園藝植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象及抗褐化研究進(jìn)展

丁旭鋒 張談捷

摘 要：褐化是指植物組織培養(yǎng)中常見的細(xì)胞生長不良情況，已成為近年來植物組織培養(yǎng)的科研熱點(diǎn)之一。文章主要針對我國國內(nèi)最新研究進(jìn)展，闡明了細(xì)胞褐化現(xiàn)狀及其主要機(jī)制與產(chǎn)生原因，提出了抑制褐變的有效對策，以供參考。

關(guān)鍵詞：植物組織培養(yǎng)；褐化現(xiàn)象；抗褐化研究

文章編號：1005-2690（2023）15-0099-03 ? ? ? 中國圖書分類號：S60 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

目前，在一些組織培養(yǎng)中常出現(xiàn)細(xì)胞褐變現(xiàn)象。褐變主要出現(xiàn)在細(xì)胞外植體中，也出現(xiàn)在愈傷細(xì)胞亞代、懸浮細(xì)胞以及原生質(zhì)體培養(yǎng)中。褐變物質(zhì)不但使周圍的植物、細(xì)胞、培養(yǎng)基等均轉(zhuǎn)為棕色，同時抑制多種蛋白質(zhì)，影響培養(yǎng)基正常發(fā)育與分化，嚴(yán)重時可致死。因此，探討在植物組織培養(yǎng)工藝中的褐變問題、機(jī)制和預(yù)防措施，對目前工廠制劑中的植物研究以及植物外組織、原生質(zhì)體、懸浮菌等培養(yǎng)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

褐變可分為酶促褐變和非酶促褐變，一般認(rèn)為主要是由酶促褐變而引起的。酶促褐變依靠蛋白酶、接收器和氧氣3種物質(zhì)。構(gòu)成褐變主要是蛋白質(zhì)，即多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD），其中PPO是最重要的。褐變是一般正常組織細(xì)胞內(nèi)多酚氧化酶活動的主要產(chǎn)物，其通過氧化酚類化合物而產(chǎn)生褐色覺醒物質(zhì)。產(chǎn)生褐變的酶大多是酚類化合物。在一般正常的組織細(xì)胞內(nèi)，化學(xué)物質(zhì)、氧氣等和PPO的結(jié)合不能導(dǎo)致褐變。這主要是因?yàn)樵谝话憬M織細(xì)胞中，多酚主要分布于液泡中，其底物廣泛分布于各種質(zhì)體及細(xì)胞漿中。這些區(qū)域的分布阻礙了底物和多酚接觸，給酶在細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或破壞時到達(dá)底物提供了必要條件。在有氧氣的情形下，酚類首先被氧化喚醒，再經(jīng)過脫水處理和聚合過程，最后產(chǎn)生一種導(dǎo)致褐變的深褐色化合物，并由此導(dǎo)致了褐變。

1 褐化現(xiàn)象產(chǎn)生的原因

1.1 非酶促褐變

非酶促褐變是指由于應(yīng)激障礙或其他不利條件引起的程序性凋亡，或由于壞死引起的細(xì)胞褐變，包括酚類化合物的形成。程序性凋亡可能由多種不利因素引起。采取適當(dāng)措施或愈傷組織適應(yīng)應(yīng)激條件，這些細(xì)胞的褐變消失。

1.2 酶促褐變

酶促褐變是指由苯酚蛋白酶所催化醌類化合物的聚合物在高氧環(huán)境下產(chǎn)生的反應(yīng)進(jìn)程。一般植物細(xì)胞和培養(yǎng)體的褐色由某些植物的酚類化合物和多酚氧化酶大量產(chǎn)生，特別是木質(zhì)植物中。一般在成熟的植株細(xì)胞內(nèi)，因?yàn)榉宇惢衔锖投喾友趸复罅繂为?dú)產(chǎn)生，色素比較穩(wěn)定。

在切除過程中，周圍結(jié)構(gòu)的完整性遭到了嚴(yán)重破壞，同時酚類化合物與多酚氧化酶之間的隔離也受到了損傷，導(dǎo)致大量酚類化合物和多酚氧化酶排出。

另外，多酚氧化酶還將大部分酚類化合物氧化成了土壤棕醌和水。喹諾酮類藥物在酪氨酸蛋白酶等蛋白酶的影響下，和外源植物蛋白聚合，引起生長發(fā)育停止，最后引起細(xì)胞凋亡。

在正常的細(xì)胞中，其受底物、氧和PPO的產(chǎn)生均不會引起細(xì)菌褐變。這是因?yàn)樵诎l(fā)育正常的組織細(xì)胞中，多酚彌散在正常細(xì)菌的液泡中，而PPO則彌散在各種質(zhì)體的正常細(xì)菌胞漿中。這種不同的物理化學(xué)分區(qū)造成了襯底物與PPO的不相似。當(dāng)細(xì)菌表皮層的物理化學(xué)性質(zhì)被干擾或損傷之后，為酶體與PPO接觸創(chuàng)造了條件。在氧氣存在的前提下，酚類化合物就會被氧化成醌類，并和醌類產(chǎn)生了一系列脫水的聚合反應(yīng)，也就隨之產(chǎn)生了暗棕色化合物，最后導(dǎo)致細(xì)胞褐變。

2 影響褐變的因素

2.1 物種及其基因型

草本植物通常較木本植物不易褐變，因?yàn)椴荼局参锿ǔ＞哂休^低濃度的單寧或色素，而酚糖苷為產(chǎn)生木質(zhì)素、單寧和色素的前體，使草本植物不易褐變。例如，浙江楠中的單寧含量愈高，組織培養(yǎng)就愈難，甚至形成的愈傷組織細(xì)胞也易褐變致死。萬壽菊的不同種子會有不同程度的褐變。所以在莖尖上培養(yǎng)的植物褐變程度會因種類而異。類似結(jié)果也發(fā)生在萬壽菊及其他園藝作物上。細(xì)胞色素含量較高的植物在組織培養(yǎng)中更易引起褐變。

褐變的深度和次數(shù)會因植株內(nèi)酚類化合物濃度和酵素活力的差異而不同。木本植物的酚類化合物濃度大于草本植物。在組織培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，草本植物的褐變率較低，而同一株植物不同品種、不同種類的植株褐變率也不同，如浙江楠的莖段易褐變。在實(shí)際研究中，雜交育種后的莖段往往只出現(xiàn)較輕度的褐變，而植株的繁殖和外植體上部分也會褐變，這是在育種過程中發(fā)生錯誤的重要因素。

2.2 外植體生理狀態(tài)

一般褐變隨年齡和組織木質(zhì)化程度的增加而增加，例如在萬壽菊培養(yǎng)中，幼體外植體中醌含量低，而成體外植體中醌含量高。研究人員對24種菊花進(jìn)行莖尖培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，冬春兩季的褐變死亡率較低，但其他季節(jié)的褐變死亡率較高。外植體大小會影響褐變，外植體的衰老程度愈高則外植體木質(zhì)素濃度也愈高，更易產(chǎn)生褐變現(xiàn)象，而成體材料的褐變往往較雛體材料更為顯著。故有的研究者把萬壽菊苗的莖尖切開，接種后褐變程度較輕。但隨著苗齡增加，褐變現(xiàn)象逐步加劇，尤其成熟樹莖尖褐變現(xiàn)象更為嚴(yán)重。外植體的大小主要反映外植體的褐變，小的外植體容易褐變，而大的外植體不容易褐變。一些小萬壽菊品種的試驗(yàn)證明，莖尖5～l0 mm的效果較好。同時，狹縫體積越大，氧化中的多酚越多，褐化效應(yīng)越強(qiáng)。因此，外植體的機(jī)械破壞過程對褐化的形成也有很大影響，并且隨著機(jī)械損傷程度的增加而增加。在浙江楠葉片誘導(dǎo)過程中，整批葉片的褐變率低于多片葉片的褐變率。除了機(jī)械損傷外，所有用于殺菌的生物制劑也會導(dǎo)致外植體變黃。酒精殺菌對外植體的損傷更大，容易導(dǎo)致物種滅絕。不容易發(fā)生褐變的生物體，用氯化汞殺菌后通常不發(fā)生褐變，但用次氯酸鈉殺菌就容易發(fā)生褐變，而且殺菌效率遠(yuǎn)低于次氯化汞[1]。

2.3 培養(yǎng)條件

從野外暴露在自然光下的植物中提取的萬壽菊尖端接種后會變黃。例如，在切割外植體之前的遮陽或分叉有助于減輕褐變，但由于在酚類化合物的合成與氧化過程中，酶系統(tǒng)的部分活力也是由光誘導(dǎo)的。另外，光在組織培養(yǎng)過程中促使酚類產(chǎn)物氧化。而光照條件對菊花葉片分泌的影響，主要有黑暗、漫射光、短晝和長晝。所以，在暗或弱的光照下栽培一段時間有助于降低植株的褐變率。

初級育種品種接種后在黑暗環(huán)境中培養(yǎng)，對褐變有一定的控制作用，但效果遠(yuǎn)不如接種前的預(yù)處理。褐化的原理是整個氧化過程由酶系統(tǒng)控制，酶系統(tǒng)的活性也受光的影響。但必須注意的是，長期的暗培養(yǎng)會降低外植體的活力，甚至引起細(xì)胞凋亡，但是正確的時機(jī)還有待檢驗(yàn)。

溫度對褐變的影響較大，15～25 ℃溫度環(huán)境培養(yǎng)比25 ℃以上培養(yǎng)的褐變較輕。據(jù)相關(guān)研究，在15～25 ℃溫度環(huán)境培育的萬壽菊的褐變比25 ℃以上培育的要低。在7 ℃溫度下培育景寧榕皮尖的褐變比15 ℃和30 ℃溫度下的低，這說明高溫能夠促進(jìn)酚型的氧化，而低溫能夠控制酚型受質(zhì)氧化。多酚氧化酶活力下降，產(chǎn)生了輕度堿褐變。2016年王明華教授等也證實(shí)了低溫環(huán)境對褐變嚴(yán)重的菊科種類有控制褐變的效果。

2.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式

培養(yǎng)基內(nèi)糖的絲氨酸含量過多會導(dǎo)致細(xì)胞褐變。但在同樣含量下，蔗糖對褐變的抑制作用高于葡萄糖。礦物質(zhì)成分影響褐變。在蝴蝶蘭的1代中，若培養(yǎng)基中Fe3＋和Cu2＋的含量越高，則褐變就越明顯，即Fe3＋和Cu2＋都能作為催化劑促進(jìn)多酚和單線態(tài)氧（ROS）反應(yīng)，從而被氧化成醌類。在萬壽菊愈傷組培養(yǎng)基上，由于氮源的配比錯誤可能會導(dǎo)致細(xì)胞褐變。在由萬壽菊愈傷細(xì)胞所誘導(dǎo)的繼代種培育工程中，培養(yǎng)基pH值改變可以導(dǎo)致酚類和酚氧化酶結(jié)合部位的改變，進(jìn)而降低多酚的抗氧化能力。因此，隨著6-BA濃度增加，萬壽菊培養(yǎng)中腋芽外植體的褐變和死亡數(shù)量會增加。在培養(yǎng)基中加入抗氧化物質(zhì)可以有效減少褐變，如在浙江楠愈傷組織培養(yǎng)基中添加抗壞血酸250 mg/L、亞硫酸鈉250 mg/L、檸檬酸5 000 mg/L，可以有效降低褐變；如果將1/2的配合物質(zhì)添加到帶芽槭芽增殖培養(yǎng)基中，可以有效降低污染度和褐變。在蝴蝶蘭無菌苗培養(yǎng)基中加入200 mg/L的谷胱甘肽，對蝴蝶蘭植株的分化生長和控制褐變均有較好的綜合作用；而Vc和硫代硫酸鈉對褐變有較強(qiáng)的抑制作用，并且可控制外植物的生長發(fā)育與分化；高活性碳材料對控制褐變有很強(qiáng)的綜合作用，并對植物分化生長也有一定的抑制作用[2]。

不同的培養(yǎng)方式產(chǎn)生不同程度的褐變。增加愈傷細(xì)胞和培養(yǎng)基接觸上的給氧能力可以控制褐變，降低產(chǎn)生多酚的外植材料周圍的多酚也可以降低褐變率。針對不同的種類，可以控制褐變的培養(yǎng)基方式不同。因此用濾紙或在珍珠巖基質(zhì)培育萬壽菊的效果良好；浙江楠的液體培養(yǎng)基有助于降低外植體的褐變。在萬壽菊培育上，將燒瓶旋轉(zhuǎn)10～15 d并更換新鮮培養(yǎng)基，可以顯著降低褐變率。在桑椹培養(yǎng)中，轉(zhuǎn)移期15 d時褐變率為9％，轉(zhuǎn)移期30 d時褐變率為64％。

3 防止褐變的措施

3.1 選擇適宜的培養(yǎng)基

一是調(diào)整介質(zhì)中無機(jī)離子的種類和濃度。改性誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，未改性誘導(dǎo)培養(yǎng)基效果較好，降低了Browning死亡率。使用改良的介質(zhì)可以減輕褐變現(xiàn)象。二是改變了培養(yǎng)基內(nèi)激素的含量與水平。外源融激素在較低濃度時可降低或引起褐變性。在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑，常用的有抗壞血酸、硫代硫酸鈉、人血白蛋白等。培育工程中，在培養(yǎng)基中加入抗壞血酸可以有效防止細(xì)胞污染。在萬壽菊組織培養(yǎng)中加入抗氧化劑可以有效防止萬壽菊褐變。三是在介質(zhì)中加入吸附劑。對于酚氧化物的吸收必須選擇較低濃度的活性炭，由于活化炭吸附力較強(qiáng)，所以活性炭材料更易于吸收酚氧化物。由于對活性碳材料的吸收沒有選擇性，多酚氧化物的營養(yǎng)物質(zhì)能被迅速吸收。因此，在蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)中，活化碳可以控制蝴蝶蘭生長發(fā)育，但不能將其分離。在組織培養(yǎng)中存在水解多酚，在這種外植體的培養(yǎng)中，多酚會釋放，并在培養(yǎng)基中逐漸變暗，且氧化成醌。多酚和醌之類的化合物控制酶的活力，因而可以控制從外植體中吸收的養(yǎng)分[3]。

3.2 選擇合適的外植體

大量科學(xué)研究證實(shí)，選用適宜的外植體和栽培條件是克服褐變的主要方法。外植體上必須具有強(qiáng)大的分生組織功能。在良好的細(xì)胞再分化和再分化環(huán)境下，外植體增殖旺盛，因此也大大減少了褐變。而在適宜的高溫和全黑暗環(huán)境下，外植體的褐變可明顯減少。經(jīng)研究，外植體的酚氧化在暗培養(yǎng)或150 lx射線強(qiáng)度下被抑制，如在初始芽培養(yǎng)7～42 d，對于易發(fā)生褐變的材料，接種后旋轉(zhuǎn)時間過長、創(chuàng)面周圍醌類增多，會加劇材料的褐變[4]。

3.3 加入抗褐化劑、吸附劑

抗氧化劑與其他抑制劑除了可以有效控制酶促褐變Vc外，同樣是一種多氫氧基的還原產(chǎn)物。一方面，可以滅活多酚氧化酶，控制多酚物質(zhì)氧化過程。另一方面，Vc在酶的催化下可以消耗大量溶解氧，使多酚化合物不會由于缺氧而氧化。在培養(yǎng)基中添加Vc能夠有效避免褐變。因此抗氧化劑的品種與含量對于防止銀杏褐變起關(guān)鍵作用。同時，通過活性炭吸附物和Vc的組合，能夠有效預(yù)防除香蕉莖尖以外植株其余部分的褐變。在繼代培養(yǎng)基中加入Vc 0.2 mg/L也能有效降低愈傷組織褐變率。

常見的吸收物質(zhì)是活性碳塑料和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。其中，活性碳塑料是一種吸附性較好的無機(jī)吸附劑，能夠吸收培養(yǎng)基內(nèi)的有害物質(zhì)，如瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的蛋白質(zhì)、培養(yǎng)體分泌的酚型、蔗糖中經(jīng)高溫消毒的醌類和五-羥甲基糠醛等，并促進(jìn)培養(yǎng)體正常繁殖。在實(shí)際的應(yīng)用環(huán)境中，要注意使用最低濃度的活性碳，以抵抗土壤褐變的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)閷钚蕴嫉奈諞]有選擇性，在吸附物質(zhì)的同時，也會吸收介質(zhì)中的某些物質(zhì)，對誘導(dǎo)外植物的細(xì)胞分化也有一定影響。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是一類獨(dú)特的酚型活性碳吸附劑，是生物化工的研究中酚類化合物和細(xì)胞器分開的保護(hù)物，是一種針對酚類化合物的專用吸附物。結(jié)果顯示，PVP對牡丹花莖中離體心肌細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)褐變有很強(qiáng)的抑制作用，而且隨著含量提高，抑制作用更加突出。但是一些試驗(yàn)也表明，PVP并沒有完全防止褐變，因?yàn)橹仓曛写嬖诓煌姆宇惢衔?，所以PVP也會有不同的分子數(shù)目類型[5]。

4 結(jié)束語

目前，我國對多酚類化合物在活細(xì)胞內(nèi)生物動態(tài)代謝機(jī)制及其對蛋白質(zhì)組成影響等方面的應(yīng)用研究較少。因此，促使人們確定并研究引起褐變的多酚類型，研究其對細(xì)胞有害的生物機(jī)制，從根本上找到合理的解決方案，形成一個完整的體系。

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