適配體電化學(xué)發(fā)光傳感器用于靈敏檢測(cè)氯霉素

安 靜，肖珩玥，賀彰瑾，魯理平

（北京工業(yè)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)系，北京 100124）

抗生素在生態(tài)系統(tǒng)中的持續(xù)積累已造成嚴(yán)重的環(huán)境危害，抗生素濫用引起了全世界的廣泛關(guān)注［1-2］?？股氐牟划?dāng)和過度使用導(dǎo)致其在環(huán)境和食品樣本中積累［3］。氯霉素（CAP）是一種高效的廣譜抗生素，被廣泛用于治療動(dòng)物及人體受到的各種敏感菌感染［4］。然而，異常攝入CAP 可導(dǎo)致一系列嚴(yán)重的環(huán)境危害，造成動(dòng)物和人體內(nèi)的抗生素殘留，對(duì)造血系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，如再生障礙性貧血和白血病等［5］。因此，開發(fā)準(zhǔn)確、快速檢測(cè)痕量CAP的方法具有重要意義。

傳統(tǒng)的CAP 檢測(cè)方法側(cè)重于高效液相色譜（HPLC）［6］、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）［7］、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）［8］和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）［9］。然而，上述技術(shù)在大型儀器、復(fù)雜操作和技術(shù)人員上的要求限制了其在簡(jiǎn)單快速監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用［10］。近年來，基于免疫反應(yīng)［11-12］和適配體化學(xué)［13-14］的電化學(xué)傳感技術(shù)在CAP 快速、靈敏檢測(cè)中受到了廣泛關(guān)注。核酸適配體是指通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX），在隨機(jī)寡核苷酸序列的文庫中篩選得到的能與各種目標(biāo)物進(jìn)行高親和力、高特異性識(shí)別的單鏈DNA 或RNA 分子［15-16］。與傳統(tǒng)方法相比，由于適配體易于修飾且與靶標(biāo)具有高親和力及高結(jié)合力，基于適配體構(gòu)建的氯霉素生物傳感器具有更高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性以及更低的檢出限。量子點(diǎn)（QDs）一般由無機(jī)核和存在于核表面的有機(jī)基團(tuán)組成，是由少量原子組成的準(zhǔn)零維半導(dǎo)體納米微晶體［17-18］。與傳統(tǒng)發(fā)光材料相比，量子點(diǎn)的激發(fā)光譜較寬且發(fā)射光譜較窄，具有較小尺寸的粒徑和易于功能化的表面，基于此特性，其成為具有新興價(jià)值的發(fā)光體之一［19-20］。然而，選擇合適的載體材料將量子點(diǎn)固定在電極表面是制備傳感器的重要環(huán)節(jié)。由于氧化石墨烯（GO）較大的比表面積和良好的生物相容性被廣泛用于生物傳感器研制［21-23］。

本文合成了量子點(diǎn)-氧化石墨烯納米復(fù)合材料（GO-QDs），并以其為基本單位制備適配體電化學(xué)發(fā)光（ECL）傳感器。修飾氨基基團(tuán)的cDNA 與量子點(diǎn)表面的羧基通過酰胺鍵將cDNA 結(jié)合至電極表面。利用氯化血紅素（Hemin）可插入雙鏈DNA 堿基對(duì)中的獨(dú)特性質(zhì)及其過氧化物酶的特性造成共反應(yīng)劑過氧化氫的消耗，從而引起傳感器的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)變化。當(dāng)CAP 存在時(shí)，由于與適配體結(jié)合致使雙鏈DNA（dsDNA）解旋，即氯化血紅素遠(yuǎn)離電極表面，電極的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)得以恢復(fù)，達(dá)到特異性檢測(cè)靶標(biāo)的目的。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白（BSA）、氯化鎘、巰基丙酸（MPA）、硫代硫酸鈉、氧化石墨烯粉末均購于百靈威科技有限公司。磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、氫氧化鈉均購于天津福晨化學(xué)試劑廠；聚（二烯丙基二甲基氯化銨）（PDDA）購自美國Sigma-Aldrich 公司；乙基-（3-二甲基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（美國Milli-Q 公司，18．2 MΩ·cm）。所用DNA序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成純化，序列如下［24］：

Apt DNA：5'-CAA TAA GCG ATG CGC CCT CGC CTG GGG GCC TAG TCC TCT CCT ATG CGT GCT ACC GTG AA-3’。

cDNA：5'-NH2-CAT CGC TTA TTG AAA AA AAA AA-3’。

實(shí)驗(yàn)儀器：ECL 分析儀（MPI-E，西安瑞瑪電子科技有限公司）、電化學(xué)分析儀（CHI 660a，上海辰華儀器有限公司）、F-4600 熒光光譜儀（日本日立公司）、JEM 2011 透射電子顯微鏡（JEOL 有限公司）、UV-2450型紫外-可見吸收光譜儀（日本島津公司）。

1.2 CdS量子點(diǎn)的合成及GO-QDs復(fù)合物的制備

按照參考文獻(xiàn)，利用一步水浴加熱法合成CdS 量子點(diǎn)［25］。將MPA 滴加到20 mmol/L 氯化鎘水溶液中，持續(xù)攪拌并用NaOH溶液將pH值調(diào)至10．0。在氮?dú)猸h(huán)境中，加入硫代乙酰胺并保持持續(xù)機(jī)械攪拌狀態(tài)，加熱至80 °C并使其冷凝回流4 h以上，直至觀察到亮黃色的硫化鎘量子點(diǎn)，將其置于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

依據(jù)參考文獻(xiàn)制備GO-QDs 復(fù)合材料［25-26］：將氧化石墨烯粉末在水溶液中超聲分散至形成分布均勻的GO 懸濁液（1 mg/mL）。取GO 懸濁液與17．2%的PDDA 溶液超聲混勻，在12 000 r/min 下離心20 min 后，用水洗滌至少3 次，以去除多余的PDDA。將離心后的GO-PDDA 沉淀分散到CdS QDs 懸濁液中，通過靜電吸附作用使CdS QDs和PDDA結(jié)合。將所得混合溶液在室溫下攪拌24 h，形成GO-QDs納米復(fù)合材料。最后將所得的復(fù)合材料離心20 min，并用水洗滌分散在水中，4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 電極預(yù)處理

將玻碳電極（GCE）進(jìn)行預(yù)處理，依次用0．3 μm和50 nm粒徑的Al2O3打磨電極呈鏡面狀態(tài)，之后依次用水、乙醇、水超聲清洗，用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

1.4 適配體傳感器的制備

CAP電化學(xué)發(fā)光傳感器的構(gòu)建過程如圖1所示。首先取10 μL混合均勻的GO-QDs納米復(fù)合材料滴涂于玻碳電極表面，此電極記為GO-QDs/GCE。之后將電極浸泡在含0．01 mol/L EDC 和0．005 mol/L NHS的混合溶液中，以獲得羧基化的量子點(diǎn)。在GO-QDs/GCE 表面滴加10 μL cDNA于濕潤環(huán)境中在室溫下孵育2 h，cDNA 修飾的氨基與量子點(diǎn)表面的羧基形成酰胺鍵，從而固載到電極表面，此電極記為cDNA/GO-QDs/GCE。隨后取10 μL Apt DNA滴至電極表面并于濕潤環(huán)境中在室溫下孵育8 h，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，此時(shí)記為dsDNA/GO-QDs/GCE。將電極浸入1% BSA 溶液中，在37 ℃恒溫條件下孵育60 min 以封閉剩余的未結(jié)合位點(diǎn)。最后孵育10 μmol/L 的Hemin 溶液90 min，電極記為hemin-dsDNA/GO-QDs/GCE。

圖1 氯霉素適配體電化學(xué)發(fā)光傳感器的構(gòu)建過程及原理Fig．1 Construction process and principle of chloramphenicol aptamer electrochemiluminescence sensor

1.5 氯霉素的檢測(cè)

將上述修飾電極浸入不同濃度的CAP溶液避光孵育120 min，用5 mmol/L PBS溶液充分洗滌，將未結(jié)合的CAP、CAP 與Apt DNA 的復(fù)合物以及脫落的氯化血紅素徹底沖洗干凈，測(cè)定電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。測(cè)量參數(shù)為：在-1．5～0 V的電位范圍內(nèi)以100 mV/s掃描，光電倍增管電壓設(shè)置為600 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 CdS QDs與GO-QDs的表征

硫化鎘量子點(diǎn)（CdS QDs）的透射電子顯微鏡圖如圖2A 所示，從圖中可明顯觀察到量子點(diǎn)的單位粒徑大小約為1～2 nm，分散性良好，呈現(xiàn)明顯的晶格狀條紋，形狀為球形或近球形。CdS QDs的紫外-可見吸收光譜及熒光光譜如圖2B 所示，其最大紫外吸收峰波長為379 nm，最大熒光峰值出現(xiàn)在570 nm（λex=370 nm）。將結(jié)果代入Yu等［27］提出的經(jīng)驗(yàn)公式：

圖2 CdS QDs的透射電鏡圖（A）、紫外-可見吸收光譜和熒光光譜圖（B）以及GO-QDs的透射電鏡圖（C）Fig．2 Transmission electron microscope diagram of CdS QDs（A），ultraviolet-visible absorption spectrum and fluorescence spectrum（B） and the transmission electron microscope of GO-QDs（C）

其中D為直徑，將最大紫外吸收峰波長λmax=379 代入，計(jì)算得到CdS QDs 的直徑約為1．36 nm，與其透射表征結(jié)果相符。由氧化石墨烯-量子點(diǎn)（GO-QDs）的透射電鏡圖（圖2C）可見，基于層與層之間的電子排斥作用，GO 呈現(xiàn)薄紗形態(tài)和褶皺狀紋理。同時(shí)，大量量子點(diǎn)已負(fù)載到GO 表面，證明上述實(shí)驗(yàn)成功合成了GO-QDs復(fù)合物。

2.2 傳感器的電化學(xué)表征

采用電化學(xué)阻抗（EIS）法分別對(duì)傳感器的修飾過程進(jìn)行了各界面的性質(zhì)分析［28］。如圖3所示，阻抗譜圖中的半圓直徑數(shù)值可表征界面的電子傳遞性能，修飾GO-QDs 納米復(fù)合材料的電極阻抗（曲線B）小于裸GCE（曲線A），說明GO-QDs 復(fù)合材料具有較高的電子轉(zhuǎn)移能力。當(dāng)電極表面分別修飾cDNA（曲線C）和Apt DNA（曲線D）時(shí)，帶負(fù)電荷的DNA 磷酸骨架對(duì)陰離子（［Fe（CN）6］3-/4-）的靜電排斥作用致使阻抗逐步增大。當(dāng)修飾電極與靶標(biāo)物CAP孵育后，由于適配體與氯霉素的結(jié)合使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋，并脫離電極表面，阻抗明顯減?。ㄇ€E）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該傳感器的制備方法是可行的。

圖3 修飾電極在5 mmol/L［ Fe（CN）6］3-/4（-0．1 mol/L KCl）溶液中的阻抗圖Fig．3 Impedance diagrams of the modified electrodes in 5 mmol/L［ Fe（CN）6］3-/4（-0．1 mol/L KCl） solution A：bare GCE；B：GO-QDs/GCE；C：cDNA/GO-QDs/GCE；D：ds-DNA/GO-QDs/GCE；E：CAP/hemin-dsDNA/GO-QDs/GCE

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

本傳感器的檢測(cè)信號(hào)變化基于體系中共反應(yīng)劑H2O2的消耗量，所以嵌入雙鏈DNA 中的氯化血紅素是關(guān)鍵因素。為獲得最優(yōu)條件，考察了氯化血紅素的濃度對(duì)修飾電極電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響（圖4A）。如圖所示，隨著氯化血紅素濃度的增大，電化學(xué)發(fā)光信號(hào)快速減小，當(dāng)其濃度達(dá)到10 μmol/L 時(shí)，電化學(xué)發(fā)光信號(hào)趨于穩(wěn)定，因此選擇濃度為10 μmol/L 的氯化血紅素溶液。同時(shí)對(duì)氯化血紅素的孵育時(shí)間（30、60、90、120、150 min）進(jìn)行了優(yōu)化，如圖4B 所示，隨著孵育時(shí)間的增加，電化學(xué)發(fā)光信號(hào)逐漸降低，并在120 min 后趨于穩(wěn)定，因此選擇最佳孵育時(shí)間為120 min。另外考察了cDNA 在電極表面的最佳孵育時(shí)間，如圖4C 所示，電化學(xué)發(fā)光信號(hào)隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而逐漸減小，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為120 min 時(shí)，電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度不再變化，因此選擇cDNA的孵育時(shí)間為120 min。

圖4 氯化血紅素濃度（A）及孵育時(shí)間（B） 和cDNA孵育時(shí)間（C）對(duì)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig．4 Effect of hemin concentration（A），hemin incubation time（B） and cDNA incubation time（C）on the electrochemiluminescence intensity

2.4 氯霉素的檢測(cè)性能

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，考察了電化學(xué)發(fā)光信號(hào)與CAP 濃度的線性關(guān)系。如圖5 所示，傳感器的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著CAP 濃度的增加而增加，通過測(cè)量差值ΔI=Ip-I0分析其檢測(cè)性能（其中，I0為傳感器在空白溶液中的ECL 強(qiáng)度，Ip為CAP 溶液中的ECL 強(qiáng)度）。結(jié)果表明，ΔI與CAP 濃度的對(duì)數(shù)在1．0×10-10～1．0×10-6mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限（LOD）為3×10-11mol/L。

圖5 適配體傳感器對(duì)不同濃度CAP的ECL響應(yīng)曲線Fig．5 ECL response curves of aptamer sensor to different concentrations of CAP CAP concentration（a-e）：1．0×10-10，1．0×10-9，1．0×10-8，1．0×10-7，1．0×10-6 mol/L

2.5 生物傳感器的選擇性、穩(wěn)定性與重現(xiàn)性

特異性是評(píng)價(jià)生物傳感器檢測(cè)性能的重要指標(biāo)之一?？疾炝随溍顾?、卡那霉素、土霉素、四環(huán)素對(duì)測(cè)量結(jié)果可能產(chǎn)生的干擾影響。在保持其他條件一致時(shí)，利用生物傳感器測(cè)量0．1 μmol/L 的CAP，其中包含100 μmol/L 的干擾物質(zhì)。如圖6A 所示，干擾物的影響不超過6%，說明該傳感器對(duì)CAP 有很高的特異性。為驗(yàn)證傳感器的穩(wěn)定性，進(jìn)行了10 個(gè)周期的連續(xù)循環(huán)電位掃描，可以觀察到ECL 強(qiáng)度比較穩(wěn)定（圖6B）。同時(shí)考察了傳感器的重現(xiàn)性，在相同條件下制備了5 支傳感器，采用上述傳感器分別測(cè)量1．0×10-7mol/L的CAP，其ECL強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5．6%，表明傳感器的重現(xiàn)性良好。

圖6 干擾物對(duì)CAP的ECL響應(yīng)的影響（A），以及生物傳感器連續(xù)掃描10圈的ECL響應(yīng)-時(shí)間曲線圖（B）Fig．6 Effect of other antibiotics on the electrochemiluminescence intensity of CAP at the sensor（A），and ECL intensity-time curve of continuous scanning for 10 cycles of the biosensor（B）

2.6 實(shí)際樣品分析

將本文制備的電化學(xué)ECL 傳感器用于實(shí)際樣品中CAP 的檢測(cè)，從超市選取某品牌的純牛奶，用5 mmol/L 的PBS 緩沖溶液將牛奶稀釋后采用本傳感器進(jìn)行檢測(cè)和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每組選擇3 個(gè)平行樣，結(jié)果如表1所示。實(shí)際樣品的回收率為99．8%～101%，RSD 為1．1%～4．5%，表明該傳感器可用于實(shí)際樣品分析。

表1 實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of real samples

3 結(jié) 論

本文利用PDDA 的正電性，以氧化石墨烯為載體制備了GO-QDs 納米復(fù)合材料，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該復(fù)合材料具有良好的導(dǎo)電性和穩(wěn)定性。通過將cDNA 與apt DNA 雜交形成雙鏈DNA 并與氯化血紅素結(jié)合作為檢測(cè)探針，構(gòu)建了電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器。利用氯化血紅素過氧化物酶的作用與H2O2反應(yīng)，消耗共反應(yīng)劑H2O2，使發(fā)光體量子點(diǎn)的發(fā)光強(qiáng)度減小。當(dāng)CAP 存在時(shí)，雙鏈解旋導(dǎo)致氯化血紅素遠(yuǎn)離電極表面，電化學(xué)發(fā)光信號(hào)恢復(fù)。該方法具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于實(shí)際樣品中CAP 的快速測(cè)定。