耐低營養(yǎng)乳酸菌篩選及對難青貯牧草發(fā)酵品質(zhì)的影響

田靜，曹彩霞，黃莉瑩，吳娟燕，張建國

（1. 華南農(nóng)業(yè)大學南方草業(yè)中心，廣東 廣州 510642；2. 韶關學院英東生物與農(nóng)業(yè)學院，廣東 韶關 512005；3. 廣東科貿(mào)職業(yè)學院繼續(xù)教育學院，廣東廣州 510430）

青貯是依靠原材料本身附著的乳酸菌在厭氧條件下將原材料中水溶性碳水化合物（water-soluble carbohydrates，WSC）轉(zhuǎn)化為以乳酸為主的有機酸，降低pH，抑制腐敗微生物的生長和繁殖，使青貯飼料營養(yǎng)物質(zhì)得以長期保存的技術[1］。青貯飼料因氣味香甜、柔軟多汁、營養(yǎng)保存好、適口性佳等特點，被世界各國所重視，特別是在畜牧業(yè)發(fā)達國家，是不可或缺的基礎性飼料[2］。青貯發(fā)酵的過程極其復雜，受諸多因素的影響，其中，起主導作用并決定青貯飼料優(yōu)劣、成敗的關鍵因素是原材料本身的WSC 含量和乳酸菌[3］。當青貯原材料中乳酸菌數(shù)量較少時，青貯發(fā)酵品質(zhì)差，營養(yǎng)物質(zhì)損失多，家畜的適口性與利用率降低[4］。針對這一問題，生產(chǎn)實踐中常通過添加乳酸菌來彌補優(yōu)良乳酸菌缺乏或數(shù)量不足的問題，只要WSC 含量不是太低，添加乳酸菌一般都有明顯的改善效果[5-6］，但對于WSC 含量不足的材料，即使添加乳酸菌，也很難得到優(yōu)質(zhì)的青貯飼料[7-8］，如豆科牧草及部分緩沖能高、WSC 含量低的禾本科牧草。因此，大多需同時添加糖類、含糖物質(zhì)多的副產(chǎn)物或纖維素酶等[9］，但這些需要較高的人力、物力成本。到目前為止，乳酸菌添加劑都是以正常營養(yǎng)成分及含量的培養(yǎng)基篩選出的產(chǎn)酸多、生長快、耐低溫、耐高溫或分解某些有害物質(zhì)等的菌株[10-11］，未見針對低營養(yǎng)條件篩選的添加劑。碳源是微生物生長繁殖的第一營養(yǎng)限制因素，若針對低糖條件篩選耐低營養(yǎng)的乳酸菌菌株，不僅能解決原材料含糖量低或乳酸菌數(shù)量少導致的發(fā)酵品質(zhì)差等問題，且能有效降低生產(chǎn)成本。對于豐富乳酸菌劑和低成本高效率生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)青貯飼料具有重要意義。

柱花草（Stylosanthes guianensis）是熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的豆科牧草，被稱為“熱帶苜?！?，因熱帶亞熱帶地區(qū)多雨潮濕很難將其制成干草，因此，青貯是利用柱花草的有效方式[8］。但由于其緩沖能高、WSC 含量低和表面乳酸菌數(shù)量少，自然發(fā)酵品質(zhì)較差[8，12］，青貯期間始終存在梭狀芽孢桿菌和腸桿菌等不良微生物，從而導致丁酸積累和蛋白降解[13］。雖然晾曬可以改善發(fā)酵品質(zhì)，但pH 仍高于4.5[12］，只有少數(shù)乳酸菌接種劑能夠成功發(fā)酵，有些乳酸菌對其青貯發(fā)酵品質(zhì)沒有積極效果[8，14］。蘇丹草（Sorghum sudanense）是熱帶亞熱帶地區(qū)廣泛栽培的禾本科一年生牧草，具有高產(chǎn)、病蟲害抗性和耐旱性強等特點，被廣泛用于動物飼料[15］。但由于其緩沖能高，WSC 含量相對不足，青貯飼料品質(zhì)也較差[16］。因此，為改善WSC 不足牧草的青貯發(fā)酵品質(zhì)，篩選耐低營養(yǎng)的乳酸菌具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從華南農(nóng)業(yè)大學教學科研試驗基地采集燕麥（Avena sativa）、小麥（Triticum aestivum）和象草（Pennisetum purpureum）等，低溫保存于無菌樣品袋，帶回實驗室用于乳酸菌的分離、篩選和鑒定。青貯原料于2017 年3 月26日種植，采用開花前期的柱花草和抽穗期的蘇丹草。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化 無菌條件下稱取切短的牧草10 g，加入90 mL 無菌生理鹽水，充分混勻后稀釋至不同濃度。在MRS 固體培養(yǎng)基（酪蛋白酶消化物10 g·L-1，牛肉膏粉10 g·L-1，酵母膏粉4 g·L-1，檸檬酸三銨2 g·L-1，乙酸鈉5 g·L-1，硫酸鎂0.2 g·L-1，硫酸錳0.05 g·L-1，磷酸氫二鉀2 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，吐溫-80 1.08 g·L-1，瓊脂15 g·L-1）上37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，通過菌落形態(tài)觀察進行挑選與分離。將分離的菌株從液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基反復劃線培養(yǎng)，獲得純化的單菌株。再對菌株進行革蘭氏染色、鏡檢觀察、過氧化氫酶試驗，初步認定為乳酸菌[17］。純化出的乳酸菌菌株于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 耐低營養(yǎng)乳酸菌的篩選 將分離的乳酸菌與實驗室保存的腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）LM1、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CCZZ1和鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）HT1活化的第2 代菌株分別接種到0.002、0.02、0.2、2 和20 g·L-1葡萄糖含量的MRS 液體培養(yǎng)基中，接種量為105cfu，培養(yǎng)48 h 后測定OD600進行初篩。初篩的菌株再分別接種到用HCl 調(diào)配的pH 為4.0 和4.5 的MRS 液體培養(yǎng)基中復篩，選出既耐低營養(yǎng)又耐酸的乳酸菌菌株。

1.2.3 耐低營養(yǎng)乳酸菌的鑒定 將培養(yǎng)后的篩選菌株接種到不同pH（3.5、4.0、4.5 和7.5）和不同NaCl（3.0%、6.5%和10.0%）濃度的MRS 液體培養(yǎng)基中37 ℃厭氧培養(yǎng)3 d，同時接種到正常培養(yǎng)基中置于10、15、45和50 ℃培養(yǎng)3 d 后，測定OD600。采用API 50 CHL 發(fā)酵試劑盒（Bio Mérieux，法國）測定碳源發(fā)酵模式。收集篩選菌株菌體，參照細菌DNA 提取試劑盒說明提取DNA，然后進行16S rDNA 擴增，引物序列為：27f（5′-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3′），1492r（5′-TACCTTGTTACGACT-3′），擴增產(chǎn)物送至派森諾生物科技有限公司測序。測序結(jié)果用BLAST（basic local alignment search tool，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）比對，將相似性最高的菌種初步認定為待測菌株的屬種。然后從Gen Bank 數(shù)據(jù)庫下載已知菌株的16S rDNA 基因序列，用Clustal X 進行序列比對，再用MEGA 5.0 的Neighbor-joining 法[18］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 青貯飼料的調(diào)制 用鍘草機將收獲后的柱花草和蘇丹草切割至1~2 cm 的長度，混合均勻后分別添加乳酸菌菌株SCLN1、LM1、HT1、SCLN1+LM1、LM1+HT1和添加等量的無菌水（CK），共6 個處理。菌的添加量基于鮮物質(zhì)（fresh matter，F(xiàn)M），為105cfu·g-1，水的添加量為1% FM，將處理后的材料混合均勻，取約200 g 裝至20 cm×30 cm 的聚乙烯塑料袋中，用真空封口機抽真空密封保存，每個處理4 個重復。60 d 后開袋取樣，檢測青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)和微生物數(shù)量。

1.3 試驗指標測定

1.3.1 牧草青貯前化學成分的測定 稱取20 g 材料，加入80 mL 蒸餾水完全浸沒樣品，4 ℃冰箱中放置24 h，過濾得到浸提液，采用pH 計（Mettler Toledo FE28，瑞士）測定pH；采用鹽酸、氫氧化鈉滴定法測定緩沖能[2］。稱取約150 g 材料，65 ℃烘干至恒重測定干物質(zhì)（dry matter，DM）含量；粉碎烘干后的樣品過1.0 mm 篩，用于測定營養(yǎng)成分，采用凱氏定氮法測定粗蛋白含量[19］；使用范氏（Van Soest）濾袋分析法（ANKOM A200i，中國）測定中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量[20］；采用硫酸蒽酮法測定WSC 含量[21］。

1.3.2 牧草青貯前后微生物的測定 無菌條件下稱取20 g 樣品，加入90 mL 無菌生理鹽水，充分混勻后稀釋至不同濃度，分別采用MRS 瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar，NA）（蛋白胨10 g·L-1，牛肉膏粉3 g·L-1，氯化鈉5 g·L-1，瓊脂15 g·L-1）和孟加拉紅培養(yǎng)基（rose bengal agar，RBA）（蛋白胨5 g·L-1，葡萄糖10 g·L-1，磷酸二氫鉀1 g·L-1，硫酸鎂0.5 g·L-1，瓊脂15 g·L-1，孟加拉紅0.033 g·L-1，氯霉素0.1 g·L-1）進行乳酸菌、好氧性細菌、酵母菌和霉菌劃板培養(yǎng)后計數(shù)。37 ℃厭氧培養(yǎng)乳酸菌1~2 d；30 ℃有氧培養(yǎng)好氧性細菌、酵母菌和霉菌2~3 d。

1.3.3 牧草青貯后發(fā)酵品質(zhì)的測定 青貯開封后，用1.3.1 中的方法過濾出濾液，測定pH、氨態(tài)氮（ammonia nitrogen，NH3-N）和有機酸含量；采用比色法測定NH3-N 含量[22］；采用島津LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本）分析有機酸含量。色譜條件：色譜柱為Eleven Organic Acids on Transgenomic COREGel 87H3；檢測器：RID-10A；流動相：0.1 mmol·L-1的磷酸溶液；流速：1 mL·min-1；柱溫40 ℃；檢測波長210 nm；進樣量20 μL。

1.3.4 青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)評定 采用V-score 評分[23］對柱花草和蘇丹草青貯飼料進行發(fā)酵品質(zhì)的評定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel 2019 初步整理試驗數(shù)據(jù)，結(jié)合SPSS 20.0 對不同菌株測定的指標進行單因子ANOVA 分析，篩選出耐低營養(yǎng)的乳酸菌菌株。再通過單因子方差分析和Duncan 法比較耐低營養(yǎng)菌株對柱花草和蘇丹草青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響，P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的篩選

通過對分離菌株進行革蘭氏染色、鏡檢觀察和過氧化氫酶試驗，得到91 株乳酸菌，加上實驗室保存的3 株，共94 株菌株。根據(jù)其在0.002 g·L-1糖含量的MRS 中的生長情況，初篩得出10 株較耐低營養(yǎng)乳酸菌菌株（表1），其中，菌株SCLN1、LA1和HT1表現(xiàn)顯著優(yōu)于其他菌株。耐酸性試驗復篩結(jié)果（圖1）表明，菌株SCLN1、LM1和HT1均有很強的耐酸性，而菌株LA1的OD 值顯著低于除LA4外的其他菌株。耐低營養(yǎng)的耐酸菌株SCLN1和HT1，以及耐低營養(yǎng)稍差的耐酸菌株LM1用于隨后的青貯發(fā)酵研究。

表1 乳酸菌在不同葡萄糖含量培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h 的OD600值Table 1 OD600 values of lactic acid bacteria cultured in medium with different glucose concentration for 48 h

2.2 耐低營養(yǎng)乳酸菌的生理生化特性與鑒定

菌株SCLN1為革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性菌，發(fā)酵類型為同型發(fā)酵，能在10~50 ℃和pH 3.5~8.0條件下生長，其溫度和酸堿度的生育范圍廣；6.5%NaCl 條件下微弱生長，具有良好的耐鹽性；可利用的糖達23 種（表2 和表3）。

表2 菌株SCLN1的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical properties of strain SCLN1

表3 菌株SCLN1可利用的糖Table 3 Available sugars of strain SCLN1

菌株SCLN1與植物乳桿菌MLG5-17 處于同一族群，進化親緣度100%，與已知菌株序列的相似性為100%（圖2）。因此，菌株SCLN1被鑒定為植物乳桿菌。

圖2 篩選菌株SCLN1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of screened strain SCLN1

2.3 柱花草和蘇丹草青貯前的特性

柱花草和蘇丹草青貯前的DM 含量均超過30%，柱花草粗蛋白含量約為蘇丹草的2 倍，NDF 和ADF含量均高于蘇丹草。兩種牧草的緩沖能都極高，WSC 含量較低，蘇丹草（9.26% DM）的WSC 含量高于柱花草（4.74% DM），兩種牧草表面乳酸菌數(shù)量均較少，低于103cfu·g-1FM，且好氧細菌和酵母數(shù)量較多（表4）。

表4 柱花草和蘇丹草青貯前的化學特性和微生物數(shù)量Table 4 The chemical characteristic and microbial population of stylo and sudan grass prior to ensiling

2.4 柱花草和蘇丹草青貯發(fā)酵品質(zhì)

柱花草和蘇丹草自然青貯60 d 后的發(fā)酵品質(zhì)較差，pH 均超過5.1，乳酸含量不高于2.00% DM，產(chǎn)生了較多的乙酸（4.82% DM 和2.09% DM）和丁酸（3.64% DM 和3.38% DM），NH3-N 含量分別高達30.50% TN 和29.01% TN（表5）。加菌顯著降低了兩種牧草青貯料的pH（除LM1+HT1）和NH3-N 含量（除LM1+HT1）（P<0.05），增加了乳酸含量（除HT1和LM1+HT1）。其中，添加SCLN1效果最顯著，將柱花草青貯料的pH 由對照的5.36 降至4.67，乳酸含量由2.00% DM 增 加 至4.16% DM，NH3-N 含 量 由30.50% TN 降至11.24% TN；另外，添加SCLN1的蘇丹草青貯料的pH（4.10）顯著低于CK（5.19），乳酸含量由1.82% DM 增加至8.29% DM，NH3-N 含量由29.01% TN 降至12.69% TN。添加SCLN1均不同程度地降低了兩種牧草青貯料的乙酸、丙酸（除蘇丹草）和丁酸含量，顯著提高了V-score 評分（圖3）?；旌咸砑覵CLN1和LM1的效果劣于單獨添加SCLN1，但在柱花草中優(yōu)于LM1和HT1的單獨添加，在蘇丹草中與LM1和HT1的單獨添加無顯著差異（P>0.05）。混合添加LM1和HT1的效果比單獨添加LM1和HT1的效果差。加菌對兩種牧草青貯后的微生物（除柱花草的酵母）數(shù)量影響不顯著（P>0.05）。

圖3 添加耐低營養(yǎng)乳酸菌青貯柱花草和蘇丹草的發(fā)酵品質(zhì)評分Fig. 3 Fermentation quality scores of stylo and sudan grass silage inoculated low-nutrient-tolerant lactic acid bacteria

表5 添加耐低營養(yǎng)乳酸菌對柱花草和蘇丹草青貯發(fā)酵品質(zhì)的比較Table 5 Comparison of the fermentation quality of stylo and sudan grass silage inoculated low-nutrient-tolerant lactic acid bacteria

3 討論

3.1 乳酸菌的篩選與鑒定

植物葉片表面碳源是乳酸菌定殖的主要決定因素[24］，其含量較低，如Mercier 等[25］曾報道大豆（Glycine max）葉表面總糖和葡萄糖濃度僅有2.5 μg·g-1FM 和1.4 μg·g-1FM。因此，本研究從新鮮牧草表面分離耐低營養(yǎng)乳酸菌，篩選的菌株SCLN1經(jīng)分子同源分析被鑒定為植物乳桿菌。Kuppusamy 等[26］也曾報道植物乳桿菌能在糖濃度低的培養(yǎng)基中較好生長，而本研究中的植物乳桿菌CCZZ1在葡萄糖低濃度條件下無明顯優(yōu)勢，原因可能是同種菌的不同菌株之間對碳源種類和濃度利用存在差異[27］。

3.2 柱花草和蘇丹草青貯前的化學特性

本 研 究 中 柱 花 草 的 粗 蛋 白 含 量 較 高，為15.25% DM，高 于Liu 等[12］和Silva 等[28］報 道 的10.41% DM 和12.24% DM，略高于Li 等[29］和Zou 等[30］報道的13.6% DM 和13.3% DM。NDF 和ADF 含量分別與Liu 等[12］與Silva 等[28］報道的結(jié)果一致，但ADF 含量略低于Liu 等[12］報道 的47.06% DM，原因可能是原材料的收獲期不同[31］。蘇丹草的粗蛋白含量比柱花草低，為8.16% DM，與Nazar 等[16］報道的一致。NDF 和ADF 含量也與Nazar等[16］和Stojanovic 等[32］報道的60%~70% DM 和30%~40% DM 一致。一般認為，青貯原材料的干物質(zhì)含量為30%~35% FM，WSC 含量為6%~8% DM，乳酸菌數(shù)量超過5.0 log10cfu·g-1FM，可獲得優(yōu)質(zhì)的青貯飼料[2］。然而，柱花草和蘇丹草的DM 含量雖均達到34% FM，柱花草WSC 含量為4.74% DM，蘇丹草的WSC 含量為9.26% DM，但二者的緩沖能極高，分別為569.97 和441.98 mEq·kg-1DM，不利于青貯，這一結(jié)果與Nazar 等[16］和Liu 等[12］報道的蘇丹草和柱花草的WSC 含量一致。柱花草和蘇丹草表面的乳酸菌數(shù)量（2.32 和2.75 log10cfu·g-1FM）也較少，好氧細菌和酵母均較多。當乳酸菌在發(fā)酵過程中不能產(chǎn)生足夠的乳酸來降低pH 并抑制梭狀芽孢桿菌的生長時，青貯飼料品質(zhì)會很差。因此，青貯前有必要添加乳酸菌和糖源物質(zhì)或耐低營養(yǎng)的乳酸菌控制青貯飼料的發(fā)酵。

3.3 柱花草和蘇丹草的青貯發(fā)酵品質(zhì)

青貯飼料的pH 是評價青貯發(fā)酵品質(zhì)的重要指標，乳酸是青貯飼料中理想的發(fā)酵產(chǎn)物，乙酸主要來源于異型發(fā)酵乳酸菌、腸桿菌和丙酸桿菌在WSC 上的代謝物[2］，丁酸和NH3-N 的產(chǎn)生代表牧草中蛋白質(zhì)的降解和丁酸發(fā)酵，蛋白質(zhì)降解程度會導致牧草的營養(yǎng)物質(zhì)損失。本研究中，柱花草和蘇丹草自然青貯的發(fā)酵品質(zhì)較差，原因可能是兩種牧草的WSC 含量低、表面附著的乳酸菌數(shù)量少，雖然蘇丹草的WSC 含量高于柱花草，但由于其緩沖能高，WSC 含量可能依然不足，因為添加1%葡萄糖顯著提高了蘇丹草的發(fā)酵品質(zhì)（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。

添加耐低營養(yǎng)乳酸菌后，兩種牧草的青貯發(fā)酵品質(zhì)均得到改善，尤其是SCLN1。添加菌株SCLN1使柱花草和蘇丹草青貯料的pH 分別降至4.67 和4.10，蘇丹草青貯料的pH 達到了優(yōu)質(zhì)青貯飼料的pH（<4.2），乳酸含量分別增加至4.16% DM 和8.29% DM，丁酸含量降低甚至未檢測到，NH3-N 含量也由30% TN 左右降至12%TN 左右，V-score 評分顯著提高，表明菌株SCLN1能有效改善柱花草的發(fā)酵品質(zhì)，且改善效果優(yōu)于Li 等[8］報道的添加植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌分別將柱花草的pH 由5.32 降至5.10 和5.02 的結(jié)果，本研究添加鼠李糖乳桿菌的pH 為5.00，與其一致。Chen 等[33］和Liu 等[34］的研究結(jié)果表明添加菌株HT1可顯著改善意大利黑麥草（Lolium multiflorum）和紫花苜蓿（Medicago sativa）的發(fā)酵品質(zhì)，本研究中添加菌株HT1雖然也改善了柱花草和蘇丹草的發(fā)酵品質(zhì)，但其效果不如菌株SCLN1。此外，本研究中乳酸菌的單獨添加效果優(yōu)于混合添加，這一結(jié)果在其他研究中也有報道[35］，原因可能是菌株間競爭底物不同。

4 結(jié)論

本研究從分離的91 株乳酸菌和實驗室保存的3 株乳酸菌中初篩得到10 株較耐低營養(yǎng)乳酸菌，通過耐酸試驗復篩得到兩株耐低營養(yǎng)的耐酸菌株SCLN1和HT1、1 株耐酸性強但耐低營養(yǎng)稍差的菌株LM1，HT1和LM1為實驗室保存菌株，分別是鼠李糖乳桿菌和腸膜明串珠菌，SCLN1經(jīng)16S rDNA 和生理生化特性鑒定為植物乳桿菌。將其分別添加到難以青貯的柱花草和蘇丹草中青貯后，均顯著改善了兩種牧草的發(fā)酵品質(zhì)，而單獨添加SCLN1的效果顯著優(yōu)于其他菌株單獨添加或與SCLN1混合添加。