基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究葛根芩連湯異病同治的機(jī)制研究

王 鑫 劉旭妍 蔣廣祥 侯來(lái)永 尹 玨※ 鄭 爽

異病同治是傳統(tǒng)的中醫(yī)理論,即不同的疾病出現(xiàn)相同的病因病機(jī)可采用相同的治療方法。在西醫(yī)知識(shí)體系中往往是專病專治,很少使用異病同治的治療思路。潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征、2型糖尿病等都有特定的西醫(yī)治療方案,但是在中醫(yī)治療可以采用相同的治療方法,達(dá)到治療不同疾病的目的。

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的炎癥性腸道疾病。中醫(yī)治療UC可緩解癥狀,且預(yù)防復(fù)發(fā)有較好的臨床療效。Fan Y、洪順?lè)嫉萚1,2]在臨床研究中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用葛根芩連湯治療潰瘍性結(jié)腸炎可進(jìn)一步提高療效。腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種臨床常見(jiàn)病,可顯著影響患者生活質(zhì)量。中醫(yī)學(xué)中,IBS屬于腹痛、泄瀉范疇,Li C Y[3]的研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)治療IBS療效確切,且效果優(yōu)于單純的西藥治療。司徒淳羽、袁兵等[4,5]在臨床研究中應(yīng)用葛根芩連湯治療IBS,發(fā)現(xiàn)治療組生活質(zhì)量評(píng)分等明顯優(yōu)于對(duì)照組。2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)是一種代謝性疾病,以高血糖為主要特征。在2型糖尿病的中醫(yī)治療中多種處方均有不錯(cuò)的效果,與西醫(yī)治療結(jié)合更容易得到患者的認(rèn)可,有見(jiàn)效快、副作用小等多重優(yōu)勢(shì)。Yuhang Ren等[6,7]在研究中發(fā)現(xiàn),在西醫(yī)常規(guī)治療基礎(chǔ)上聯(lián)合葛根芩連湯治療2型糖尿病可顯著提高治療有效率。

葛根芩連湯源自張仲景《傷寒論》第34條:“太陽(yáng)病,桂枝證……葛根黃芩黃連湯主之”[8]。該方由葛根、黃芩、黃連、甘草四味藥組成,屬清熱藥,可解表清里,主治身熱下利,胸脘煩熱,口感作渴,喘而汗出等證。劉蓮萱[9]等基于藥物成分和藥效關(guān)聯(lián)Q-maker研究發(fā)現(xiàn)葛根素、黃芩素、黃連堿等14個(gè)成分是葛根芩連湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。池美華等[10,11]研究發(fā)現(xiàn),葛根芩連湯被應(yīng)用于消化系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等多種疾病。因此,葛根芩連湯是異病同治的典型用藥,現(xiàn)有研究重點(diǎn)多在“葛根芩連湯治療2型糖尿病”上,對(duì)于其異病同治的原理與機(jī)制研究相對(duì)較少。

本研究旨在通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究葛根芩連湯異病同治的分子學(xué)基礎(chǔ),為葛根芩連湯治療多種不同疾病提供理論支持,同時(shí)結(jié)合葛根芩連湯對(duì)多種疾病臨床研究的結(jié)果,總結(jié)葛根芩連湯的療效。

1.方法

1.1 獲取葛根芩連湯有效成分及靶點(diǎn)

運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)檢索葛根芩連湯中葛根、黃芩、黃連、甘草四味中藥的所有化學(xué)成分。篩選口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性指數(shù)(drug-like,DL)≥0.18的化合物及其作用靶點(diǎn)。利用Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TCMSP獲取的靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)一。

1.2 獲取潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征及2型糖尿病和葛根芩連湯的共有靶點(diǎn)

通過(guò)GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)搜索3個(gè)疾病的相關(guān)靶點(diǎn),篩選關(guān)聯(lián)度大于1的基因靶點(diǎn)。對(duì)藥物靶點(diǎn)與篩選后的疾病靶點(diǎn)取交集,得到潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征及2型糖尿病和葛根芩連湯的共有靶點(diǎn)。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以“1.1”和“1.2”得到的有效成分、共有靶點(diǎn)、藥物為節(jié)點(diǎn),導(dǎo)入CytoScape3.8.1軟件中構(gòu)建“葛根芩連湯-有效成分-共有靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)模型。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將“1.2”中得到的共有靶點(diǎn)輸入至String網(wǎng)站構(gòu)建并繪制蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系圖(PPI),設(shè)置confidence score值為0.900,將PPI網(wǎng)絡(luò)以TSV格式導(dǎo)入CytoScape3.8.1軟件中進(jìn)行可視化處理。

1.5 生物學(xué)功能及通路富集分析

用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)共有基因進(jìn)行基因本體分析(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書分析(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)。

1.6 篩選通路的關(guān)鍵靶標(biāo)

將關(guān)鍵通路靶點(diǎn)分別導(dǎo)入String 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)。用Cytoscape3.6.0軟件進(jìn)行Network Analysis網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?根據(jù)度值(Degree)篩選出關(guān)鍵靶標(biāo)。

2.結(jié)果

2.1 葛根芩連湯中有效成分篩選及靶點(diǎn)的獲取

將葛根芩連湯中葛根、黃芩、黃連、甘草4味中藥上傳至TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù),按照OB≥30%,且DL≥0.18的篩選標(biāo)準(zhǔn),葛根芩連湯中有146個(gè)活性化合物,去重后共獲得242個(gè)藥物作用靶點(diǎn)。見(jiàn)表1。

表1 葛根芩連湯藥物作用靶點(diǎn)TOP50

2.2 葛根芩連湯治療潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征和2型糖尿病的共有靶點(diǎn)獲取

通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)搜集UC、IBS、T2DM 3種疾病的相關(guān)靶點(diǎn),獲得UC靶點(diǎn)4852個(gè),IBS靶點(diǎn)3166個(gè),T2DM靶點(diǎn)8806個(gè),篩選Relevance score≥1的靶點(diǎn)之后,UC靶點(diǎn)188個(gè),IBS靶點(diǎn)1048個(gè),T2DM靶點(diǎn)4500個(gè)。疾病靶點(diǎn)與葛根芩連湯的242個(gè)靶點(diǎn)取交集,最后得到共有靶點(diǎn)33個(gè),并繪制Venn圖。見(jiàn)圖1,表2。

圖1 葛根芩連湯與UC、IBS、TDM交叉Veen圖

表2 葛根芩連湯與UC、IBS、TDM重合基因靶點(diǎn)

2.3 葛根芩連湯治療UC、IBS、T2DM網(wǎng)絡(luò)圖

將“2.1”及“2.2”得到的有效成分及靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件后,構(gòu)建“中藥-有效成分-共有靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。見(jiàn)圖2。

圖2 葛根芩連湯-有效成分-共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 對(duì)共有靶點(diǎn)進(jìn)行分析

將33個(gè)共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),構(gòu)建共有靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)。以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape軟件,用“Analyze Network”功能計(jì)算各靶點(diǎn)的度值(Degree),平均值為20.61,排在前4位的蛋白分別是AKT1(Degree=30),TNFRSF1A(Degree=23),HMOX1(Degree=23),MMP2(Degree=23)。見(jiàn)圖3。

圖3 葛根芩連湯治療UC、IBS、T2DM共有靶點(diǎn)蛋白相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 葛根芩連湯與UC、IBS及T2DM交集基因GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

2.5.1 GO分析

GO富集分析結(jié)果顯示,生物過(guò)程(Biological Process,BP)20個(gè),主要涉及蛋白質(zhì)磷酸化,炎癥反應(yīng)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移等。見(jiàn)圖4。

圖4 葛根芩連湯治療UC、IBS、T2DM的GO功能富集分析

2.5.2 KEGG分析

KEGG信號(hào)通路分析獲得P<0.01、最小計(jì)數(shù)為3且富集因子>1.5的通路16條,包括癌癥通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE信號(hào)通路等。見(jiàn)圖5。

圖5 葛根芩連湯治療UC、IBS、T2DM的KEEG富集分析

3.討論

在臨床治療中,西醫(yī)通過(guò)對(duì)相關(guān)指標(biāo)的收集對(duì)患者疾病進(jìn)行診斷,進(jìn)而按照相應(yīng)的治療規(guī)范進(jìn)行治療;區(qū)別于西醫(yī),中醫(yī)更關(guān)注辨證論治。不同的疾病在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,可出現(xiàn)相同的病機(jī),從而采取相同的治療方法,即異病同治。

在本研究中,我們同時(shí)對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行探索,通過(guò)TCMSP的篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè),并與潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征、糖尿病靶點(diǎn)進(jìn)行映射,最終得到了33個(gè)有效靶點(diǎn)。有效靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的活性成分排名前三的依次是槲皮素(quercetin)、異黃酮(formononetin)、山柰酚(kaempferol)。這三種成分均為黃酮類化合物,可能是葛根芩連湯發(fā)揮異病同治的主要成分。黃連、黃芩、甘草三味中藥中都包含槲皮素。槲皮素有多重生物活性,可發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗癌及抗炎作用[12],可有效抑制結(jié)腸炎性損傷。槲皮素可抑制HMGB1和TLR4蛋白和基因的表達(dá)抗動(dòng)脈粥樣硬化[13],可發(fā)揮降脂作用,調(diào)節(jié)膽固醇含量[14]。另一方面槲皮素可以降低甘油三酯的水平,提高超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶等酶的活性[15]。Jeong SM等[16]的研究中發(fā)現(xiàn)槲皮素通過(guò)AGE-RAGE信號(hào)通路發(fā)揮作用,可以有效改善2型糖尿病的高糖高脂血癥。Sotniknova R[17]發(fā)現(xiàn)黃酮化合物有抗氧化特性,且槲皮素抗氧化能力強(qiáng),其研究證明槲皮素衍生物可有效抑制結(jié)腸炎癥損傷。異黃酮與山茶酚分別存在于葛根和甘草中。異黃酮具有抗癌與抗心血管疾病的作用[18],可抑制NF-kB信號(hào)通路的激活,降低黏附分子mRNA的水平和蛋白表達(dá)量,從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[19]。山柰酚有抗癌、降低血糖作用[20],可增強(qiáng)抑癌基因活性,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;Park M Y[21]認(rèn)為山柰酚是一種有效的抗炎藥,對(duì)結(jié)腸黏膜有保護(hù)作用;同時(shí)山柰酚被認(rèn)為是新一代用于2型糖尿病治療的胰島素增敏劑[22],可改善糖尿病內(nèi)皮功能障礙,有效預(yù)防2型糖尿病并發(fā)癥的產(chǎn)生與發(fā)展。以上3種物質(zhì)均屬于黃酮類化合物,有抗氧化和抗炎作用,可對(duì)UC和IBS起到治療作用,其中槲皮素與山柰酚可有效作用于T2DM。通過(guò)抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化及AGE-RAGE等作用進(jìn)行干預(yù),發(fā)揮異病同治作用。

對(duì)共有靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治霾⒑Y選出核心靶點(diǎn)12個(gè),排名靠前的依次是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)、白細(xì)胞介素-8(CXCL-8)、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)。陳翠連等[23]在研究炎癥性腸病與心血管疾病的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著必不可少的作用,持續(xù)的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化水平升高。同時(shí)VEGFA可促進(jìn)新血管生成,與動(dòng)脈粥樣硬化通路有著密不可分的關(guān)系。Zhen Y等[24]發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素參與腸易激綜合征的病理過(guò)程,其中CXCL-8是IBS的重要促炎因子,可誘發(fā)和促進(jìn)腸道黏膜炎性反應(yīng)。CXCL-8還可介導(dǎo)IL-1、TNF-α等炎性因子的表達(dá),炎性因子與腸道菌群相互作用,加快IBS病理進(jìn)程。循環(huán)中CXCL-8水平的升高與T2DM有一定相關(guān)性,CXCL-8升高可以診斷炎癥狀態(tài)和代謝較差的患者[25]。AKT是胰島素信號(hào)通路下游的效應(yīng)因子,可被胰島素、胰島素生長(zhǎng)因子激活[26]。AKT分子上調(diào),通過(guò)多種通路的聯(lián)合作用最終達(dá)到降糖的目的,改善胰島素抵抗。此外PI3K-AKT信號(hào)通路,參與促炎性因子的釋放[27],同時(shí)可激活NF-kB,介導(dǎo)腸道炎癥反應(yīng)和黏膜損傷[28],當(dāng)此通路過(guò)度活化時(shí)會(huì)誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎癌變[29]。

綜上所述,葛根芩連湯治療疾病是通過(guò)動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥通路、AGE-RAGE通路發(fā)揮作用。VEGFA、CXCL-8及AKT1在發(fā)揮本身生化作用的同時(shí),通過(guò)激活相關(guān)通路的其他靶點(diǎn)聯(lián)合作用起到相關(guān)作用,臨床治療效果十分顯著。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)葛根芩連湯治療潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征及2型糖尿病的共同作用機(jī)制進(jìn)行了探討,為異病同治提供了藥理機(jī)制層面的理論支持,為臨床應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù),也為進(jìn)一步的通路研究、機(jī)制研究的具體實(shí)驗(yàn)提供了參考。本研究只是在分子層面進(jìn)行預(yù)測(cè),尚未進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證,仍需提供相關(guān)理論依據(jù)做出進(jìn)一步驗(yàn)證。