浙江省金華地區(qū)人群PTPN22-1123GC多態(tài)性在類風濕關(guān)節(jié)炎易感性中的意義

胡益飛 張麗英 盧麗華

1 浙江大學醫(yī)學院附屬金華醫(yī)院檢驗科,浙江省金華市 321000; 2 金華市文榮醫(yī)院檢驗科

類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以慢性進行性關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖咝约膊?該病多見于中老年女性群體,男∶女的發(fā)病率為1∶(2～3)[1]。近年來,隨著對RA發(fā)病機制的深入研究,不少研究者表示RA的發(fā)病與遺傳因素有關(guān),且在孿生子弟患病率和家系調(diào)查中發(fā)現(xiàn),遺傳因素在RA易感性中所占據(jù)的比重大約為60%,其中酪氨酸磷酸酶非受體型22蛋白(PTPN22)作用最為關(guān)鍵[2]。PTPN22是組織相容性復合物以外與自身免疫性疾病密切相關(guān)的最強風險因素之一。近年來,國內(nèi)大量研究報道指出PTPN22-1123GC與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),這使得學界開始關(guān)注起PTPN22-1123GC與RA易感性之間的關(guān)聯(lián)性[3],但現(xiàn)有研究成果并無關(guān)于浙江省金華地區(qū)人群的研究報道,其是否與浙江省金華地區(qū)人群相符合是我地區(qū)RA研究的重要熱點。我課題組選取浙江大學醫(yī)學院附屬金華醫(yī)院接診的RA患者選取50例作為病例組,同期健康體檢人群中選取20例健康人員作為對照組,對其PTPN22-1123GC基因多態(tài)性進行檢測,具體情況報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 自浙江大學醫(yī)學院附屬金華醫(yī)院2020年1—5月接診的RA患者中選取50例作為病例組,其中女35例,男15例,年齡27～68歲,平均年齡(48.62±10.87)歲。另從同期健康體檢人群中選取20例健康人員作為對照組,其中女14例,男6例,年齡25～66歲,平均年齡(48.15±10.42)歲。兩組對象性別、年齡比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。入組對象均經(jīng)過倫理委員會批準同意,且獲得了患者或家屬的同意。

1.2 選擇標準 (1)納入標準:根據(jù)美國風濕學會在1987年制定的診斷標準確診,即每日晨僵持續(xù)時間達到了1h以上,病程至少有6周;表現(xiàn)出掌指、腕關(guān)節(jié)、近指關(guān)節(jié)腫脹特點,病程至少有6周;表現(xiàn)出三個或者三個以上關(guān)節(jié)腫脹,病程至少為6周;檢查發(fā)現(xiàn)有皮下結(jié)節(jié);表現(xiàn)出對稱性關(guān)節(jié)腫脹,病程至少有6周;手X線有明顯改變,至少表現(xiàn)出關(guān)節(jié)間隙與骨質(zhì)疏松狹窄;類風濕性因子呈現(xiàn)陽性。滿足上述7個條件中的任意4項。且為浙江省金華地區(qū)本地人員;知情同意。(2)排除標準:合并有肝、腎、心、肺等嚴重臟器功能障礙性疾病以及其他自身免疫性疾病。

1.3 方法

1.3.1 血標本采集:每例入組對象各取2.0ml靜脈血,將其置于2% EDTA抗凝管內(nèi),并放置于冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?以便后續(xù)檢測需求。

1.3.2 全血中基因組DNA的提取:將抗凝管血樣轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi),向其中加入10×TE 2.0ml,充分震蕩,并放置于離心機上進行10min離心處理,拋棄上清液后,再次加入2～3ml 10×TE,再次充分震蕩,再次進行10min離心處理。重復完成上述步驟2～5次,觀察紅細胞沉淀情況,若發(fā)現(xiàn)其沉淀明顯發(fā)白即可。將沉淀物加入1ml Lysis buffer中,隨后繼續(xù)加入蛋白酶K液,放置于37℃的條件進行裂解處理。在每管中分別加入飽和酚1ml,持續(xù)進行5min離心處理,將上清液轉(zhuǎn)移到干凈離心管內(nèi),再次加入相同體積的酚,再次實施5min離心處理,根據(jù)結(jié)果還可反復實施,直至獲得滿意效果。取上清液后,向其中加入氯仿:異戊醇(比例24∶1),對其進行5min離心處理。繼續(xù)加入1/10體積NaOAc(3M)和冰無水乙醇,將其放置于-20℃的條件沉淀。取出后放置于4℃條件下持續(xù)進行20min離心處理,繼續(xù)給予70%乙醇溶解沉淀,按照上述方法繼續(xù)離心處理,隨后加入1×TE進行溶解。

1.3.3 DNA的定量與質(zhì)量鑒定:以高壓去離子水來作為本次研究的空白對照。取DNA母液5μl,向其中加入去離子水直至刻度500μl,充分混合后將其及時轉(zhuǎn)移到比色杯內(nèi)。對照與樣品分別放置于分光光度計中,取260nm、280nm光度時核酸濃度。若兩個波長的結(jié)果在1.6～1.8,即表示有較高純度。將獲取的DNA樣品,以0.1×TE充分稀釋到100ng/ml之后,將其放置于-20℃條件下保存。

1.3.4 PCR(聚合酶鏈反應)擴增:經(jīng)由NCBI對IL-10基因序列進行查詢,并基于查詢結(jié)果完成序列引物設(shè)計,配合Premier5.0軟件確定PTPN22-1123G/C位點引物。本次擴增方法主要根據(jù)試劑盒說明書要求完成操作。

1.3.5 電泳鑒定:對上述PCR產(chǎn)物進行抽取,并將其液樣充分混合,通過2.0%瓊脂糖實施凝膠電泳處理,作用時間設(shè)定為25min,電壓設(shè)定為120V。在凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果,并在紫外光下對PCR擴增后DNA大小進行檢查。PCR產(chǎn)物均通過Gold View染色處理,系統(tǒng)下觀察擴增條帶。選取部分PCR產(chǎn)物將其送檢獲得測序結(jié)果。對PCR反應產(chǎn)物準確性進行驗證,并分別運用不同的PCR產(chǎn)物實施測序,確定陽性對照組,并配合滅菌雙蒸水作為空白對照組,保障PCR質(zhì)控。

1.3.6 限制性片段長度多態(tài)性分析各位點基因型:根據(jù)上述PCR產(chǎn)物來進行基因分型處理,在2.0%瓊脂糖凝膠電泳,對酶切產(chǎn)物進行切片處理,并配合Gold View染色,并觀察成像結(jié)果,結(jié)合酶切條帶對基因型進行判定。選取PTPN22基因-1123G/C位點基因型產(chǎn)物送檢測序,最后獲得同源性分析結(jié)果。

1.4 觀察指標 對兩組對象PTPN22-1123等位基因與基因型頻率進行統(tǒng)計對比,同時整理患者性別、年齡、免疫增強劑的歷史、病毒感染、遺傳史基本情況。

1.5 統(tǒng)計學方法 運用統(tǒng)計學軟件SPSS22.0行數(shù)據(jù)的分析處理,連續(xù)變量正態(tài)分布以表示,采用獨立樣本t檢驗,不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù))即M(P25,P75)表示,采用Mann-WhitneyU檢驗。行t檢驗;以行(%)表示計數(shù)資料,行χ2檢驗。本研究針對基因型頻率均通過直接計數(shù)法來實施計算,通過對各基因型分布情況進行檢驗,并通過年齡、性別等混雜基因?qū)嵤┱{(diào)整,組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗,計算OR值和95%CI。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義

2 結(jié)果

兩組對象兩種等位基因的頻數(shù)分布以及基因型頻數(shù)比較,GG、CC基因型頻率分布無差異(P>0.05),GC基因型頻率分布存在差異性(P<0.05)。對兩組三種基因型進行雙尾χ2檢驗,結(jié)果顯示有統(tǒng)計學差異(χ2=6.523,P=0.036),即表明 PTPN22-1123的SNPs與RA易感染之間存在密切相關(guān)性。通過對不同基因型進行進一步分析,結(jié)果顯示,雜合子GC型會導致患者RA發(fā)病風險增加1.966倍,而純合子CC型則不會導致RA發(fā)病風險增加。同時G、C等位基因在兩組中的雙尾 χ2檢驗結(jié)果也表現(xiàn)出差異性,其中攜帶C等位基因會導致RA的發(fā)病風險增加1.584倍。見表1。

表1 兩組對象中PTPN22-1123等位基因與基因型頻率比較[n(%)]

3 討論

目前,關(guān)于RA的發(fā)病機制尚不明確,但普遍認為RA的是一種復雜性疾病,表現(xiàn)出多基因多位點之間的共同作用。有研究者通過對孿生雙胞胎進行跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn),同卵雙生RA的疾病共發(fā)率達到了15%,而通過定量遺傳方法進行RA遺傳度評價,其結(jié)果達到了60%,即表明在RA發(fā)病中遺傳因素發(fā)揮了非常關(guān)鍵的作用[4]。

PTPN22是處于1號染色體短臂(lp13.3—13.1)的一種基因蛋白。近期有研究者發(fā)現(xiàn),LYP與多種銜接分子相互結(jié)合,可導致T細胞的活化受到影響,故該基因被視為免疫性疾病的易感重要基因,包括RA、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[5]。有研究者選取地中海RA群體對其基因型進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),其PTPN22 1858C>T SNP與RA發(fā)生發(fā)展表現(xiàn)出相關(guān)性[6-7]。但同時西班牙地區(qū)通過RA群體PTPN22基因型檢測,并未觀察到有任何異常情況[8-10]。這就表明PTPN22-1123表現(xiàn)出一定的地域差異特征。本研究選取浙江省金華地區(qū)RA群體,對其PTPN22-1123多態(tài)性進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照組GG、GC、CC三種基因型分布為55.00%、35.00%、10.00%,G、C等位基因分布為75.00%、30.00%。但在病例組中GG、GC、CC三種基因型分布為38.00%、50.00%、12.00%,G、C等位基因分布為64.00%、36.00%。該結(jié)果與日本GG、GC、CC三種基因型分布為15.00%、70.00%、15.00%,G、C等位基因分布為35.00%、65.00%,分布情況存在較大差異性(P<0.05),但與上海(GG、GC、CC三種基因型分布為36.00%、51.00%、13.00%,G、C等位基因分布為60.00%、40.00%)、廣東(GG、GC、CC三種基因型分布為40.00%、55.00%、5.00%,G、C等位基因分布為65.00%、35.00%)[11-12]等地區(qū)無明顯差異(P>0.05)。本研究對比發(fā)現(xiàn),雜合子GC型基因頻率分布會導致RA發(fā)病風險增加,即表明通過對PTPN22-1123GC多態(tài)性進行測定,更利于RA易感性的測定。該結(jié)果與文獻結(jié)果一致[13],有研究者選取廣東RA人群進行PTPN22-1123多態(tài)性測定,結(jié)果顯示,其GC基因型、C等位基因表現(xiàn)出顯著差異,并認為GC型的測定更利于RA疾病的預防控制。但關(guān)于GC基因?qū)A易感性增強的具體機制尚不明確,推測可能是由于LYP經(jīng)由C端富含脯氨酸基序以及CSK蛋白絡(luò)氨酸激酶的SH3結(jié)構(gòu)域連接所致,其可使得TCR信號傳導發(fā)生改變,造成機體免疫平衡發(fā)生改變[14-16]。

綜上所述,針對浙江省金華地區(qū)人群,對其進行PTPN22-1123 GC多態(tài)性進行測定,可實現(xiàn)對RA易感性的早期判斷,為臨床診斷與預防提供客觀依據(jù)。