青貯玉米鏈格孢葉斑病菌生物學特性及其室內防治藥劑篩選

馬偉麗, 馬桂花, 常建萍, 鄒海濤, 祁鶴興

(青海大學農牧學院,青海 西寧 810016)

青貯玉米是指在適宜的收獲期內收獲的包括果穗在內的地上全部綠色植株,經切碎、加工,用青貯發(fā)酵方法來制作的玉米飼料,用以飼喂牛、羊等草食牲畜[1,2]。青貯玉米可為農牧交錯地區(qū)飼草生產和生態(tài)環(huán)境保護提供新途徑,對彌補飼草料短缺、減緩草地退化、保障飼料冷季供應具有重要意義[3]。青海省作為西北地區(qū)“糧改飼”和“草牧業(yè)”的試點區(qū)[4],玉米種植面積約2.7×104hm2以上。青貯玉米是青海省玉米發(fā)展的優(yōu)勢產業(yè)[5],但隨著青海省青貯玉米種植面積的不斷擴大,鏈格孢葉斑病也逐年加重,嚴重影響了其產量和品質。

青貯玉米鏈格孢葉斑病主要為害葉片、苞葉和葉鞘。病斑初期呈橢圓形,近圓形水漬狀,病斑擴展不受葉脈限制,病健交界處界限明顯,中央灰白色,邊緣紅褐色。后期病斑呈長梭狀,部分病斑中央破裂穿孔,呈撕裂狀干枯壞死[6,7]。該病害由多種鏈格孢屬(Alternaria)真菌引起。鏈格孢屬為無性型真菌,弱寄生菌,但對農作物的致病性及危害是不容忽視的。該屬種類多且寄主范圍廣泛,嚴重影響農作物的產量,長期以來給農業(yè)生產造成了巨大損失[8,9]。2018-2021年,研究組在青海省海東市民和縣、西寧市湟中縣和大通縣、黃南藏族自治州尖扎縣青貯玉米種植區(qū)進行病害調查時發(fā)現(xiàn),鏈格孢葉斑病發(fā)生普遍,由交鏈格孢(Alternariaalternata)、蕓薹鏈格孢(A.brassica)、致密鏈格孢(A.compacta)、極細鏈格孢(A.tenuissima)和茄鏈格孢(A.solani)等多種鏈格孢引起葉斑病。該病害的發(fā)生制約著青貯產業(yè)的健康發(fā)展[10]。

目前,國內對青貯玉米鏈格孢葉斑病的研究還較少,僅對甘肅省[6]、云南省[7]、青海省[10]、黑龍江省[11]和海南省[12]等的玉米鏈格孢葉斑病病原菌有過報道。因此,本研究在前期研究的基礎上對5種青貯玉米鏈格孢葉斑病菌最適碳、氮源進行篩選,同時采用菌絲生長抑制法篩選室內高效防治藥劑,為后續(xù)開展病害綜合防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

供試菌株 MH1841-A、 JZYM-112-2、 DT1882-A、 JZYM-19和DT18125-B于2018-2019年從青海省西寧市大通縣、湟中縣,海東市民和縣和黃南藏族自治州尖扎縣青貯玉米鏈格孢葉斑病病葉分離所得,由青海大學植物病理學實驗室保存。經形態(tài)學和分子生物學鑒定確定MH1841-A為交鏈格孢、JZYM-112-2為蕓薹鏈格孢、 DT1882-A為致密鏈格孢、 JZYM-19為極細鏈格孢、DT18125-B 為茄鏈格孢,經致病性測定為強致病性菌株[8]。

1.2 培養(yǎng)基配制

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g, 葡萄糖20 g,瓊脂 20 g, 蒸餾水定容至1 L;基礎培養(yǎng)基:蛋白胨4 g,葡萄糖20 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KH2PO40.5 g,K2HPO41 g,瓊脂20 g,pH 值為7.0。培養(yǎng)基經121℃高壓蒸汽滅菌20 min,備用。

1.3 殺菌劑及供試濃度

1.4 生物學特性測定

分別以葡聚糖、木糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖及淀粉替換基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖(20 g)作為碳源,以不加碳源作為對照(CK),分別配制對應培養(yǎng)基;分別以硝酸鉀、酸水解酪蛋白、酶水解酪蛋白、酵母提取物、牛肉膏及尿素替換基礎培養(yǎng)基中的蛋白胨(4 g)作為氮源,以不加氮源作為對照(CK),分別配制對應培養(yǎng)基。菌株在PDA平板上生長5 d后,用直徑0.5 cm的打孔器取菌餅并將其放置在對應培養(yǎng)基中。每個碳源和氮源做3個重復,并且每皿培養(yǎng)基的厚度要保持一致。置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 7 d 后,采用十字交叉法測量不同氮源或碳源培養(yǎng)基上的菌落生長直徑和對照組的菌落直徑,取3次測量的平均值,從而判斷不同氮源或碳源對病原菌菌絲生長的影響。

1.5 殺菌劑抑制作用測定

采用菌絲生長抑制法[13,14]。用分析天平準確稱取殺菌劑藥品放于5 mL EP管中,加入一定量體積的二甲基亞砜 (DMSO),振蕩至藥劑充分溶解,配制成105mg/L的母液,4℃無光條件下保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r將配置好的殺菌劑母液混于PDA培養(yǎng)基中梯度稀釋后倒入平皿,且厚度一致,每個濃度重復3次。以加入DMSO的培養(yǎng)基為對照組,取直徑為0.5 cm的菌餅接種到含藥劑的培養(yǎng)基中央,放置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,用十字交叉法測量含藥培養(yǎng)基中菌落生長的直徑與對照組的菌落直徑,根據(jù)兩者之間的差值判斷該種藥劑在不同濃度下對該菌株的抑制作用。

使用SPSS、EXCEL軟件處理數(shù)據(jù),求得b值±標準誤差、EC50、95%置信限、卡方值和P值。

2 結果與分析

2.1 病原菌最適碳源和氮源

測定9種碳源和7種氮源對菌株MH1841-A(交鏈格孢)、DT1882-A(致密鏈格孢)、DT18125-B(茄鏈格孢)、TJZYM-112-2(蕓薹鏈格孢)和JZYM-19(極細鏈格孢)菌絲生長的影響。結果表明,碳源中淀粉、麥芽糖和葡聚糖對于5種鏈格孢菌株的生長均有明顯的促進作用,平均生長速率在0.62～1.16 cm/d之間,而對照組平均生長速率在0.50～0.85 cm/d之間(見圖1)。添加淀粉的培養(yǎng)基為最佳碳源,在這種培養(yǎng)基上菌株生長最快,5株菌株平均生長速率分別為0.96 、1.03 、1.03 、1.11 和1.16 cm/d。 甘露醇對5種菌株的促生作用最弱,平均生長速率分別為0.52 、0.80 、0.64 、0.84 和0.87 cm/d。

圖1 不同碳源對病原菌菌絲生長的影響

氮源中蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏對5種鏈格孢菌株均有明顯的促進作用,平均生長速率在0.95～1.14 cm/d之間,而對照組平均生長速率在0.63～0.78 cm/d之間(見圖2)。添加蛋白胨的培養(yǎng)基為最佳氮源,在這種培養(yǎng)基上菌株生長最快,5株菌株平均生長速率分別為0.97 、1.06 、1.07 、1.02 和1.14 cm/d。尿素對5株菌株的促生作用最弱,平均生長速率分別為0.59 、0.68 、0.76 、0.71 和0.92 cm/d。

圖2 不同氮源對病原菌菌絲生長的影響

2.2 病原菌對殺菌劑的敏感性

通過測定7種殺菌劑對MH1841-A(交鏈格孢)、TJZYM-112-2(蕓薹鏈格孢)、DT1882-A(致密鏈格孢)、JZYM-19(極細鏈格孢)和DT18125-B(茄鏈格孢)菌絲生長的抑制作用(見表2)發(fā)現(xiàn),40%氟硅唑乳油對5種病原菌具有很強的抑制作用,EC50在0.527～2.952 mg/L之間。其次,45%咪鮮胺水乳劑對5種病原菌抑制作用也較強,EC50在0.725～5.092 mg/L之間(見圖3)。40%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑和43%戊唑醇懸浮劑對5種病原菌的抑制作用一般,EC50在2.029～9.577 mg/L之間。5種病原菌對30%醚菌酯可濕性粉劑、16%多抗霉素可溶性粒劑和50%異菌脲可濕性粉劑的敏感性最差,EC50在10.510～146.567 mg/L之間。

A:45%咪鮮胺水乳劑對MH1841-A(交鏈格孢)的抑制效果;B:40%氟硅唑乳油對TJZYM-112-2(蕓薹鏈格孢)的抑制效果

3 討論與結論

本研究通過對最佳碳、氮源的分析發(fā)現(xiàn),碳源中淀粉、麥芽糖和葡聚糖對于5種病原菌的生長均有明顯的促進作用。其中,在淀粉培養(yǎng)基上菌株生長最快,為最佳碳源。氮源中蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏對5種鏈格孢菌株均有明顯的促進作用,最佳氮源為蛋白胨。王媛媛等[15]對分離自吉林的玉米鏈格孢葉斑病菌(A.tenuis)最適產孢碳、氮源進行研究發(fā)現(xiàn),最適碳源為麥芽糖,最適氮源為蛋白胨。盧文潔等[16]對云南省蕎麥葉枯病病原菌交鏈格孢進行研究發(fā)現(xiàn),該病原菌以麥芽糖為碳源時生長最快,以蛋白胨和牛肉膏為氮源時生長一般,而以硝酸鈉為氮源時生長最佳。劉俏等[17]對青海省櫻桃葉斑病菌交鏈格孢生物學特性進行研究發(fā)現(xiàn),最適氮源為蛋白胨,最適碳源分別為肌醇和乳糖。謝皖豫[18]對引起燈臺樹葉枯病的病原菌憲菁鏈格孢(A.napiformis)生物學特性進行研究發(fā)現(xiàn),最佳碳源為乳糖,最佳氮源為酵母粉。本研究發(fā)現(xiàn)碳源麥芽糖、氮源蛋白胨對鏈格孢屬真菌的促生作用較強,與王媛媛等[15]的研究報道一致;與盧文潔等[16]關于最佳碳源的報道一致,最佳氮源存在差異;與劉俏等[17]關于最佳氮源的報道一致,最佳碳源存在差異;與謝皖豫[18]的研究結果差異明顯。造成研究結果不同的原因可能與菌株個體差異和地域差異有關。

藥劑篩選試驗結果表明,45%咪鮮胺水乳劑和40%氟硅唑乳油對青貯玉米鏈格孢葉斑病病原菌有較好的抑制作用。王義等[19]研究發(fā)現(xiàn),氟硅唑對草海桐鏈格孢葉斑病菌長柄鏈格孢菌的抑制作用最強,EC50為0.15 μg/mL。任美佳[20]的相關研究也發(fā)現(xiàn),咪鮮胺和氟硅唑對引起梨黑斑病的鏈格孢菌抑制作用最強。本研究中苯醚甲環(huán)唑對病原菌的抑制作用一般,EC50在2.029～9.577 mg/L,而謝皖豫等[17]和王義等[19]的研究表明,苯醚甲環(huán)唑對鏈格孢病原菌的抑制作用明顯。王媛媛等[15]報道異菌脲和咪鮮胺錳鹽等藥劑對玉米鏈格孢病菌具有較好的抑制效果,劉俏等[18]發(fā)現(xiàn)嘧菌酯對青海省櫻桃葉斑病菌交鏈格孢的抑制作用最強,但是本研究中異菌脲和嘧菌酯的防治效果均較差。防治效果存在差異可能與病原菌種類、來源和寄主不同有關。咪鮮胺和氟硅唑可以用于后續(xù)青貯玉米鏈格孢大田防治效果測試。本試驗結果為青貯玉米鏈格孢葉斑病菌的化學防治提供了候選藥劑,為藥劑的輪換使用提供了科學依據(jù)。