(duì)照組無顯著差異,與黃文慶等[15]研究結(jié)果一致。魚體肌肉成分變化的不同,除魚品種間存在差異外,也可能與魚體的代謝方式及飼料蛋白源不同有關(guān)[38],本試驗(yàn)小球藻添加量最高為1.00%,與Kim等[36-37]的研究中小球藻粉添加量達(dá)4%不同,添加量不同可能是導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果存在差異的原因之一。

小球藻中含有豐富的不飽和脂肪酸,如以亞麻酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸為代表的ω-3高度不飽和脂肪酸[39],它們是磷脂生物膜、視覺和神經(jīng)系統(tǒng)等的結(jié)構(gòu)組分,具重要的生物功能[40-41],是人類和動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的必需脂肪酸[42]。魚體內(nèi)不能自行合成亞麻酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸,而是通過攝入餌料后富集在體內(nèi)聚集[16]。已有研究表明,投喂小球藻能增加輪蟲和鹵蟲(Artemia)體內(nèi)的二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的含量[7],張躍群等[43]研究證明,小球藻可以顯著提高鹵蟲幼體二十碳五烯酸含量。本試驗(yàn)中,1.00%添加組的草魚肌肉亞麻酸含量顯著高于對(duì)照組;二十碳五烯酸含量高于對(duì)照組,其中,1.00%添加組與對(duì)照組差異顯著;添加組(0.50%除外)二十二碳六烯酸含量顯著高于對(duì)照組。說明草魚飼料中添加小球藻能有效提高魚肉中高度不飽和脂肪酸含量。

4 結(jié) 論

飼料中添加小球藻對(duì)草魚的生長(zhǎng)性能、非特異性免疫機(jī)能、抗氧化能力和肌肉品質(zhì)均有提升促進(jìn)作用,以質(zhì)量增加率和飼料系數(shù)為評(píng)估指標(biāo),草魚飼料中小球藻適宜添加量為0.75%。