老年骨質(zhì)疏松性椎體骨折患者血清miR-15b和miR-122表達(dá)變化及其意義

陳明浩，李永全，馬金超

天津市泰達(dá)醫(yī)院骨科，天津300457

骨質(zhì)疏松性骨折是在骨質(zhì)疏松癥基礎(chǔ)上，由非暴力因素引起的一種脆性骨折。其中，椎體骨折是骨質(zhì)疏松性骨折中最常見的類型，在中老年人群中的發(fā)病率非常高。骨質(zhì)疏松性椎體骨折（OVF）可導(dǎo)致脊柱穩(wěn)定性降低，繼而引起下肢功能障礙，致殘率較高，嚴(yán)重影響老年患者的生活質(zhì)量［1］。目前，臨床通常使用抑制骨吸收藥物和促進(jìn)骨形成藥物來治療OVF，但療效一般。因此，提前預(yù)測(cè)老年OVF發(fā)生具有重要的臨床意義。微小RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，在細(xì)胞發(fā)育、分化及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用。miR-15b是miR-15/16家族中的一員，能夠參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生命活動(dòng)。近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b能夠參與調(diào)控骨形成和骨代謝過程，與骨骼疾病有一定相關(guān)性［2-4］。miR-122定位于人染色體18q21.31，是在肝臟生理和病理過程中發(fā)揮重要作用的特異性miRNA。有研究報(bào)道，miR-122還可參與骨形成和骨分化過程［5］。但目前miR-15b、miR-122與老年OVF的關(guān)系尚不完全清楚。本研究探討了老年OVF患者血清miR-15b、miR-122表達(dá)變化及其意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1.料與方法

1.1.床資料 選擇2019年2月—2022年2月天津市泰達(dá)醫(yī)院骨科收治的老年OVF患者93例（觀察組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合椎體骨折臨床表現(xiàn)，并經(jīng)X線、CT、MRI等影像學(xué)檢查證實(shí)［6］；②經(jīng)雙能X線骨密度儀檢測(cè)，符合骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；③年齡≥60歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)性O(shè)VF者；②合并其他脊柱疾病者；③合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重疾病者；④近1個(gè)月內(nèi)服用過影響骨代謝藥物者。同期選擇在天津市泰達(dá)醫(yī)院體檢健康的老年志愿者93例（對(duì)照組）。本研究經(jīng)天津市泰達(dá)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：1900136），所有研究對(duì)象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2.清miR-15b、miR-122表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。觀察組入院次日，對(duì)照組體檢當(dāng)日，采集清晨空腹外周靜脈血，離心留取血清，-80 ℃冰箱保存。采用TRIzol法提取血清總RNA，經(jīng)UPT-100紫外可見分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA純度和濃度合格。按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。以cDNA為模板，按ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：miR-15b上游引物5'-ATGAACTTTCTCTGTCTTGG-3'、下游引物5'-TCACCGCCTCGGCTTGCTCACA-3'，miR-122上游引物5'-AATACCAAGTCTGCGGCTTAAGC-3'、下游引物5'-ACCTCCGACCAAAAGATTCCT-3'，U6上游引物5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'、下游引物5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。PCR反應(yīng)體系共20 μL：cDNA模板2 μL，2 × SYBR Green Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，獲取循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.密度檢測(cè) 老年OVF患者入院次日采用EXA-3000雙能X線骨密度儀檢測(cè)腰椎、全髖關(guān)節(jié)和股骨頸的骨密度，計(jì)算腰椎、全髖關(guān)節(jié)和股骨頸三個(gè)部位骨密度的平均值。

1.4.計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，結(jié)果比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。診斷效能分析采用受試者工作特征（ROC）曲線，曲線下面積（AUC）比較采用Z檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.果

2.1.組一般資料比較 觀察組男51例、女42例，年齡（68.03 ± 4.74）歲，BMI（22.86 ± 2.85）kg/m2，合并高血壓53例，有吸煙史63例，骨密度（0.68 ±0.17）g/cm2；對(duì)照組男44例、女49例，年齡（68.81 ±5.42）歲，BMI（23.07 ± 2.11）kg/m2，合并高血壓46例，有吸煙史59例，骨密度（0.91 ± 0.23）g/cm2。兩組性別、年齡、BMI以及合并高血壓例數(shù)和吸煙史例數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2/t分別為1.054、1.045、0.571、1.058、0.381，P均＞0.05），觀察組骨密度低于對(duì)照組（t=7.755，P＜0.05）。

2.2.組血清miR-15b、miR-122表達(dá)比較 觀察組與對(duì)照組血清miR-15b相對(duì)表達(dá)量分別為0.82 ±0.22、1.03 ± 0.29，血清miR-122相對(duì)表達(dá)量分別為1.25 ± 0.39、1.02 ± 0.26。觀察組血清miR-15b相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，血清miR-122相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組（t分別為5.380、4.732，P均＜0.05）。

2.3.年OVF患者血清miR-15b、miR-122表達(dá)與骨密度的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示，老年OVF患者血清miR-15b相對(duì)表達(dá)量與骨密度呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.776，P＜0.05），血清miR-122相對(duì)表達(dá)量與骨密度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.745，P＜0.05）。

2.4.清miR-15b、miR-122表達(dá)對(duì)老年OVF的診斷效能分析結(jié)果 ROC曲線分析顯示，血清miR-15b表達(dá)診斷老年OVF的AUC為0.760（95%CI：0.692～0.819），最佳截?cái)嘀禐?.98，此時(shí)其診斷老年OVF的靈敏度為87.10%、特異度為63.44%、Youden指數(shù)為0.505；血清miR-122表達(dá)診斷老年OVF的AUC為0.810（95%CI：0.746～0.863），最佳截?cái)嘀禐?.17，此時(shí)其診斷老年OVF的靈敏度為83.55%、特異度為65.59%、Youden指數(shù)為0.491；血清miR-15b、miR-122表達(dá)聯(lián)合診斷老年OVF的AUC為0.922（95%CI：0.875～0.956），其診斷老年OVF的靈敏度為82.80%、特異度為91.40%、Youden指數(shù)為0.742。血清miR-15b、miR-122表達(dá)聯(lián)合診斷老年OVF的AUC高于二者單獨(dú)（Z分別為2.217、2.033，P均＜0.05）。

3.論

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加和易于骨折的代謝性骨?。?-8］。骨質(zhì)疏松性骨折是在骨質(zhì)疏松癥基礎(chǔ)上，由非暴力因素引起的一種脆性骨折，以O(shè)VF最為常見［9］。OVF可導(dǎo)致脊柱穩(wěn)定性降低，繼而引起下肢功能障礙，致殘率較高，嚴(yán)重影響老年患者的生活質(zhì)量［1］。近年來，隨著人口老齡化日益加劇，老年OVF的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。因此，尋找與老年OVF發(fā)生密切相關(guān)的特異性標(biāo)志物，從而盡早預(yù)防和診治，對(duì)提高老年OVF患者生活質(zhì)量具有重要意義。

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，在體內(nèi)穩(wěn)定存在，不直接參與基因的翻譯和表達(dá)，可作為疾病診斷的非侵入性生物標(biāo)志物［10］。miR-15b是miR-15/16家族中的一員，定位于人染色體3q25，能夠參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生命活動(dòng)。既往研究報(bào)道，miR-15b可參與子宮內(nèi)膜癌、食管癌的發(fā)生、發(fā)展［11-12］。黃高翔等［13］通過篩選衰老性骨質(zhì)疏松癥小鼠脛骨組織中具有差異性表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-15b在衰老性骨質(zhì)疏松癥小鼠體內(nèi)的表達(dá)發(fā)生波動(dòng)，其不僅能夠作為骨細(xì)胞分化的正向調(diào)節(jié)因子來調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的分化、重聚等過程，還能參與調(diào)控骨細(xì)胞的增殖和凋亡。結(jié)果表明，miR-15b與骨骼疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。miR-122是一種肝臟特異性miRNA，定位于人染色體18q21.31。miR-122能夠通過調(diào)節(jié)機(jī)體膽固醇和脂質(zhì)代謝，參與肝癌、病毒性肝炎、酒精性肝病等肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展［14-15］。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-122與骨細(xì)胞的形成、分化和成熟等生理過程密切相關(guān)［16］。但miR-15b、miR-122是否參與老年OVF的發(fā)生、發(fā)展目前尚不完全清楚。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組血清miR-15b相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，血清miR-122相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。結(jié)果表明，miR-15b、miR-122可能參與老年OVF的發(fā)生、發(fā)展，與張逢樂等［17］、李毛召等［18］研究結(jié)果一致。究其原因，miR-15b、miR-122可能通過調(diào)控相關(guān)的信號(hào)分子影響骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展，最終導(dǎo)致椎體骨折發(fā)生。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老年OVF患者血清miR-15b相對(duì)表達(dá)量與骨密度呈正相關(guān)關(guān)系，血清miR-122相對(duì)表達(dá)量與骨密度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。骨密度降低會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥發(fā)生，繼而導(dǎo)致椎體發(fā)生骨折的概率增加。而老年OVF患者血清miR-15b、miR-122相對(duì)表達(dá)量均與骨密度密切相關(guān)，故二者與老年OVF的發(fā)生亦存在一定相關(guān)性。本研究ROC曲線分析顯示，血清miR-15b、miR-122表達(dá)單獨(dú)和聯(lián)合診斷老年OVF的AUC分別為0.760、0.810、0.922，血清miR-15b、miR-122表達(dá)聯(lián)合診斷老年OVF的AUC顯著高于二者單獨(dú)。提示血清miR-15b、miR-122表達(dá)對(duì)老年OVF均具有一定診斷價(jià)值，二者聯(lián)合時(shí)診斷價(jià)值更高。

綜上所述，老年OVF患者血清miR-15b低表達(dá)、血清miR-122高表達(dá)，二者表達(dá)變化可能共同促進(jìn)老年OVF的發(fā)生、發(fā)展；血清miR-15b、miR-122表達(dá)對(duì)老年OVF均具有一定診斷價(jià)值，二者聯(lián)合時(shí)診斷價(jià)值更高。但關(guān)于miR-15b、miR-122在老年OVF中的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。