發(fā)酵蔬菜研究進展

趙杰，唐琴麗

賓川縣食品藥品檢驗檢測院（大理 671000）

以蔬菜為原料，經(jīng)酵母菌、乳酸菌或自然發(fā)酵方式發(fā)酵而成的蔬菜制品是世界范圍內(nèi)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一。發(fā)酵不僅可以有效保存蔬菜，也可以賦予蔬菜獨特風味及口感，加之其生產(chǎn)方便、成本低廉、原料豐富、促進消化等特點而深受消費者喜愛。但目前大多數(shù)發(fā)酵蔬菜仍以家庭作坊式生產(chǎn)為主，其潛在的食品安全問題亟待改善。目前，測序及發(fā)酵技術(shù)日趨成熟，為我們解析自然發(fā)酵蔬菜中的有益微生物并通過合成生態(tài)系統(tǒng)的方式達到可控的蔬菜發(fā)酵提供了技術(shù)支持。因此，本文主要從發(fā)酵蔬菜的消費、其食品安全及其微生物組成與風味形成等方面進行了概述與討論，以期為發(fā)酵蔬菜類食品檢測及開發(fā)更加安全、風味多樣的發(fā)酵蔬菜提供參考。

1 生產(chǎn)及消費

蔬菜發(fā)酵是利用有益微生物的作用，控制一定生產(chǎn)條件對蔬菜進行加工的一種方式。因其兼具保藏及改善風味的功能，蔬菜發(fā)酵技術(shù)被廣泛應(yīng)用于世界各地，也因地域、文化等差異，發(fā)酵蔬菜品類繁多，風味多樣。具有代表性的有德國酸菜、俄羅斯酸黃瓜、韓國泡菜及中國的四川泡菜、東北酸菜等。根據(jù)其工藝不同，發(fā)酵蔬菜有腌菜、酸菜、醬菜之分，但其均是不同程度地進行微生物發(fā)酵所得的發(fā)酵蔬菜類制品，生產(chǎn)方法包括自然發(fā)酵和接種發(fā)酵兩種。

我國有較長的發(fā)酵蔬菜食用歷史，截至目前，根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局統(tǒng)計，我國具備醬腌菜生產(chǎn)許可的企業(yè)有4 685家，醬腌菜總產(chǎn)量為405萬 t，總產(chǎn)值超過400億元。在眾多醬腌菜品種當中，榨菜產(chǎn)量最高，約占總產(chǎn)量的1/3。

2 發(fā)酵蔬菜食品安全

傳統(tǒng)腌泡菜等發(fā)酵蔬菜食品存在許多食品安全問題，如微生物致病菌、致病菌毒素、生物胺等。腌泡菜作為我國一種重要的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，多以家庭自制自食方式為主，在腌泡菜制作過程中由于原輔料及人為操作原因，極易產(chǎn)生亞硝酸鹽、生物胺等有害物質(zhì)及蠟樣芽胞桿菌、糞腸球菌等致病菌。

在我國，發(fā)酵蔬菜主要存在的質(zhì)量問題是食品添加劑（苯甲酸、山梨酸、二氧化硫、甜味劑、著色劑）及微生物（主要為大腸菌群）含量超標。近年來食品抽檢結(jié)果表明醬腌菜中存在防腐劑混合使用時各自用量占其最大使用量的比例之和，二氧化硫殘留量、苯甲酸、甜蜜素、糖精鈉、脫氫乙酸和鉛含量等不合格項，對醬腌菜食品安全具有較大的影響[1]。醬腌菜中常添加苯甲酸作為抗菌劑以延長產(chǎn)品貨架期，但過量的苯甲酸或擾亂人體的正常代謝，損壞肝臟，甚至造成癌癥。近年來大腸桿菌O157：H7及沙門氏菌等食源性病原菌都在酸性食品中（pH＜4.5）有檢出報道，因此，在發(fā)酵類蔬菜產(chǎn)品中，具有低感染劑量及較高酸耐受性的大腸桿菌O157：H7尤其需要注意[2]。

除了食品添加劑所帶來的安全風險外，發(fā)酵蔬菜原輔料中的乳酸菌、酵母菌、腸桿菌、葡萄球菌及假單胞菌等微生物通過參與發(fā)酵或在儲藏期感染等途徑進入，與游離氨基酸發(fā)生脫羧或醛酮的轉(zhuǎn)氨等反應(yīng)生成生物胺[3-4]，主要包括組胺、酪胺、色胺、腐胺、尸胺、亞精胺及精胺。生物胺是低分子質(zhì)量的有機堿，在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的生理作用，如胃酸分泌、體溫控制、細胞分化及生長、免疫反應(yīng)及大腦活動等。但較高的生物胺攝入量會引起頭疼、惡心、呼吸窘迫、嘔吐等癥狀，嚴重的可導(dǎo)致休克，甚至死亡[5]。目前，對于發(fā)酵蔬菜中組胺、酪胺、2-苯基乙胺及總生物胺的推薦限量值分別為100，100，30和100～200 mg/kg。據(jù)統(tǒng)計，83%的發(fā)酵蔬菜中都存在生物胺，韓國泡菜中組胺和腐胺的含量均大于100 mg/kg，我國東北、川渝、北京及臺灣等地區(qū)不同種類的發(fā)酵類蔬菜中均檢出不同種類的生物胺，且含量較高[6]。但通過添加益生菌菌株，如植物乳桿菌、干酪乳桿菌等可能降低發(fā)酵蔬菜中生物胺的形成。

發(fā)酵類蔬菜中亞硝酸鹽被認為對人體健康有害，因其與高鐵血紅蛋白血癥及一些胃腸道癌癥有關(guān)[7-8]。但研究表明，蔬菜在發(fā)酵初期，亞硝酸鹽濃度上升，當pH低于4.5時亞硝酸鹽濃度逐漸下降，直至穩(wěn)定[9-11]。根據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)看，我國各地區(qū)發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量一般都低于2.0 mg/100 g（以亞硝酸鈉計），符合我國國家食品標準GB 2762—2017《食品安全國家標準食品中污染物限量》規(guī)定，并低于世界衛(wèi)生組織建議的健康成年人每日攝入量[0.06 mg/（kg·d）]。另外，也有試驗結(jié)果表明人體中亞硝酸鹽具有降低心血管疾病、心肌梗塞、中風、胃潰瘍、腎衰竭及代謝綜合征等疾病風險的功能[8,12-15]，這說明成熟的發(fā)酵蔬菜中基本不存在亞硝酸鹽方面的食品安全問題。但需要注意的是，烹飪或保藏方法會顯著增加產(chǎn)品中硝酸鹽含量[16]，且發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)過程中鹽、糖、姜及蒜等成分，也可能通過影響發(fā)酵過程從而直接或間接地影響硝酸鹽及亞硝酸鹽含量[17]。除亞硝酸鹽外，發(fā)酵蔬菜中較高豐度的睪酮、二氫生物蝶呤、鳥苷及胞苷三磷酸鹽等代謝產(chǎn)物會顯著增加胃癌及結(jié)直腸癌風險[18-23]。

3 發(fā)酵蔬菜中微生物組成及風味物質(zhì)形成

3.1 發(fā)酵蔬菜中微生物組成

發(fā)酵蔬菜中有豐富的微生物多樣性，不同發(fā)酵蔬菜中微生物群落也不盡相同，但一般以厚壁菌門（Firmicutes）為主，其次為變形菌門（Proteobacteria）、藍細菌（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）及放線菌門（Actinobacteria）。其細菌組成以乳桿菌（Lactobacillus）及魏斯氏菌（Weissella）為主[24]，但在發(fā)酵過程中，其細菌組成往往是動態(tài)變化的，發(fā)酵前期及成熟后的發(fā)酵蔬菜中優(yōu)勢細菌組成與生產(chǎn)工藝及原輔料組成息息相關(guān)[25]。例如，在一些含鹽發(fā)酵蔬菜發(fā)酵初期細菌組成主要為嗜鹽細菌及乳酸菌，之后，乳桿菌及乳球菌相對豐度隨發(fā)酵時間增加，并最終成為其主要微生物組成，而有些醬腌菜在發(fā)酵初期的優(yōu)勢菌則為魏斯氏菌屬、弧菌屬及片球菌屬等，而發(fā)酵中后期則以乳桿菌屬和葡萄球菌屬等為主[26]。在發(fā)酵過程中添加大蒜則能有效促進發(fā)酵過程中乳酸菌及魏斯氏菌屬生長，而抑制好氧菌的生長[19]。此外，加工設(shè)備及人工操作等因素均會影響發(fā)酵蔬菜中的細菌多樣性及其組成與功能[27]。

除細菌外，發(fā)酵蔬菜中還含有多種真菌。子囊菌門（Ascomycota）是發(fā)酵蔬菜中最主要的真菌組成，其次為擔子菌門（Basidiomycota）及擬桿菌門（Phragmoplastophyta）。發(fā)酵蔬菜中真菌組成相對穩(wěn)定，大多數(shù)發(fā)酵蔬菜中酵母豐度較高，一般以畢赤酵母（Pichia）及有孢漢遜酵母（Hanseniasporan）為主[24]。

發(fā)酵蔬菜中微生物種類及數(shù)量受季節(jié)、成熟度、環(huán)境濕度、溫度及殺蟲劑使用等多種因素影響。在發(fā)酵過程中，微生物群落多樣性顯著下降，腸桿菌、乳酸菌及酵母等微生物在發(fā)酵體系中能存活幾天至幾周不等。乳酸菌因其能產(chǎn)生乳酸導(dǎo)致pH下降，且自身耐酸性較強，往往成為發(fā)酵蔬菜中的優(yōu)勢菌[2]。

3.2 發(fā)酵蔬菜中微生物對其風味形成影響

發(fā)酵蔬菜風味形成主要由參與發(fā)酵的微生物代謝產(chǎn)生的有機酸、游離氨基酸及揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成，這些成分與發(fā)酵蔬菜中微生物組成密切相關(guān)。一般來講，蔬菜發(fā)酵主要由乳酸菌主導(dǎo)，其將蔬菜中的糖轉(zhuǎn)化為乳酸或乙酸，使發(fā)酵系統(tǒng)中的pH逐漸降低。在此過程中，微生物組成也隨有機酸、游離脂肪酸及揮發(fā)性風味物質(zhì)產(chǎn)生、分解及轉(zhuǎn)化而變化。發(fā)酵蔬菜中有機酸（乳酸、乙酸）、游離氨基酸（丙氨酸、賴氨酸、谷氨酸）及揮發(fā)性物質(zhì)（醇類、酯類、醛類、酮類）含量相較于發(fā)酵初期顯著性增加[26]。Rao等[28]研究了傳統(tǒng)發(fā)酵蘿卜中微生物組成與風味間的關(guān)系，結(jié)果表明乳酸菌屬（Lactobacillus）豐度最高，腸桿菌科（Enterobacteriaceae）次之，前者與4種揮發(fā)性風味物質(zhì)、9種游離氨基酸及1種有機酸這14種風味物質(zhì)顯著相關(guān)，后者則與4種揮發(fā)性風味物質(zhì)、14種游離氨基酸及1種有機酸這19種風味物質(zhì)顯著相關(guān)。乳桿菌（Lactobacillus）及嗜鹽單胞菌（Halomonasspp.）等微生物豐度與有機酸、氨基酸、生物胺及揮發(fā)性物質(zhì)的濃度顯著相關(guān)[26]。連續(xù)發(fā)酵過程中，梭菌屬（Clostridium）、腸桿菌屬（Enterobacter）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）及腸膜明串珠菌（Leuconostoc）等微生物與腌菜中的醇、醛、酯類等揮發(fā)性成分呈正相關(guān)，而綠膿桿菌（Pseudomonas）、藍藻（Chloroplast）及根瘤菌（Rhizobium）等微生物則與這些揮發(fā)性成分呈負相關(guān)[29]。魏斯氏菌不僅能增加發(fā)酵蔬菜的風味，其產(chǎn)生的酸、醇等代謝產(chǎn)物還能有效抑制病原菌生長，從而保證食品的安全性[30]。發(fā)酵完成后，與發(fā)酵蔬菜風味顯著性正相關(guān)的嗜鹽細菌及乳酸菌的豐度最高，嗜鹽單胞菌、魏斯氏菌及乳酸菌等主要參與發(fā)酵蔬菜中丙酮酸代謝及三羧酸循環(huán)，使產(chǎn)品具有更高的乳酸及乙酸濃度，嗜鹽細菌及乳酸菌則是發(fā)酵蔬菜中氨基酸及脂肪代謝的主要參與者，并合成多種揮發(fā)性呈味物質(zhì)[31]。另外，酵母菌在厭氧條件下進行酒精發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇與有機酸反應(yīng)形成酯類物質(zhì)，對發(fā)酵蔬菜風味、質(zhì)地及產(chǎn)品儲藏周期等指標也有重要的影響作用[32-33]。

生產(chǎn)工藝及原輔料組成的差異對發(fā)酵蔬菜中微生物群落組成及風味形成至關(guān)重要[25]。例如，含鹽蔬菜發(fā)酵過程中，乳桿菌及乳球菌相對豐度隨發(fā)酵時間增加，最終成為其主要微生物組成。這使得發(fā)酵過程中葡萄糖消耗更加徹底，有機酸及醛醇類揮發(fā)性物質(zhì)含量更高[34-35]。添加大蒜則能有效促進發(fā)酵過程中乳酸菌及魏斯氏菌屬生長，同時抑制好氧菌等不良微生物的生長[19]。

4 應(yīng)用價值

作為全世界普遍消費的一種傳統(tǒng)食品，發(fā)酵蔬菜中不僅含有大量微生物、礦物質(zhì)及纖維素等營養(yǎng)物質(zhì)[36]，還含有活性肽、短鏈脂肪酸及γ-氨基丁酸等生物活性成分[37-38]。此外，莖根類發(fā)酵蔬菜中富含纖維，有利于改善消費者的適口性及消化能力[39]。

盡管發(fā)酵蔬菜中存在的多種微生物，但由于乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量乳酸及醋酸，使發(fā)酵蔬菜pH處于較低水平，最終形成以乳酸菌為主要優(yōu)勢菌群的微生物群落[40]。此外，其不僅能提升產(chǎn)品的感官質(zhì)量及延長貨架期，還具有提高消化能力、增加腸道微生物豐度及抗誘變活性、預(yù)防糖尿病、增強免疫力、防止細胞損傷及降低膽固醇等功效[32]。因此，發(fā)酵蔬菜在功能性食品開發(fā)及疾病診斷與治療等方面具有重要應(yīng)用價值。

近年來，從不同發(fā)酵蔬菜中分離出多種具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等共能的益生菌株。例如，Mizuno等[41]從腌菜中分離出一株植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）22 A-3，其能通過腸道表皮細胞影響與過敏相關(guān)的巨大細胞，從而達到抑制被動皮膚過敏反應(yīng)的耳水腫、降低卵白蛋白過敏小鼠血液中IgE及卵白蛋白特異性IgE水平、抑制由2, 4-二硝基氯苯（DNCB）誘導(dǎo)的皮炎等作用。Shankar等[42]從印度Sivakasi地區(qū)采集的酸菜中分離得到一株副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），其產(chǎn)生的胞外多糖具有76.34%的總抗氧化活性、71.15%還原力、68.65%過氧化氫清除活性及60.31% DPPH自由基清除活性，具有較好的抗氧化性應(yīng)用潛力。Xu等[43-44]從中國東北地區(qū)酸菜中分離出一株干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）NA-2，其產(chǎn)生的胞外多糖具有抗生物膜活性、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)活性。馬長路等[45]從自然發(fā)酵的傳統(tǒng)東北酸菜中分離獲得的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）MHS1701、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）MHS1703、棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）MHS1706的膽固醇脫除率分別達到40.71%，52.84%和41.41%。從四川泡菜中也分離出的一系列具有不同益生功能的乳酸菌，其中發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）CQPC04、CQPC05、CQPC08具有降脂、抗炎癥因子、改善機體免疫能力及增強機體抗氧化能力等功效[46-48]，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CQPC11可防治由D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化及衰老問題[49]。

從發(fā)酵蔬菜中分離的乳酸菌除具有醫(yī)療保健方面的作用外，其在工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵蔬菜方面也具有良好的應(yīng)用前景。異型發(fā)酵乳酸菌可將己糖（葡萄糖及乳糖）轉(zhuǎn)化為乳酸和乙酸，并產(chǎn)生一些其他風味物質(zhì)，使相應(yīng)的產(chǎn)品具有獨特的風味及益生功能。此外，乳酸菌也能產(chǎn)生多種酚類、細菌素及胞外多糖等化合物，這些物質(zhì)能顯著改善發(fā)酵蔬菜的質(zhì)地、口感及貨架期等特性[50-51]。例如，Lorn等[52]從200株乳酸菌中選出4株具有β-葡萄糖苷酶及乙醇脫氫酶活性的菌株發(fā)酵番茄，對發(fā)酵番茄中揮發(fā)性成分物質(zhì)檢測結(jié)果表明從不同菌株發(fā)酵的番茄中共檢測出58種揮發(fā)性物質(zhì)，未經(jīng)這4株菌株發(fā)酵的番茄中富含醛類物質(zhì)。添加植物乳桿菌發(fā)酵的番茄中富含酮類物質(zhì)，而發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵番茄則富含醇類物質(zhì)。發(fā)酵乳桿菌在發(fā)酵過程中展現(xiàn)出較高的乙醇脫氫酶活性，其發(fā)酵產(chǎn)品中醛、酮類物質(zhì)被醇類物質(zhì)取代，而植物乳桿菌則表現(xiàn)出較低的乙醇脫氫酶活性，但其具有重要的底物選擇多樣性。Le等[53]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌發(fā)酵芥菜可通過降低IL-6、TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶及環(huán)加氧酶-2的表達水平等方式顯著抑制一氧化氮產(chǎn)物，從而起到改善芥菜葉抗炎癥活性的作用。因此，相較于傳統(tǒng)的家庭作坊式生產(chǎn)方式，通過對發(fā)酵蔬菜中微生物組成的解析開發(fā)出具有不同風味及功能的發(fā)酵劑，其不僅有利于發(fā)酵蔬菜的工業(yè)化生產(chǎn)，在消除食品安全隱患方面也具有重要應(yīng)用價值。

5 結(jié)語

發(fā)酵作為一種傳統(tǒng)的加工技術(shù)，其被廣泛應(yīng)用于新鮮蔬菜的加工及儲藏。發(fā)酵過程中產(chǎn)生的獨特風味物質(zhì)賦予蔬菜獨特的口感、香味及質(zhì)地。但目前大多數(shù)發(fā)酵蔬菜的加工依舊停留在家庭作坊式生產(chǎn)中，其不僅具有不可預(yù)測性，還存在各種食品安全隱患。其中，微生物種類及數(shù)量是影響發(fā)酵蔬菜質(zhì)量最核心的部分。從目前的研究結(jié)果來看，由于發(fā)酵蔬菜中微生物組成受原輔料、溫度、地域等多種因素影響，因此不同發(fā)酵蔬菜中優(yōu)勢微生物及呈味微生物不盡相同，而目前在蔬菜發(fā)酵開發(fā)方面多以單一乳酸菌為主。其雖有利于發(fā)酵過程控制，但卻不利于產(chǎn)品的多元化發(fā)展，因此，根據(jù)不同發(fā)酵蔬菜品類以bottom-up策略開發(fā)不同蔬菜發(fā)酵劑是以后的研究方向。另外，由于發(fā)酵蔬菜中存在大量乳酸菌等具有特定功能的微生物，我們也能以此為出發(fā)點，篩選并開發(fā)具有特定功能的益生菌或其他具有抗菌、抗氧化等功能的菌株，實現(xiàn)資源的多樣化利用。