鵝細小病毒誘導番鴨胚成纖細胞自噬

王 劭,程曉霞,肖世峰,林鋒強,朱小麗,陳少鶯,陳仕龍

(福建省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所 福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心,福建 福州 350013)

鵝細小病毒(goose parvovirus,GPV)可以引起1月齡內雛鵝或雛鴨急性腸炎以及心、肝、脾、腎實質臟器炎癥等感染性病變[1]。由于GPV不斷進行抗原漂移,編碼區(qū)基因點突變或多點突變累積和基因亞型間的重組極易產(chǎn)生新的水禽細小病毒[2]。番鴨小鵝瘟病毒(muscovy duck-origin goose parvovirus,MDGPV)能引起1月齡內雛番鴨發(fā)生以小腸急性卡他性—纖維素性壞死性腸炎為主要臨床特征的高度致死性接觸性傳染病,發(fā)病率為50%～70%,病死率為40%～60%,給番鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失[3]。作為細小病毒科依賴病毒屬的成員,MDGPV與經(jīng)典鵝源GPV類 B分離株具有共同的理化性質和形態(tài)特征,均屬于細小病毒科依賴病毒屬,是一種小型無包膜單鏈DNA病毒,含有正鏈DNA和含有負鏈DNA的病毒粒子數(shù)目基本相等,基因組大小約為5.0 kb,由左右兩側兩個開放閱讀框(open reading frame,ORF)組成,左側ORF(LORF)編碼非結構蛋白(nonstructural protein,NS)NS1和NS2,右側ORF(RORF)編碼3種結構蛋白(viral capsid protein,VP)VP1、VP2及VP3。NS蛋白和VP蛋白分別具有共同的羧基端,形成套式結構[4]。與其他自主細小病毒一樣,GPV NS蛋白參與病毒復制及其致病過程的調控,而VP蛋白負責單鏈病毒子代DNA的包裝以形成傳染性子代病毒粒子[5]。近年來,新發(fā)短喙矮小綜合征鵝細小病毒(goose parvovirus associated with short beak and dwarfism syndrome,SBDS-GPV)引起病鴨短喙長舌、生長發(fā)育遲緩、骨骼脆易折斷,僵鴨淘汰率高達80%,造成了病鴨養(yǎng)殖業(yè)嚴重的經(jīng)濟損失[6]。因此,研究GPV在宿主細胞內的復制過程,有助于深入探討病毒與宿主細胞的相互作用,也將為GPV的防治策略提供新思路。

細胞自噬是一系列自噬體結構演變的過程,其標志是形成一種稱為自噬體(autophagosome)的瞬時雙層膜結構囊泡,與溶酶體(lysosome)融合形成自噬溶酶體(autolysosome),降解細胞內的蛋白聚集體、衰老損傷的細胞器以及侵入細胞的病原體等維持細胞穩(wěn)態(tài)并產(chǎn)生循環(huán)能量的途徑[7-9]。在自噬發(fā)生過程中,胞漿型微管相關蛋白1輕鏈3(即自噬相關蛋白 LC3-Ⅰ)會酶解掉一小段多肽,脂質化轉變?yōu)長C3-Ⅱ,定位于自噬體雙層膜結構上[10]。因此,膜結合型LC3-Ⅱ增多或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值升高是鑒定細胞自噬活性的重要指標。p62/sequestosome-1(SQSTM1)是一種重要的選擇性自噬接頭蛋白[11]。在自噬發(fā)生過程中,p62蛋白可以作為泛素化蛋白的接頭蛋白,通過結構域分別與泛素化疷物及自噬小體連接,將待降解疷物轉運至自噬溶酶體系統(tǒng),完成泛素化底物降解;也可以通過自身寡聚化和多聚化,作為自噬的選擇性底物參與蛋白質的自噬性降解過程[12]。雖然自噬被認為是細胞對各種細胞外和細胞內刺激的一種適應性應答,但也是調節(jié)病原體與宿主相互作用的天然防御機制,越來越多的證據(jù)表明,許多RNA或DNA病毒已進化出多種策略抵抗、逃逸細胞自噬,甚至利用自噬體結構作為病毒復制平臺促進自身增殖[13]。哺乳動物細小病毒能夠誘導細胞自噬有利于子代病毒復制[14-15],然而水禽細小病毒在感染宿主細胞過程中誘導自噬的程度仍不清楚。本試驗利用MDGPV分離株PT與SBDS-GPV分離株M15細胞適應毒分別感染番鴨胚成纖維細胞(Muscovy duck embryo fibroblasts,MDEFs),檢測細胞內自噬相關蛋白的表達;并通過影響自噬產(chǎn)生的信號通路,明確細胞自噬與GPV復制之間的關系。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞MDGPV細胞適應毒(MDGPV-PT)株與SBDS-GPV細胞適應毒(SBDS-GPV M15)株均為本實驗室分離并保存。MDEFs為本實驗室按常規(guī)方法制備。

1.2 主要試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)(HY-10219)、3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)(HY-19312)、阿洛司他丁(aloxistatin,E64d)(HY-100229)購自MedChem Express公司;Anti-LC3 antibody(L7543)、Anti-p62/SQSTM1 antibody(P0067)、Anti-β-actin antibody(A1978)購自Sigma-Aldrich公司;Anti-Duck IgG (H+L) Antibody、Peroxidase-Labeled(5220-0296)購自KPL公司;HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)(BA1051)、HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H+L)(BA1055)、Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG (H+L)(A0423)、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(P0012AC)、硝酸纖維素膜(Nitrocellulose membrane,NC membrane)(FFN02)、脫脂奶粉(P0216-300g)、DAPI(C1002)購自碧云天生物技術有限公司;MDGPV陽性血清與SBDS-GPV陽性血清均由本實驗室制備并保存。

1.3 激光共聚焦顯微鏡觀察將MDEFs細胞接種于預先放入了蓋玻片的6孔細胞培養(yǎng)板中,待細胞長到覆蓋率為80%左右時,利用感染復數(shù)(MOI)為1的MDGPV-PT(SBDS-GPV M15)感染細胞24 h,預冷PBS洗滌3次、每次5 min,棄上清;4% 多聚甲醛固定細胞爬片10 min,PBS洗滌3次、每次5 min,棄上清;2% Triton X-100通透細胞10 min,PBS洗滌3次,每次5 min,棄上清;5% BSA封閉2 h,PBS洗滌3次,每次5 min,棄上清;加入兔抗 LC3-Ⅱ 抗體(1∶500)4℃孵育過夜,PBS洗滌3次,每次 5 min;加入Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG(H+L)(1∶500)37℃ 孵育1 h 后,PBS洗滌3次,每次 5 min;最后用 DAPI 染色并封片,室溫孵育5 min,PBS洗滌3次,每次 5 min;置于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4 病毒感染與藥物處理將處于生長對數(shù)期的MDEF細胞接種于 6孔板,培養(yǎng)至細胞密度達80%。病毒感染組,接種1 MOI的MDGPV-PT(SBDS-GPV M15),置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育1 h,無菌PBS洗滌3次,加入含2%胎牛血清的DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng),同時設正常細胞對照組。藥物處理組,RAPA(100 nmol/L)作用于MDEF細胞,孵育1 h,以1 MOI MDGPV-PT(SBDS-GPV M15)接種細胞,孵育 2 h,無菌PBS 洗滌,隨后含有RAPA(100 nmol/L)的細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng);3-MA(5 mmol/L)作用于MDEF細胞,孵育 1 h,以1 MOI MDGPV-PT(SBDS-GPV M15)接種細胞,孵育 2 h,無菌PBS 洗滌,隨后含有3-MA(5 mmol/L)的細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng);E64d(10 μmol/L)作用于MDEF細胞,孵育 1 h,以1 MOI MDGPV-PT(SBDS-GPV M15)接種細胞,孵育 2 h,無菌PBS 洗滌3次,隨后含有E64d(10 μmol/L)的細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 Western blot分析收集感染組與藥物處理組不同時間點MDEFs細胞,用預冷的PBS洗滌細胞2次,并加入裂解液,冰浴裂解30 min。13 000×g離心10 min,取上清,加入SDS-PAGE 上樣緩沖液,煮沸 10 min后,12 000×g離心10 min。將處理好的樣品進行 SDS-PAGE 電泳,用半干法(15 V,20 min)將蛋白轉移至NC膜,用 50 g/L 脫脂牛奶室溫封閉 1 h ;一抗4℃ 孵育過夜,然后 TBST 洗膜 3 次、每次 5 min;室溫孵育對應的抗兔(抗小鼠或抗鴨)的IgG-HRP二抗 1 h,TBST 洗膜 3 次、每次 5 min;加 ECL 發(fā)光液,自顯影儀曝光照相。

1.6 實時熒光定量PCR檢測自噬對病毒基因拷貝數(shù)的影響將MDEFs細胞按80%的匯合度接種于 6孔板,置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,無菌PBS 洗滌3次,分別對細胞進行自噬誘導劑雷帕霉素(100 nmol/L)或自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(5 mmol/L)預處理2 h,按照1 MOI MDGPV-PT(SBDS-GPV M15),分別在感染病毒24 h時,經(jīng)過反復凍融3次收集病毒液,-70℃保存?zhèn)溆?。根?jù)細胞、組織與血液DNA提取試劑盒操作說明書提取病毒核酸,-20℃保存?zhèn)溆?。應用TB Green?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒進行real-time PCR反應,以病毒DNA為模板,設空白對照,每個樣品重復3次,其中鴨源β-actin作為相對定量的參照,參照文獻[16]合成GPV的VP3基因鑒定引物G5-P1/P2,并參考鴨源β-actin(GenBank登錄號:GU564232)基因序列,通過Oligo 7.0軟件設計合成鴨源β-actin基因鑒定引物actin-F/R,real-time PCR引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應體系:TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL,上、下游引物(20 μmol/L)各0.4 μL,ROX Reference Dye(50×)0.4 μL,DNA模板2 μL,加ddH2O補足至20 μL。反應條件:95℃預變性 5 min,95℃變性5 s,60℃退火10 s,72℃延伸15 s,共40個循環(huán)。

1.7 TCID50方法檢測自噬對病毒復制的影響MDEF細胞培養(yǎng)于25 cm2培養(yǎng)瓶,待細胞生長形成單層后,分別對細胞進行自噬誘導劑雷帕霉素(100 nmol/L)或自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(5 mmol/L)預處理2 h,分別接種1 MOI MDGPV-PT(SBDS-GPV M15),并在感染病毒24 h時,經(jīng)過反復凍融3次收集病毒液,-70℃保存?zhèn)溆谩Ｓ眉毎S持DMEM 培養(yǎng)液10倍倍比稀釋上述收集的病毒液,分別接種到96孔培養(yǎng)板中長滿單層的MDEF細胞上,每孔100 μL,每個稀釋度接種8孔,并設正常細胞培養(yǎng)對照(加等量無病毒細胞培養(yǎng)維持液),置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天在普通光學顯微鏡下觀察細胞病變,按照Reed-Muench法計算病毒的細胞半數(shù)感染量(TCID50)。

表1 熒光定量PCR引物信息

2 結果

2.1 GPV感染MDEFs細胞對LC3蛋白表達的影響LC3蛋白被稱之為微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3),是哺乳動物細胞中酵母ATG8基因的同源物,包括Ⅰ型和Ⅱ型。LC3作為可溶性胞漿蛋白(LC3-Ⅰ)存在于細胞質中,在插入自噬小泡雙層膜之前經(jīng)過磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamines,PE)修飾成為LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ保留在成熟的自噬體上,直至與溶酶體融合生成自噬溶酶體,因此LC3的合成與降解常用于監(jiān)測自噬體到自噬溶酶體的變化過程。為了研究GPV感染MDEFs細胞對自噬的影響,以MOI為1的MDGPV-PT和SBDS-GPV M15細胞適應毒分別感染MDEFs細胞,分別于6,12,18,24 h 收集細胞樣品,采用Western blot方法檢測LC3的表達情況,結果顯示,相對于對照組正常細胞,MDGPV-PT與SBDS-GPV M15細胞適應毒隨著病毒復制時間的延長,MDEFs細胞內的LC3-Ⅰ逐漸向LC3-Ⅱ轉化。MDGPV-PT病毒株在感染12 h時,LC3-Ⅱ的表達量增加,且高于SBDS-GPV M15病毒株,而且隨著感染時間的延長,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值逐漸增加(圖 1)。

激光共聚焦顯微鏡也是用來監(jiān)測自噬的方法之一。自噬未被激活時,LC3-Ⅰ是沒有被脂化的蛋白,彌散分布在細胞質;自噬形成時,膜結合狀態(tài)的LC3-Ⅱ是自噬體膜的主要組成成分,分布在自噬體內外膜上,使用熒光標記后形成明亮的斑點。Alexa Fluor 488染色LC3-Ⅱ為綠色熒光,DAPI染色細胞核為藍色熒光。在激光共聚焦顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點,一個斑點相當于一個自噬體,熒光強弱可一定程度反映細胞自噬強度變化。本研究應用激光共聚焦觀察LC3蛋白熒光聚集點,1 MOI MDGPV-PT(SBDS-GPV M15)細胞適應毒感染MDEFs細胞24 h后,LC3陽性綠色熒光強度明顯高于正常細胞對照組,而且MDGPV-PT感染組的LC3陽性斑點數(shù)多于SBDS-GPV M15感染組(圖2)。以上結果表明,GPV感染MDEFs細胞后能夠誘導細胞自噬。

A.Western blot檢測LC3含量結果;B.LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白相對表達量 *.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001。下同

2.2 GPV感染促進細胞自噬通量的增加細胞自噬的發(fā)生是一個復雜的動態(tài)過程,完整的自噬包括自噬啟動、自噬體形成、自噬溶酶體形成與降解及再利用。目前研究表明,p62是SQSTM1編碼的泛素結合蛋白,作為一種自噬特異性底物,可與LC3-Ⅱ相互作用滲入到自噬體并通過自噬溶酶體得到有效地降解,在細胞內整體p62水平的表達與自噬活性存在負相關,因此,p62的表達量的變化已被用于確定自噬通量。為了檢測GPV感染是否能誘導MDEFs細胞完整的自噬過程,對p62蛋白進行了分析,結果顯示,與正常對照細胞相比,在MDGPV-PT或SBDS-GPV M15感染后的6,12,18,24 h,隨著GPV復制水平升高,MDEFs細胞中的p62蛋白量表達均減少(圖3)。

A～C.MDGPV感染的MDEFs細胞;D～F.SBDS-GPV感染的MDEFs細胞;G～I.正常對照組MDEFs細胞

A.Western blot檢測p62含量結果;B.p62蛋白相對表達量

E64d是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑,可以抑制自噬物質在自溶酶體內的降解,檢測E64d 預處理細胞中LC3-Ⅱ 和 p62 表達量變化,常被作為監(jiān)視溶酶體依賴性降解中自噬通量水平的方法。本試驗使用E64d(10 μmol/L)預處理MDEFs細胞 2 h,1 MOI MDGPV-PT(SBDS-GPV M15)細胞適應毒接種藥物處理細胞,并感染 12,24 h 后分別收集細胞。Western blot方法檢測LC3-Ⅱ與p62蛋白的表達水平。結果顯示E64d處理能增加GPV感染細胞中LC3-Ⅱ與p62蛋白的表達(圖4),也能促進GPV結構蛋白(viral particle protein,VP)的表達。以上結果表明p62蛋白作為重要的自噬受體,參與了GPV感染MDEFs細胞誘導的自噬進程。GPV感染會引起宿主細胞中自噬通量的增加。

2.3 細胞自噬促進GPV復制分別將自噬誘導劑RAPA(100 nmol/L)與自噬抑制劑3-MA(5 mmol/L)作用于MDEFs細胞2 h,并在1 MOI MDGPV-PT(SBDS-GPV M15)細胞適應毒感染MDEFs細胞后24 h分別通過熒光定量PCR檢測病毒VP基因拷貝數(shù)以及TCID50方法測定病毒滴度,并應用Western blot來檢測病毒的復制情況。結果顯示,與未經(jīng)藥物處理的GPV感染對照組相比,RAPA處理組GPV感染MDEFs細胞24 h,病毒VP基因拷貝數(shù)顯著增加,然而3-MA處理組GPV感染MDEFs細胞24 h,病毒結構基因拷貝數(shù)減少;Western blot檢測表明,與未經(jīng)藥物處理的GPV感染對照組相比,自噬誘導劑RAPA增加了LC3-Ⅱ與病毒VP蛋白的表達量,而自噬抑制劑3-MA則降低了LC3-Ⅱ蛋白表達量以及GPV復制水平;TCID50測定發(fā)現(xiàn),RAPA誘導自噬24 h后,MDGPV-PT與SBDS-GPV M15子代病毒產(chǎn)量提高,而3-MA則降低了GPV病毒產(chǎn)量(圖5)。結果表明細胞自噬的激活有利于GPV的復制增殖。

A.Western blot檢測p62含量結果;B.p62蛋白相對表達量(E64d處理12 h);C.p62蛋白相對表達量(E64d處理24 h)

A.Western blot檢測GPV VP3含量(RAPA);B.Western blot檢測GPV VP3含量(3-MA);C.TCID50測定自噬藥物處理24 h后GPV滴度;D.熒光定量PCR測定自噬藥物處理24 h后GPV拷貝數(shù)

3 討論

自噬是一種在病原微生物感染靶細胞時被激活的免疫機制,其在降解和回收長壽命蛋白質、大蛋白聚集體或受損細胞器以及抵抗細胞內病原體方面發(fā)揮著多種生理和病理作用[17]。已有研究表明,自噬對于病毒感染具有雙向調節(jié)作用,使受侵染宿主體內可以快速啟動強大的天然免疫反應以清除病毒,又可能做為病毒增殖的途徑以拮抗宿主固有免疫[18]。因此,自噬在病毒生命周期和致病力方面均起到重要作用[19]。在病毒感染過程中,一些病毒會抑制自噬的發(fā)生。例如狂犬病病毒磷蛋白P5與 自噬相關基因Beclin1編碼的BECN1蛋白卷曲螺旋環(huán)結合,通過誘導 BECN1 信號通路依賴的不完全自噬,從而促進病毒復制[20];人乳頭瘤病毒和卡波濟肉瘤相關皰疹病毒也會限制自噬介導的降解,從而促進腫瘤發(fā)生[21]。另外,越來越多的證據(jù)表明不同的DNA病毒可能在不同的復制增殖階段劫持自噬破壞其抗病毒作用,抑制自噬將導致人巨細胞病毒、人類皰疹病毒4型、家蠶核型多角體病毒、鴨病毒性腸炎病毒和豬圓環(huán)病毒2型等病毒的滴度降低[22]。大多數(shù)的哺乳動物細小病毒可以通過激活細胞內的自噬途徑促進子代病毒的復制。PPV在感染PK15細胞早期即可誘導LC3分子的熒光聚點,將胞漿型LC3-Ⅰ轉換為(自噬體)膜型LC3-Ⅱ,感染細胞內子代病毒VP2基因拷貝數(shù)顯著提高,PPV利用自噬促進了自身的復制。CPV-2與人細小病毒B19V在感染過程均可誘導宿主細胞內線粒體自噬,促進病毒在細胞內的復制增殖[23-24]。GPV感染與細胞自噬之間相互作用關系尚未見報道,本研究以MDGPV-PT與SBDS-GPV M15細胞適應毒感染MDEFs細胞,利用激光共聚焦觀察到 LC3 標記的綠色自噬熒光顆粒增多,通過蛋白印跡技術檢測LC3-Ⅱ表達量的增加,初步確定GPV感染能誘導MDEFs細胞發(fā)生自噬。

p62是sequestosome1(SQSTM1)編碼的泛素結合蛋白,參與多種細胞信號轉導調控及自噬過程[25]。正是依賴p62蛋白樞紐作用,細胞內的泛素蛋白酶體系統(tǒng)和自噬-溶酶體系統(tǒng)兩種蛋白降解機制建立了內在的聯(lián)系。在自噬過程中,p62蛋白與泛素化蛋白質聚集物結合,再與定位于自噬小體內膜上的LC3-Ⅱ蛋白形成復合物,隨后被整合到自噬體中,并在自噬溶酶體中被降解[26]。p62作為識別自噬通量的標記蛋白,其含量可以反映自噬小體清除水平與自噬流的完成情況[27]。在本試驗中,首先證明 GPV感染引起 p62蛋白表達降低。為了進一步確定p62 蛋白作為自噬受體是否與待降解物一起經(jīng)自噬-溶酶體系統(tǒng)介導降解,在存在或不存在溶酶體抑制劑E64d預處理的情況下,檢測了GPV感染MDEFs細胞中p62的蛋白質表達水平。與對照組相比,E64d處理增加了病毒感染細胞中p62的表達,這表明 GPV感染通過 p62 蛋白傳導自噬信號誘導泛素化目標蛋白的降解。

本研究主要探索了GPV復制與細胞自噬之間的關系,選用MDGPV-PT與SBDS-GPV M15兩種致病型的細胞適應毒分別以相同感染量同時感染MDEFs細胞,結果發(fā)現(xiàn)不同致病型GPV分離株誘導的自噬水平存在差異,推測自噬的差異也有可能是導致MDGPV和SBDS-GPV致病性差異的一個重要原因。本試驗還通過使用自噬藥物調節(jié)劑E64d、RAPA與3-MA 來研究細胞自噬對病毒復制的影響。E64d是一種廣譜半胱氨酸蛋白酶抑制劑,抑制溶酶體組織蛋白酶對自噬溶酶體內自噬底物的降解,從而阻斷自噬的進展[28];RAPA能特異性靶向抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycine,mTOR),阻止其下游底物p70核糖體蛋白s6激酶(p70s6k)和真核細胞翻譯啟始因子4E結合蛋白(4EBP1)磷酸化,促進自噬的發(fā)生[29];3-MA調控自噬的上游信號通路Ⅱ型PI3K,在自噬體形成的早期,通過抑制自噬效應蛋白BECN1與磷脂酰肌醇 3G 激酶(PtdIns 3KC3)復合物的形成來抑制胞漿可溶性形式LC3-Ⅰ向自噬體膜結合形式LC3-Ⅱ轉化,阻斷自噬體膜的形成,從而抑制自噬[30]。本試驗結果顯示,激活自噬有利于促進GPV復制,自噬抑制劑阻斷自噬通量可以降低GPV的增殖水平。綜上所述, GPV感染MDEFs細胞能誘導細胞自噬,同時細胞自噬又能促進GPV的復制。