壽光設(shè)施番茄死棵病原真菌的分離及鑒定

程琳 李珊珊 武玉芬 李艷青 張海娟 魏美甜

摘? ? 要：為了明確壽光地區(qū)番茄死棵病害發(fā)生分布情況及其真菌病原菌種類，采用隨機(jī)調(diào)查的方法對壽光地區(qū) 8 個設(shè)施番茄產(chǎn)區(qū)進(jìn)行病害調(diào)查，并從死棵病株中分離純化菌株，通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和人工接種等方法對病原菌進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，壽光大部分設(shè)施番茄產(chǎn)區(qū)均有死棵病害發(fā)生，平均發(fā)病率為 13.3%。共分離獲得真菌菌株 249 株，鑒定出 2 種鐮刀菌，分別為尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌，其中尖孢鐮刀菌的分離頻率較高，屬于優(yōu)勢菌屬，又進(jìn)一步鑒定為尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐病?；?、番茄枯萎病生理小種1 和生理小種3。針對不同的病原菌，可以制定有效的策略，進(jìn)行針對性的病害防控，為設(shè)施番茄安全生產(chǎn)及抗病育種提供重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞：番茄死棵；尖孢鐮刀菌；病原菌鑒定；優(yōu)勢菌種

中圖分類號：S641.2+S626.5 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2023）09-07-09

Isolation and identification of pathogenic fungi from dead tomato plants in Shouguang facilities

CHENG Lin1， LI Shanshan2， WU Yufen1， LI Yanqing3， ZHANG Haijuan4， WEI Meitian5

（1. Shandong Shouguang Vegetable Seed Industry Group Co.Ltd.， Shouguang 262700， Shandong， China; 2. China Agricultural University， Beijing 100083， China; 3. Weifang University of Science & Technology， Shouguang 262700， Shandong， China; 4. Zibo Digital Agriculture Rural Development Center， Zibo 255020， Shandong， China; 5. Shandong Shouguang Vegetable Industry Group Co.Ltd.， Shouguang 262700， Shandong， China）

Abstract： In order to clarify the occurrence and distribution of tomato plant dead diseases in Shouguang area and the fungal pathogens， the random method was used to investigate the diseases in 8 facility tomato production fields in Shouguang area， and the strains were isolated and purified from the tomato plant dead . The pathogens were identified by morphology， molecular biology and artificial inoculation. The results showed that tomato plant dead occurred in most of the tomato production areas in Shouguang， with an average incidence rate of 13.3%. A total of 249 fungal strains were isolated and two species of Fusarium were identified， named F. oxysporum and Fusarium solium. Among them， F. oxysporum has a higher isolation frequency and belongs to the dominant genus. F. oxysporum was further identified as F. oxysporum tomato neck rot root rot specialization type， tomato fusarium wilt physiological race 1 and physiological race 3. To sum up， the fungal pathogens that cause tomato plants dead in Shouguang area are F. solanum， F. oxysporum tomato neck rot root rot specialization， Fusarium wilt physiological race 1 and physiological race 3， and there are pathogenic bacteria compound infection. According to different pathogenic bacteria， effective strategies can be formulated to carry out targeted disease prevention and control， which provides important basis for safe production and disease resistance breeding of tomato in facilities.

Key words： Dead tomato plant; F. oxysporum; Pathogen identification; Dominant strain

我國是世界上番茄種植面積最大、產(chǎn)量最高的國家[1]。山東省是我國番茄種植的主產(chǎn)區(qū)之一，壽光蔬菜種植面積近4萬hm2，其中設(shè)施番茄的栽培面積占壽光設(shè)施栽培面積的30%左右。近年來，隨著農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整、商業(yè)品種推廣單一、田間管理不當(dāng)以及氣候條件的影響，番茄死棵現(xiàn)象的發(fā)生及危害逐年加重，成為制約番茄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一[2-3]。

在引起番茄死棵的病害因素中，枯萎病和番茄頸腐根腐病是主要真菌病害。番茄枯萎病是由尖孢鐮刀菌番茄?；?FOL（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）侵染所引起的土傳病害。尖孢鐮刀菌的不同菌株對不同品種的番茄存在致病能力的差異，因此相關(guān)研究人員又將番茄枯萎病菌分為不同的生理小種，即生理小種 1、2、3[4-8]。番茄頸腐根腐?。?Fusarium crown and root rot， FCRR） 是由尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐病?；?FORL（ Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici ） 引起的一種與番茄枯萎病癥狀極為相似的真菌土傳病害。張斌等[9]對江蘇省分離獲得的茄病鐮刀菌進(jìn)行回接試驗(yàn)，32個茄病鐮刀菌菌株均能引起番茄植株產(chǎn)生根部腐爛、萎蔫等癥狀。周黎等[10]研究認(rèn)為引起新疆地區(qū)番茄根腐病的病原菌除了尖孢鐮刀菌，還有茄病鐮刀菌和串珠鐮刀菌。程琳[11]、李景富等[12]對山東番茄死棵病害進(jìn)行研究，經(jīng)鑒定認(rèn)為致病菌為尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐病?；汀埿愕萚13]對山東省6個地區(qū)的病原菌鑒定，發(fā)現(xiàn)壽光地區(qū)為番茄枯萎病生理小種3。

尖孢鐮刀菌分布廣、寄主多、侵染能力強(qiáng)，不同地區(qū)引起死棵病害的病原菌種類存在一定的差異，在實(shí)際的栽培過程中發(fā)病癥狀很難區(qū)分，因此加大了該病害的防治難度。為此，筆者的試驗(yàn)擬通過對壽光地區(qū)設(shè)施番茄死棵病害進(jìn)行調(diào)查，了解目前壽光地區(qū)設(shè)施番茄死棵病害的發(fā)病情況。同時分離番茄死棵真菌病害的病原物，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定和人工接種等方法確定病原菌種類，為今后壽光地區(qū)番茄死棵病害防治工作及番茄抗病育種提供一定的參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2021年5—12月在山東省壽光市寇家塢、田柳鎮(zhèn)、稻田鎮(zhèn)、古城番茄小鎮(zhèn)、野虎村、王家堯、化龍鎮(zhèn)、蔬菜小鎮(zhèn)等8個地方進(jìn)行，在種植番茄的溫室大棚中選取發(fā)生死棵病害的番茄植株96 株，包括大粉果系列、大紅果系列、草莓番茄系列和櫻桃番茄系列各24株。

致病性測定所用的番茄為山東壽光蔬菜種業(yè)集團(tuán)提供的黃金明珠，為黃色大果番茄，產(chǎn)自西安市航豐種業(yè)有限公司，對番茄枯萎病和番茄頸腐根腐病均為高感。

1.2 方法

1.2.1 番茄死棵病害的發(fā)生情況調(diào)查 對8個種植番茄的產(chǎn)區(qū)進(jìn)行病害隨機(jī)調(diào)查。調(diào)查方法為隨機(jī)取樣法，在每個地區(qū)隨機(jī)選取 3 個溫室大棚進(jìn)行田間調(diào)查，每個溫室大棚內(nèi)采取平行線取樣法，隨機(jī)選取 5～6 壟進(jìn)行番茄死棵病害的調(diào)查，并進(jìn)行病害發(fā)生率的統(tǒng)計(jì)。同時觀察病株的病癥并拍照及采集。發(fā)病率/% = 發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100。

1.2.2 病原菌的分離純化 采用組織分離法，用滅菌的剪刀剪取大小為0.5～1.0 cm2根部及根莖部的病健交界處組織，用75%酒精消毒后，放入PDA培養(yǎng)基中，然后放入27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～4 d后觀察其生長情況，并用單孢分離法進(jìn)行純化。

1.2.3 病原菌的鑒定 采用形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定及致病性測定3種方法對分離到的病原菌進(jìn)行鑒定。

（1）形態(tài)學(xué)觀察：依據(jù) Booth 分類系統(tǒng)[14]同時參考《常見鐮刀菌鑒定指南》[15]，觀察菌落的大小、形狀、顏色，以及分生孢子形態(tài)、大小等特征，對分離到的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

（2）分子生物學(xué)鑒定：采用真菌DNA快速提取試劑盒提取病原菌DNA，提取物于 -20 ℃保存。利用真菌rDNA 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物 ITS1/ITS4[16] 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物采用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。后將未純化的PCR產(chǎn)物送到華大基因青島分公司進(jìn)行正向測序，分離所得的菌株的rDNA-ITS序列運(yùn)用GenBank中的數(shù)據(jù)庫中Nucleotide BLAST進(jìn)行同源性比對分析，結(jié)合病原菌形態(tài)特征，判斷所分離菌株的種類，確定分類地位。參考Hirano和Arie[17]的方法，用3對特異性引物sp13f/r、sp23f/r、sprlf/r進(jìn)行尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐病?；图翱菸∩硇》N的鑒定。PCR反應(yīng)產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

（3）致病性測定：根據(jù)Koch氏法則進(jìn)行分離物的回接測定。每種致病菌中選取8個有代表性的菌株，用打孔器在分離純化培養(yǎng)后的菌落邊緣取直徑1 cm 菌餅3片，放入裝有 150 mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，在150 r·min-1、27 °C下?lián)u2～3 d后用4層紗布過濾，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，用無菌水配制成孢子濃度為1×107 CFU·mL-1的孢子懸浮液。

采用浸根法接種。待番茄長到2～3葉1心時，將番茄苗連根拔起，用自來水沖去根部土粒，然后用無菌的小刀將主根根基部切一個小傷口，在已配好的孢子懸浮液中浸泡15 min后，轉(zhuǎn)移到裝有無菌土的營養(yǎng)缽中定植，放入溫度為25～30 °C的溫室中培養(yǎng)。每個菌株3個重復(fù)，每個重復(fù)10個處理，以清水作為對照，15 d后統(tǒng)計(jì)其發(fā)病情況。病情指數(shù)=Σ（病級株數(shù)×各病級數(shù)值）/（總株數(shù)×最高級別）。病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 DPS（9.01）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間發(fā)病癥狀

發(fā)病初期可以觀察到整棵番茄植株的下部葉片首先出現(xiàn)變黃、萎蔫的現(xiàn)象（圖1-A），病株根莖部會產(chǎn)生深褐色的病斑，在空氣濕度大時會有比較淺的粉紅色的霉層產(chǎn)生（圖1-B），將植株的根莖部剖開，會發(fā)現(xiàn)維管束產(chǎn)生褐變，且出現(xiàn)髓部中空的現(xiàn)象（圖1-C）。

2.2 壽光地區(qū)設(shè)施番茄死棵病害發(fā)生與分布情況

調(diào)查結(jié)果見表2，壽光大部分番茄產(chǎn)區(qū)均有死棵病害發(fā)生，且分布比較廣泛，平均發(fā)病率為13.3%。其中以大粉果和草莓番茄系列品種發(fā)病最重，屬于高感品種。田柳鎮(zhèn)的平均發(fā)病率最高，為37.5%，單個棚內(nèi)的發(fā)病率最高可達(dá)57.1%。處于開花坐果期的野虎村和稻田鎮(zhèn)發(fā)病率較低，平均發(fā)病率低于0.5%。不同產(chǎn)區(qū)、同一產(chǎn)區(qū)不同棚室之間死棵病的發(fā)病率存在差異。

2.3 形態(tài)學(xué)觀察

病原菌分離后培養(yǎng)產(chǎn)生菌落的形態(tài)大致可分為4種類型，觀測結(jié)果如圖2所示。第Ⅰ種類型的菌株菌落初為粉紫色，菌絲茂密，呈絨毛狀，菌落背面帶有紫紅色色素；第Ⅱ種類型的菌株菌落初為白色，菌絲毛絨狀且茂密，略帶粉狀，菌落中心略有凸起，背面變?yōu)闇\紫色；第Ⅲ種類型的菌落初為淡粉色，菌絲與前兩種類型相比較稀疏，菌落中心也有略微的凸起，菌落背面中心呈現(xiàn)紫色；第Ⅳ種類型的菌落白色，呈圓形，菌絲絮狀致密，菌落背面中心呈現(xiàn)枯黃色。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ菌株初步鑒定為尖孢鐮刀菌，Ⅳ為茄病鐮刀菌。孢子菌絲和形態(tài)顯微觀察如圖3所示，尖孢鐮刀菌大型分生孢子紡錘形，有3～5個隔膜，3個的居多，大小為（27～47）μm ×（3～5）μm，無色細(xì)胞多；小型分生孢子卵形或長橢圓形，大?。?～12）μm ×（2.2～3.5）μm，無色，單孢；厚垣孢子圓形或橢圓形，單孢頂生或間生于菌絲之上，大小為（11.2～16.0）μm ×（9.5～11.3）μm。茄病鐮刀菌分生孢子呈典型的鐮刀狀，1～5層隔膜。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

2.4.1 分離病原菌的rDNA-ITS分子生物學(xué)鑒定 對所有分離得到的249株病原真菌DNA進(jìn)行rDNA-ITS區(qū)域特異性擴(kuò)增，將膠回收后測序，在NCBI中進(jìn)行序列比對，構(gòu)建進(jìn)化樹，其中稻田鎮(zhèn)分離的病原真菌凝膠電泳結(jié)果見圖4，序列同源性比對結(jié)果見表3，進(jìn)化樹構(gòu)建見圖5。結(jié)果顯示，249株病原真菌中有202株與尖孢鐮刀菌的同源性較高，其余的47株與茄病鐮刀菌有較高的同源性，且相似度均在97%以上。

2.4.2 尖孢鐮刀菌的特異性引物鑒定 對202個已經(jīng)鑒定為尖孢鐮刀菌的菌株進(jìn)行尖孢鐮刀菌的特異性引物 PCR 擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中稻田鎮(zhèn)部分樣品電泳檢測結(jié)果見圖6、圖7和圖8。結(jié)果表明，77株為尖孢鐮刀菌枯萎病生理小種1，111株為尖孢鐮刀菌枯萎病生理小種3，14株為尖孢鐮刀菌頸腐根腐病?；汀?/p>

2.5 山東壽光地區(qū)分離病原菌的種類及發(fā)生情況分布

對鑒定到的真菌病原菌的種類和分布分析見表4，發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌的分離頻率最高，屬于優(yōu)勢菌屬，不同地區(qū)引起死棵的病原和優(yōu)勢菌種不盡相同，同一地區(qū)存在病原菌混合侵染的現(xiàn)象。8個產(chǎn)區(qū)中有6個產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢菌株都含有枯萎病生理小種1和生理小種3，其中王家堯和化龍鎮(zhèn)包含了4種菌種，但優(yōu)勢菌株存在較大差異，分別為茄病鐮刀菌和尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐病專化型。

2.6 分離病原菌的致病性鑒定

人工接種試驗(yàn)結(jié)果表明，尖孢鐮刀菌菌株具有致病性，只是同一類型的不同菌株之間致病力存在較大差異。依據(jù)柯赫氏法則，從接種發(fā)病番茄苗的病健交界處按照本文材料與方法中病原分離鑒定描述的方法重新分離、純化和鑒定，得到的尖孢鐮刀菌菌株與接種的尖孢鐮刀菌形態(tài)一致，證明所接菌株為番茄死棵病害的病原真菌。圖9顯示的是尖孢鐮刀菌的發(fā)病癥狀，主要表現(xiàn)為：葉片由下至上逐漸枯黃（圖9-B～D、G、H），莖基部有深褐色病斑（圖9-B～C），有的會出現(xiàn)溢縮，拔出病株，可見根部發(fā)育較差，須根較少，變?yōu)辄S褐色（圖9-C～D）。

2.6.1 尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐病專化型（FORL）人工接種鑒定 試驗(yàn)結(jié)果見表5，在尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐病專化型接種試驗(yàn)中，不同菌株的發(fā)病率和病情指數(shù)存在差異，其中發(fā)病率最高可達(dá)100%，分別為菌株H1GJ8-2 和H2-6-1，發(fā)病率最低為菌株H1-1-3，發(fā)病率為0。致病力最強(qiáng)的為H2-6-1，病情指數(shù)為85.83。

2.6.2 尖孢鐮刀菌番茄枯萎病生理小種1（fol-1）人工接種鑒定 試驗(yàn)結(jié)果見表6，在尖孢鐮刀菌番茄枯萎病生理小種1接種試驗(yàn)中，不同菌株的發(fā)病率和病情指數(shù)存在差異，其中發(fā)病率最高達(dá)到93.33%，有2個菌株，分別為H1GJ 2-11和K1-1，最低為菌株SC9GJ-1-31，發(fā)病率為50.00%，致病力最強(qiáng)的為W1GJ-3，發(fā)病率和病情指數(shù)分別為90.00%和70.00。

2.6.3 尖孢鐮刀菌番茄枯萎病生理小種3（fol-3）人工接種鑒定 試驗(yàn)結(jié)果見表7，尖孢鐮刀菌番茄枯萎病生理小種3接種試驗(yàn)中，不同菌株的發(fā)病率和病情指數(shù)存在差異，其中發(fā)病率最高的為菌株W1-1和K2-2，發(fā)病率為100%，病情指數(shù)最高的菌株為W1-1，病情指數(shù)為80.00。菌株W8-1的發(fā)病率和病情指數(shù)最低，分別為13.33%和3.33。

2.6.4 茄病鐮刀菌人工接種鑒定 試驗(yàn)結(jié)果見圖10，在茄病鐮刀菌的接種試驗(yàn)中，番茄植株生長正常，未見發(fā)病癥狀。

3 討論與結(jié)論

通過對壽光地區(qū)日光溫室種植的番茄死棵病害田間調(diào)查，發(fā)現(xiàn)壽光大部分番茄產(chǎn)區(qū)均有死棵病害發(fā)生。在引起番茄死棵的病害因素中，枯萎病和番茄頸腐根腐病是主要的真菌病害。

由于病原菌的種類繁多，個體多態(tài)性豐富，許多種的分生孢子形態(tài)相似，如果僅僅是通過形態(tài)觀察進(jìn)行鑒定，還很難能夠準(zhǔn)確地確定其種類。崔萍等[18]根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定和ITS序列同源性分析，準(zhǔn)確地將分離得到的鐮刀菌鑒定為尖孢鐮刀菌。劉暉[19]、鄭貴彬等[20]運(yùn)用特定品種鑒定生理小種，發(fā)現(xiàn)造成山東、西安枯萎病發(fā)生的病原菌均為生理小種1，但是由于品種存在特殊性，不能普遍適用。Chang等[21]對山西省17個地區(qū)的病原菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)同時存在生理小種1，2和3，其中生理小種1最普遍。筆者通過借鑒前人的研究，在形態(tài)觀察的基礎(chǔ)上，利用分子生物學(xué)手段對病原菌種類進(jìn)行鑒定，提高了番茄死棵病原真菌鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

張斌等[9]對江蘇省分離獲得的茄病鐮刀菌進(jìn)行回接試驗(yàn)，32個茄病鐮刀菌菌株均能引起番茄植株產(chǎn)生根部腐爛、萎蔫等癥狀。筆者在對分離菌株進(jìn)行人工接種鑒定時，發(fā)現(xiàn)接種茄病鐮刀菌的番茄未發(fā)病。筆者的研究結(jié)果與前人的相關(guān)報道并不相同，可能與病原菌種類、菌株致病力強(qiáng)弱、接種條件等密切相關(guān)，與此同時受時間限制和試驗(yàn)條件的影響，筆者的研究未能對分離出來的 47 個茄病鐮刀菌菌株全部進(jìn)行回接驗(yàn)證，關(guān)于茄病鐮刀菌的致病性還需要進(jìn)一步探究。

張秀等[13]對山東省6個地區(qū)的病原菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)壽光地區(qū)為番茄枯萎病生理小種3。筆者通過特異性引物對尖孢鐮刀菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)引起壽光地區(qū)番茄死棵的真菌病原菌為尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐病?；?，枯萎病生理小種1和生理小種3，而且存在病原菌復(fù)合侵染的情況。而在我國的黑龍江、河北、山西、湖北、四川等地，也有相關(guān)的病害研究及報道，說明采集時間及地點(diǎn)不同，在病原菌種類上會存在一定的差異。

綜上所述，壽光大部分番茄產(chǎn)區(qū)均有死棵病害發(fā)生，主要由茄病鐮刀菌、尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐病?；停菸∩硇》N1和生理小種3引起，而且存在病原菌復(fù)合侵染的情況。通過對壽光不同地區(qū)番茄死棵病害致病菌種類及優(yōu)勢種群的研究可以制定有效的策略，進(jìn)行針對性的病害防控，為優(yōu)質(zhì)番茄安全生產(chǎn)和抗病育種提供重要依據(jù)。

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