非小細(xì)胞肺癌中可變剪切基因及其作用的研究進(jìn)展

王瑩，張明暉

赤峰市醫(yī)院腫瘤內(nèi)三科，內(nèi)蒙古赤峰024000

肺癌是嚴(yán)重威脅我國(guó)居民健康的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年我國(guó)肺癌新發(fā)病例約82萬(wàn)例、死亡病例約72萬(wàn)例，其發(fā)病率和死亡率均居我國(guó)惡性腫瘤首位。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類型，占所有肺癌的80%～85%，根據(jù)病理學(xué)類型可分為腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌三個(gè)亞型［1］。NSCLC早期癥狀不典型，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期，5年生存率較低［2］。但目前NSCLC的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚?？勺兗羟惺侵敢粋€(gè)mRNA前體通過(guò)不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點(diǎn)）產(chǎn)生不同mRNA剪接異構(gòu)體的過(guò)程，主要包括可變啟動(dòng)子（AP）、可變終止子（AT）、外顯子跳躍（ES）、可變供體位點(diǎn)（AD）、可變受體位點(diǎn)（AA）、內(nèi)含子保留（RI）和外顯子互斥（ME）七種可變剪切事件［3］?？勺兗羟惺钦{(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的重要機(jī)制，也是真核生物轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性和多樣性的重要原因。以往研究報(bào)道，可變剪切基因異常幾乎與腫瘤細(xì)胞的所有特征表型有關(guān)，能夠參與包括NSCLC在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及治療耐藥［4］。本文結(jié)合文獻(xiàn)就可變剪切基因在NSCLC中作用的研究進(jìn)展作一綜述。

1.變剪切基因概述

可變剪切是指一個(gè)mRNA前體通過(guò)不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點(diǎn)）產(chǎn)生不同mRNA剪接異構(gòu)體的過(guò)程。mRNA從前體到成熟需要去除內(nèi)含子及連接外顯子，其中順式作用元件與反式作用因子相互作用，影響剪切位點(diǎn)，使得某些mRNA改變了原始閱讀框架，導(dǎo)致一個(gè)基因產(chǎn)生多種不同的異構(gòu)體，從而編碼不同結(jié)構(gòu)或功能的蛋白質(zhì)［5］。前體mRNA的可變剪切過(guò)程是多細(xì)胞生物中基因表達(dá)調(diào)控的普遍模式之一，涉及多序列基序與同源蛋白質(zhì)的相互作用，其錯(cuò)誤調(diào)節(jié)能夠影響細(xì)胞的增殖、凋亡以及血管生成和能量代謝等。可變剪切基因活性改變是惡性腫瘤中可變剪切失調(diào)的重要原因之一，特定基因的剪切變體可直接介導(dǎo)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，如BRCA1、p53等［6］。

可變剪切能夠使一個(gè)基因產(chǎn)生多個(gè)mRNA，最終產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。腫瘤細(xì)胞在可變剪切過(guò)程中具有腫瘤類型特異性及亞型特異性。有學(xué)者對(duì)包括肺癌在內(nèi)的32種不同腫瘤可變剪切基因分析發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)可變剪切基因只存在于腫瘤組織中［7］。一項(xiàng)生存分析發(fā)現(xiàn)，可變剪切事件與肺腺癌或肺鱗癌患者的總生存期顯著相關(guān)［8］。LIU等［9］研究報(bào)道，肺腺癌預(yù)后相關(guān)的可變剪切事件與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度、腫瘤突變負(fù)荷、免疫檢查點(diǎn)表達(dá)水平以及免疫應(yīng)答高度一致。以上研究表明，可變剪切在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。

2.SCLC中的可變剪切基因及其作用

目前，全基因組研究已公布了27種人類惡性腫瘤中超過(guò)15 000個(gè)可變剪切基因。在肺癌中的可變剪切基因主要包括B淋巴細(xì)胞瘤xL（Bcl-xL）、甘氨酸脫羧酶（GLDC）、RNA結(jié)合蛋白（RBM）、富絲氨酸/精氨酸的剪接因子（SRSF）、內(nèi)收蛋白3（ADD3）及酪氨酸激酶受體（MET）等，這些可變剪切基因能夠參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等一系列生物學(xué)行為［10］。本文重點(diǎn)介紹其中六種具有潛在臨床價(jià)值的可變剪切基因及其變體。

2.1.ET MET是一種原癌基因，定位于人染色體7q21-31，長(zhǎng)度約125 kb，含有21個(gè)外顯子。MET的主要突變類型包括14外顯子跳躍突變、基因擴(kuò)增、激酶域突變以及基因融合等［11］。其中，MET 14外顯子跳躍突變是近年來(lái)備受關(guān)注的突變類型。研究報(bào)道，MET 14外顯子跳躍突變可使含有E3泛素連接酶c-Cbl的近膜端結(jié)構(gòu)域缺失，MET蛋白泛素化降低，致使MET蛋白不斷積累，從而使MET信號(hào)通路持續(xù)激活，繼而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。MET的編碼蛋白具有酪氨酸激酶活性，是一種肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）酪氨酸激酶受體，被配體激活后可導(dǎo)致其下游信號(hào)通路的激活，如Ras/ERK/MAPK、PI3K/Akt、Wnt/β-catenin和STAT等信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲以及腫瘤血管生成［12］。在NSCLC患者中，MET 14外顯子跳躍突變的發(fā)生概率為1%～3%，多見(jiàn)于老年NSCLC患者，一般不與EGFR、ALK、ROS1等致病基因同時(shí)存在，但常與TP53突變、CDKN2A/B缺失以及MET、MDM2或CDK4/6擴(kuò)增共存。研究表明，MET 14外顯子跳躍突變的NSCLC可對(duì)MET酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）產(chǎn)生應(yīng)答，建議晚期NSCLC患者在二代基因測(cè)序中納入MET 14外顯子跳躍突變這一生物標(biāo)志物［13］。目前，靶向MET或HGF的藥物主要分為小分子TKIs和單克隆抗體。小分子TKIs又進(jìn)一步細(xì)分為多激酶MET抑制劑和選擇性MET抑制劑。多激酶MET抑制劑包括克唑替尼、卡博替尼、格列替尼、AMG208、奧曲替尼和戈伐替尼。選擇性MET抑制劑包括ATP競(jìng)爭(zhēng)性藥物卡馬替尼、特泊替尼以及非ATP競(jìng)爭(zhēng)性藥物替萬(wàn)替尼。單克隆抗體分為抗MET抗體奧那妥組單抗、依瑪妥珠單抗與抗HGF抗體非拉妥組單抗、利妥木單抗。這些靶向藥物在NSCLC治療中具有非常廣闊的應(yīng)用前景［14］。

2.2.LDC GLDC是一種與細(xì)胞代謝有關(guān)的致癌基因，定位于人染色體9p24.1。由人類GLDC編碼的P蛋白是甘氨酸裂解系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，能夠分解代謝甘氨酸生成5，10-亞甲基四氫葉酸，從而參與細(xì)胞甘氨酸代謝。GLDCV1是GLDC的可變剪切異構(gòu)體，其外顯子1的3'端49～448位點(diǎn)缺失400 bp。與GLDC全長(zhǎng)cDNA產(chǎn)物相比，GLDCV1在194位點(diǎn)丟失了原始ATG序列。GLDC全長(zhǎng)cDNA產(chǎn)物GLDCf1及其剪切變體GLDCV1過(guò)表達(dá)可促進(jìn)正常肺成纖維細(xì)胞p-ERK、p-p38、Cyclin D1表達(dá)，從而發(fā)揮促癌作用［15］。GLDC可通過(guò)外顯子跳躍方式來(lái)空間位阻反義寡核苷酸shAON，抑制NSCLC細(xì)胞GLDC過(guò)表達(dá)。在GLDC-shAON的腫瘤組織中，丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化水平顯著降低，丙酮酸脫氫酶和乳酸脫氫酶活性降低，細(xì)胞外酸化速率明顯受到抑制，順鉑的治療效果也隨之增強(qiáng)。這表明GLDC-shAON或可與常規(guī)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性［16］。在預(yù)后方面，GLDC過(guò)表達(dá)NSCLC患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是其低表達(dá)NSCLC患者的4倍。在與甘氨酸代謝有關(guān)的腫瘤中，應(yīng)用高毒性抗葉酸藥物甲氨蝶呤可能有效。聯(lián)合應(yīng)用抗葉酸藥物與GLDC表達(dá)抑制劑或?qū)ふ腋拾彼崃呀鈴?fù)合物特異性抗葉酸藥物，類似于在靶向治療中尋找激酶特異性抑制劑，或可成為更有效的靶向治療策略［17］。

2.3.BM RBM是一類RNA結(jié)合蛋白，包含RNA識(shí)別基序、RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核糖核蛋白基序，可參與RNA代謝，包括剪切、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯及其穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，RBM結(jié)合蛋白家族成員RBM異常表達(dá)和功能失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前，已知的RBM超過(guò)50種。本文著重介紹具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的RBM5和RBM10。

2.3.1.BM5 RBM5定位于人染色體3p21.3，是近年新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因。在超過(guò)90%小細(xì)胞肺癌（SCLC）和50%～80% NSCLC患者中可檢測(cè)到RBM5缺失。RBM5的前體mRNA發(fā)生可變剪切后產(chǎn)生至少三種蛋白質(zhì)編碼變體，至少一種反義非編碼RNA在RBM5內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)錄，激活線粒體細(xì)胞相關(guān)凋亡途徑，包括胱天蛋白酶2和細(xì)胞表面死亡受體Fas，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。RBM5蛋白可參與細(xì)胞凋亡過(guò)程，與促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表達(dá)下調(diào)有關(guān)。RBM5蛋白還能抑制細(xì)胞周期蛋白A表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期阻滯。此外，在順鉑耐藥的肺腺癌細(xì)胞中，RBM5蛋白還能增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性。因此，涉及RBM5的靶向治療策略有可能成為NSCLC的有效治療方法［18］。

2.3.2.BM10 RBM10定位于人X染色體p11.3，其轉(zhuǎn)錄體包含24個(gè)外顯子。RBM10蛋白含930個(gè)氨基酸，是一種腫瘤抑制因子，能夠降低Bcl-x的Bcl-xS亞型與Bcl-xL亞型比例，導(dǎo)致自身基因失活，減少EGFR抑制劑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而其缺乏是對(duì)EGFR抑制劑治療反應(yīng)不佳的標(biāo)志［19］。RBM10蛋白可結(jié)合353種長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA），與核富集豐度轉(zhuǎn)錄物1（Neat1）有4個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。RBM10蛋白主要位于Neat1的剪切異構(gòu)體Neat1_2上，而Neat1具有致癌作用。在RBM10蛋白過(guò)表達(dá)的NSCLC中，Neatl_1比例增加，Neatl_2比例降低，說(shuō)明RBM10蛋白通過(guò)可變剪切調(diào)節(jié)Neat1兩種可變剪切異構(gòu)體的平衡，并通過(guò)PTEN/PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路降低Neat1_2表達(dá)，抑制NSCLC細(xì)胞的侵襲和遷移［20］。此外，RBM10蛋白截短突變常見(jiàn)于EGFR L858R突變的NSCLC患者，這部分患者對(duì)EGFR抑制劑的敏感性降低，其臨床結(jié)局通常比EGFR exon19 del缺失的NSCLC患者差，并且腫瘤進(jìn)展率高［19］。

2.4.cl-xL 根據(jù)功能不同，Bcl-2家族蛋白可分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩種。其中，Bax為促凋亡蛋白，而B(niǎo)cl-2、Bcl-xL為抗凋亡蛋白。Bcl-xL可結(jié)合Bcl-2家族的促凋亡蛋白，如Bax、Bad，從而阻止促凋亡離子通道開(kāi)放，抑制凋亡信號(hào)激活。選擇性抑制Bcl-xL可提高多西他賽在NSCLC中的臨床療效，并且不會(huì)引起明顯的骨髓毒性。但是，由于Bcl-xL選擇性抑制劑的臨床療效有限，目前還沒(méi)有藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)。研究表明，無(wú)法進(jìn)入線粒體導(dǎo)致脫靶是Bcl-xL選擇性抑制劑A-1331852在實(shí)體瘤中療效不佳的重要原因。線粒體無(wú)毒小分子NA-2a通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白選擇性聚集在線粒體中，改變了線粒體膜的通透性，從而促進(jìn)A-1331852進(jìn)入線粒體并與其靶點(diǎn)結(jié)合，增加抗腫瘤活性。因此，NA-2a聯(lián)合A-1331852成為一種有前景的NSCLC治療選擇［21］。新型Bcl-2/Bcl-xL雙抑制劑APG1252-M與第三代EGFR抑制劑奧希替尼聯(lián)合使用，能夠誘導(dǎo)EGFR突變的NSCLC細(xì)胞凋亡，降低奧希替尼獲得性耐藥概率，有效抑制奧希替尼耐藥NSCLC細(xì)胞的增殖［22］。ABT263是一種可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的小分子Bcl-2抑制劑，能夠通過(guò)靶向Bcl-2/Bcl-xL改善常氧條件下放療對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用，克服體內(nèi)外暴露于急性或循環(huán)缺氧腫瘤細(xì)胞的放療抗性［23］。在高分化和中分化肺鱗癌中Bcl-xS表達(dá)顯著升高，其高表達(dá)與較高的總生存率顯著相關(guān)，是手術(shù)切除肺鱗癌患者預(yù)后良好的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素［24］。

2.5.RSF SRSF是一類富絲氨酸/精氨酸的剪切因子，具有相似的結(jié)構(gòu)域，即N末端的RNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域和C末端的富絲氨酸/精氨酸結(jié)構(gòu)域。本文著重介紹SRSF5、SRSF9兩種最具臨床價(jià)值的可變剪切體。

2.5.1.RSF5 SRSF5參與前體mRNA的可變剪切及翻譯過(guò)程，其編碼蛋白在多種腫瘤中異常表達(dá)。SRSF5蛋白在肺癌中表達(dá)上調(diào)，尤其是在SCLC中的表達(dá)顯著高于肺腺癌或肺鱗癌。SRSF5蛋白對(duì)NSCLC胸腔積液中惡性細(xì)胞的鑒別診斷價(jià)值較高，優(yōu)于臨床常用的腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原（CEA）。SRSF5蛋白還能檢出CEA假陰性中70%非NSCLC患者。這提示SRSF5蛋白或可作為一種檢測(cè)SCLC和胸膜轉(zhuǎn)移的新型標(biāo)志物［25］。

2.5.2.RSF9 SRSF9定位于人12號(hào)染色體，其編碼蛋白在腦、結(jié)腸、肺及皮膚等部位惡性腫瘤組織中高表達(dá)。在肺腺癌中，SRSF9蛋白高表達(dá)與腫瘤突變負(fù)荷及患者總生存期呈正相關(guān)關(guān)系，這為肺腺癌預(yù)后評(píng)估提供了新的思路；在肺鱗癌中，SRSF9蛋白表達(dá)與B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等六種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與腫瘤純度呈正相關(guān)關(guān)系，提示SRSF9可能通過(guò)免疫抑制作用影響肺鱗癌進(jìn)展。因此，SRSF9在NSCLC免疫治療和預(yù)后評(píng)估方面表現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)［26］。

2.6.DD3 細(xì)胞骨架基因在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移中起關(guān)鍵作用。Adducin屬于膜骨架蛋白家族，由ADD1、ADD2和ADD3編碼，分別映射至染色體三個(gè)不同位置，其中ADD3編碼蛋白對(duì)維持細(xì)胞骨架至關(guān)重要。ADD3定位于人染色體功能性腫瘤抑制區(qū)域10q25.1-25.2，其編碼蛋白除了作為細(xì)胞骨架蛋白外，還是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)變化與腫瘤惡性表型和臨床預(yù)后呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［27］。人類ADD3共有15個(gè)外顯子，其中外顯子14易發(fā)生可變剪切。QKI-5以位置依賴性方式與內(nèi)含子13的3'端多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，抑制ADD3外顯子14可變剪切，從而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。ADD3的總mRNA水平在腫瘤組織與正常組織之間相差無(wú)幾，但由于mRNA存在可變剪切這一特殊的加工方式，不同的外顯子進(jìn)行拼接產(chǎn)生不同的剪切產(chǎn)物。有研究報(bào)道，受腫瘤微環(huán)境的影響，ADD3外顯子14表達(dá)在肺癌組織中上調(diào)1.43～3.76倍，并且其表達(dá)與患者生存期和QKI mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［28］。在ADD3 16個(gè)外顯子中，外顯子15傾向于在NSCLC中表達(dá)，而在正常肺組織中不表達(dá)，在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌中亦有同樣趨勢(shì)，這表明ADD3特異性可變剪切體可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，或可作為一種新的腫瘤生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［29］。

綜上所述，可變剪切是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的重要機(jī)制，可變剪切基因異常幾乎與腫瘤細(xì)胞的所有特征表型有關(guān)，能夠參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及治療耐藥。在NSCLC中的可變剪切基因主要有MET、GLDC、RBM、Bcl-xL、SRSF、ADD3等，這些可變剪切基因能夠參與NSCLC細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等一系列生物學(xué)行為。近年在可變剪切領(lǐng)域的研究中取得了巨大進(jìn)展，很大程度上促進(jìn)了腫瘤靶向藥物的研發(fā)。但關(guān)于NSCLC預(yù)后標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)的潛在可變剪切基因還有很多，許多基于可變剪切的靶向治療還遠(yuǎn)未進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，仍需進(jìn)一步探索。