通過(guò)I.variabilis-EPSPS?基因轉(zhuǎn)育培育抗草甘膦油菜研究

柳寒

摘 要：本研究利用已有的I. variabilis-EPSPS*轉(zhuǎn)基因油菜資源，以優(yōu)良油菜品種浙油51和早熟高油品系B57為輪回親本，通過(guò)回交轉(zhuǎn)育的方式將I. variabilis-EPSPS*基因分別導(dǎo)入浙油51和B57中，并對(duì)F1群體和獲得的BC2F2群體進(jìn)行抗性鑒定，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入I. variabilis-EPSPS*基因后，植株對(duì)草甘膦均具有一定程度的抗性，其中以B57作為輪回親本回交轉(zhuǎn)育群體抗性表現(xiàn)更好，此研究為培育新型抗草甘膦油菜品種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：油菜；I. variabilis-EPSPS*；抗草甘膦

文章編號(hào)：1005-2690（2023）15-0001-03 ? ? ? 中國(guó)圖書(shū)分類號(hào)：S565.4 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

油菜是我國(guó)重要的油料作物，是世界五大食用油源之一。2021年，我國(guó)油菜播種面積超667萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量達(dá)1 471.35萬(wàn)t，平均產(chǎn)量不足2 250 kg/hm2。油菜田草害是限制油菜產(chǎn)量的重要因素，會(huì)造成常年減產(chǎn)10％～15％，嚴(yán)重時(shí)達(dá)到20％[1]。

傳統(tǒng)栽培模式中人工除草不僅耗費(fèi)勞力，還會(huì)增加種植成本。施用選擇性除草劑雖能達(dá)到一定效果，但由于油菜田中雜草種類繁多，往往難以達(dá)到理想效果。因而培育和推廣廣譜性抗除草劑油菜品種十分必要，不僅可以降低除草成本，還能增加產(chǎn)量和總體效益。

草甘膦是目前應(yīng)用最廣泛的廣譜性除草劑之一，其作用靶標(biāo)為莽草酸路徑中的關(guān)鍵酶5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS），具有除草效果好、殘留量低、安全性高等優(yōu)點(diǎn)。隨著對(duì)epsps基因應(yīng)用系統(tǒng)的不斷研究，一系列轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜新品種應(yīng)運(yùn)而生，并在多國(guó)取得了商業(yè)生產(chǎn)證書(shū)。這些品種的推廣將會(huì)嚴(yán)重影響我國(guó)油菜在國(guó)際油菜市場(chǎng)中的地位。

非敏感EPSPS合酶基因I. variabilis-EPSPS*是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)從放線菌屬變異居白蟻菌中克隆到的草甘膦抗性基因[2]。該基因編碼的蛋白不具有CP4-EPSPS專利保護(hù)的4條保守序列，但保留了對(duì)草甘膦較高的耐受性[3]。利用I. variabilis-EPSPS*基因創(chuàng)制的水稻轉(zhuǎn)化體可以耐受8 400 g/hm2高劑量的草甘膦，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[4]。

本研究利用已有的I. variabilis-EPSPS*轉(zhuǎn)基因油菜資源，利用回交轉(zhuǎn)育的方式將I. variabilis-EPSPS*基因?qū)雰?yōu)良的油菜新品種或者新品系中，培育新型的抗草甘膦油菜品種，期望為我國(guó)油菜田的雜草治理提供新的解決方案。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)方法和技術(shù)路線

本試驗(yàn)技術(shù)路線如圖1所示。其中，甲HX6由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，將改造載體pCAMBIA1300-I. variabilis-EPSPS?導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜受體甲9707中獲得。所用的載體攜帶1.3 kb的I. variabilis-EPSPS?目的基因表達(dá)盒，其5端連有228 bp的葉綠體定位信號(hào)肽（CTP）和100 bp的UTR序列。

本研究以甲HX6為父本，與浙油51和早熟高油品系B57雜交獲得F1后，以浙油51和B57作為輪回親本回交2代后再自交1代，分別獲得耐除草劑轉(zhuǎn)基因油菜新材料GR51和GR57。浙油51（國(guó)審油2013017），連續(xù)多年被列為浙江省油菜主導(dǎo)品種；B57是近年來(lái)篩選出的早熟高油品系，含油量超過(guò)50％，其生長(zhǎng)情況如圖2所示（同一時(shí)期播種）。

1.2 抗除草劑植株檢測(cè)

待植株生長(zhǎng)至4～5葉期時(shí)，取單株幼嫩葉片，利用CTAB法提取葉片DNA，利用I.variabilis-EPSPS?基因特異引物（PP1：CTCAGGGCTCTTGGCGCTGAG

AT；PP2：TGCAATGGCCTCGGGGTGATAAC）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度971 bp。

1.3 抗性鑒定

溫室抗性鑒定：將41％草甘膦異丙胺鹽分別稀釋100、200、300倍，用噴壺均勻噴灑，每個(gè)濃度為3次重復(fù)，噴施7 d和14 d后觀察結(jié)果。

田間抗性鑒定：5～6葉期進(jìn)行除草劑噴施試驗(yàn)。設(shè)3個(gè)噴施濃度，分別為中量（41％草甘膦異丙胺鹽2 250 mL/hm2，大約稀釋200倍，0.5％濃度）、中量的2倍量（41％草甘膦異丙胺鹽4 500 mL/hm2，大約稀釋100倍，1％濃度）、中量的4倍量（41％草甘膦異丙胺鹽9 000 mL/hm2，大約稀釋50倍，2％濃度），每個(gè)濃度3次重復(fù)，分別設(shè)置對(duì)照，噴施10 d后觀察植株生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1 親本種植及F1種子的獲得

將抗除草劑轉(zhuǎn)基因株系甲HX6與浙油51和B57分別播在玻璃溫室中。待開(kāi)花初期對(duì)甲HX6套袋，防止花粉外散。

做雜交時(shí)，取甲HX6花粉涂抹到浙油51和B57去雄花器官柱頭上。待柱頭膨大雜交成功后，立即拔除甲HX6轉(zhuǎn)基因植株。最終獲得2份F1材料，分別為51 F1和57 F1。

2.2 F1種植、溫室抗性鑒定及BC1F1種子的獲得

將51 F1和57 F1播于50孔穴盆中，置于玻璃溫室中。待生長(zhǎng)至5～6葉期時(shí)，噴施不同濃度的除草劑（農(nóng)達(dá)41％異丙胺鹽制劑），以親本B57為對(duì)照（CK），觀察比較抗性情況，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，對(duì)照CK噴施除草劑7 d后生長(zhǎng)明顯受到抑制，51 F1和57 F1均表現(xiàn)出一定的抗性。14 d后，對(duì)照（CK）全部枯萎死亡，51 F1和57 F1雖葉片出現(xiàn)黃化，但仍存活，同時(shí)57 F1總體生長(zhǎng)情況好于51 F1。選擇生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)良好的51 F1和57 F1各6株種植于溫室中，開(kāi)花初期套袋。有足夠花粉時(shí)取花粉涂抹到浙油51和B57去雄花器官柱頭上。待柱頭膨大雜交成功后立即拔除51 F1和57 F1植株。最終獲得2份BC1F1材料，分別為51 BC1F1和57 BC1F1。

2.3 BC1F1單株抗除草劑基因檢測(cè)及BC2F1的獲得

將51 BC1F1和57 BC1F1分別播于50孔穴盆中。待生長(zhǎng)至4～5葉期時(shí)，取單株幼嫩葉片提取DNA，利用I.variabilis-EPSPS?基因特異引物分別對(duì)51 BC1F1和57 BC1F1的各個(gè)單株進(jìn)行檢測(cè)，獲得含有目標(biāo)抗性基因的植株21株和14株。BC1F1單株抗性基因檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。分別移栽10株BC1F1種植在玻璃溫室中，與浙油51和B57再進(jìn)行1次回交，獲得BC2F1種子。

2.4 BC2F2的獲得

將51 BC2F1和57 BC2F1分別播于50孔穴盆中，每孔1粒種子。長(zhǎng)大后取葉片提取DNA進(jìn)行抗除草劑基因檢測(cè)，保留有條帶的單株移栽于溫室中，待開(kāi)花期去頂套袋自交，只保留套袋花絮，其余花絮全部打掉。收自交種51 BC2F2和57 BC2F2。

2.5 BC2F2農(nóng)達(dá)噴施試驗(yàn)及篩選

將51 BC2F2和57 BC2F2種植于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊渡轉(zhuǎn)基因基地，5～6葉期進(jìn)行除草劑噴施

試驗(yàn)，由于天氣原因，錯(cuò)過(guò)了最佳噴藥時(shí)期。抽薹期進(jìn)行除草劑噴施試驗(yàn)。按照中量、中量的2倍量和中量的4倍量進(jìn)行噴施，每個(gè)濃度3次重復(fù)，分別以浙油51 和B57作為對(duì)照進(jìn)行抗性比較。

噴施10 d后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)育的含I.variabilis-EPSPS?基因的植株抗性明顯，尤其是B57作為親本轉(zhuǎn)育的抗性材料，即使是中量的4倍量噴施，藥害也不是很明顯。作為對(duì)照的2個(gè)受體親本浙油51和B57均葉片發(fā)黃，最大濃度處理的植株葉片已經(jīng)開(kāi)始枯萎。總體來(lái)看，2個(gè)轉(zhuǎn)育材料均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，表現(xiàn)良好。中量的2倍量噴施結(jié)果如圖5所示。

3 結(jié)論與建議

本研究以華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的I. variabilis-EPSPS*轉(zhuǎn)基因抗草甘膦油菜甲HX6作為父本，與浙油51和早熟高油品系B57雜交獲得F1后，以浙油51和B57作為輪回親本進(jìn)行連續(xù)回交后再自交進(jìn)行篩選，以期獲得具有草甘膦抗性的新材料。

目前，回交轉(zhuǎn)育工作已進(jìn)行至BC3代，獲得了BC2F2代群體。在對(duì)BC2F2群體的抗性鑒定和篩選中發(fā)現(xiàn)，受體親本不同，其抗性會(huì)存在較大差異。B57背景轉(zhuǎn)育材料抗性略優(yōu)于浙油51背景轉(zhuǎn)育材料。未轉(zhuǎn)育的受體親本對(duì)照對(duì)草甘膦的反應(yīng)也存在差異，浙油51較B57敏感，噴施后癥狀表現(xiàn)更快、更明顯。草甘膦又名N-（磷酸甲基）甘氨酸，是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型有機(jī)磷類除草劑，推測(cè)不同受體間對(duì)于草甘膦的敏感性差異很可能與不同材料間的磷利用效率有關(guān)。

經(jīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部備案，有2份材料（編號(hào)分別為GR51和GR57）已經(jīng)進(jìn)入中間試驗(yàn)階段，后續(xù)將按照中間試驗(yàn)規(guī)劃對(duì)上述2個(gè)材料進(jìn)行評(píng)價(jià)，開(kāi)展轉(zhuǎn)基因耐除草劑油菜GR51和GR57對(duì)靶標(biāo)除草劑草甘膦的耐受性試驗(yàn)和對(duì)田間常用的其他除草劑（非靶標(biāo)）的影響等內(nèi)容，同時(shí)考察目標(biāo)性狀在不同世代之間的遺傳穩(wěn)定性、生存競(jìng)爭(zhēng)能力及農(nóng)藝性狀等。

參考文獻(xiàn)：

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