生長(zhǎng)抑素三硫化物的制備與質(zhì)譜分析

王 軍，邱榮英，成祥旭，李 濤，劉金明，田洪武，李鐵健*，張貴民

（1．山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，山東 臨沂 273400；2．魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 臨沂 276005；3．國(guó)家手性制藥工程技術(shù)研究中心，山東 臨沂 276005；4．山東省手性制藥技術(shù)創(chuàng)新中心，山東 臨沂 276005）

生長(zhǎng)抑素（結(jié)構(gòu)如圖1A）是由下丘腦分泌的一種肽類(lèi)激素，是由9 種氨基酸組成的環(huán)狀肽，主要作用于消化道、胰腺、中樞與外周神經(jīng)系統(tǒng)，臨床上用于治療上消化道出血、急性胰腺炎、肝硬化合并出血等疾病［1-5］。最新研究表明，該藥物對(duì)腫瘤也有一定治療效果［6］。

目前大多數(shù)多肽藥物通過(guò)固相合成技術(shù)獲得，但在合成與存儲(chǔ)過(guò)程中易形成雜質(zhì)，包括氨基酸插入、氨基酸丟失、氧化/還原反應(yīng)、多聚體雜質(zhì)等，有些雜質(zhì)不但沒(méi)有療效，反而具有毒副作用［7］。2023年2月國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心（CDE）發(fā)布了《化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》（簡(jiǎn)稱《原則》），為多肽類(lèi)藥物的質(zhì)量研究提供了依據(jù)。該《原則》指出在外界因素下，肽類(lèi)藥物中的半胱氨酸（Cys）可能發(fā)生β-消除反應(yīng)產(chǎn)生降解雜質(zhì)，需進(jìn)行深入研究［8］。有研究表明含有二硫鍵的蛋白類(lèi)藥物發(fā)生β-消除反應(yīng)后，會(huì)進(jìn)一步產(chǎn)生三硫化物雜質(zhì)［9-10］。目前，生長(zhǎng)抑素工藝雜質(zhì)、異構(gòu)體雜質(zhì)與二聚體雜質(zhì)均有報(bào)道［1，11-14］，而生長(zhǎng)抑素三硫化物（理論結(jié)構(gòu)如圖1B）雜質(zhì)國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。本研究首次對(duì)生長(zhǎng)抑素三硫化物進(jìn)行制備純化并獲得純品，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜分析，并確認(rèn)了精確分子量、肽序列與三硫鍵連接位點(diǎn)，為生長(zhǎng)抑素的質(zhì)量研究提供了依據(jù)，對(duì)其他多肽類(lèi)藥物的三硫化物雜質(zhì)研究也具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

生長(zhǎng)抑素（批號(hào)：504200601，魯南新時(shí)代生物技術(shù)有限公司）；磷酸、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、乙酸、硫代硫酸鈉與三乙胺均為分析純，購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司；甲酸為質(zhì)譜純，購(gòu)自TCI 公司；三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽（TCEP·HCl）為分析純，購(gòu)自Thermo公司；乙腈為色譜純，購(gòu)自Merck 公司；制備級(jí)乙腈，購(gòu)自濰坊中匯化工有限公司；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Acquity H-Class 型超高效液相色譜系統(tǒng)（Waters 公司）；Synapt-XS 高分辨質(zhì)譜儀（Waters 公司，配Masslynx V4．2 與Unifi Portal 軟件）；Agilent 1260 HPLC液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）；NP7000-DAC50mm動(dòng)態(tài)軸向壓縮制備液相色譜系統(tǒng)（江蘇漢邦科技有限公司）；FD8-3a 真空冷凍干燥機(jī)（GOLD-SIM 公司）；R-220 pro 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI 公司）；XSR105DU/A 型電子天平（十萬(wàn)分之一，梅特勒公司）；WXTS3DU 型電子天平（百萬(wàn)分之一，梅特勒公司）。

1.3 HPLC色譜條件

色譜柱為AerisTMWIDEPORE XB-C18（4．6 mm×250 mm，3．6 μm）；流動(dòng)相A 為1．1%磷酸水溶液（三乙胺調(diào)至pH 2．3），流動(dòng)相B 為乙腈；梯度洗脫條件為：0～35 min，18%～40% B；35～36 min，40%～50% B；36～46 min，50% B；46～47 min，50%～18% B；47～55 min，18% B；流速為1．0 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為5 μL； 檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。

1.4 高壓制備液相色譜條件

1.4.1 一次高壓制備液相色譜條件色譜柱填料：Sepax GP C18（250 mm×50 mm，5 μm，孔徑12 nm）；流動(dòng)相A 為0．2 mol·L-1磷酸二氫銨溶液（用磷酸調(diào)至pH 2．2），流動(dòng)相B 為乙腈；流速為50 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。梯度洗脫條件為：0～40 min，20%～35% B；40～41 min，35%～60% B；41～45 min，60% B；45～46 min，60%～20% B；46～52 min，20% B。收集保留時(shí)間約為27 min的目標(biāo)峰。

1.4.2 二次高壓制備液相色譜條件色譜柱填料、流動(dòng)相、流速及檢測(cè)波長(zhǎng)與“1．4．1”相同。梯度洗脫條件：0～40 min，30% B。收集保留時(shí)間約為18 min的目標(biāo)峰。

1.4.3 三次高壓制備液相色譜條件色譜柱填料：Sepax GP C18（250 mm×50 mm，5 μm，孔徑12 nm）；流動(dòng)相A 為0．2 mol·L-1乙酸水，流動(dòng)相B 為乙腈；流速為50 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。梯度洗脫條件為：0～15 min，8% B；15～16 min，8%～50% B；16～30 min，50% B；30～31 min，50%～8% B；31～40 min，8% B。收集保留時(shí)間約為21．5 min的目標(biāo)峰。

1.5 液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）條件

色譜柱：Thermo Hypersil Gold AQ（2．1 mm×150 mm，1．9 μm），流動(dòng)相A 為0．1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為乙腈。梯度洗脫條件為：0～3 min，5% B；3～9 min，5%～40% B；9～15 min，40% B；15～16 min，40%～5% B；16～20 min，5% B。柱溫：40 ℃；流速：0．3 mL·min-1；進(jìn)樣量：1 μL（還原前供試品溶液）或10 μL（還原后供試品溶液）；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。

離子源：電噴霧電離（ESI）；掃描模式：正模式；掃描范圍：m/z25～2 000；霧化氣流速：800 L·h-1；離子源溫度：100 ℃；毛細(xì)管電壓：2．5 kV；錐孔電壓：40 V；碰撞能量：30～60 eV。

1.6 溶液制備

1.6.1 生長(zhǎng)抑素三硫化物粗品溶液制備取適量生長(zhǎng)抑素溶于水中，加入Na2S2O3，生長(zhǎng)抑素與Na2S2O3的摩爾比為1∶2，60 ℃水浴反應(yīng)1 h后備用。

1.6.2 質(zhì)譜分析樣品溶液配制還原前供試品溶液：凍干后樣品經(jīng)水溶解，配制成質(zhì)量濃度約為1．0 mg·mL-1的溶液。該溶液用于目標(biāo)物精確分子量的測(cè)定。

還原后供試品溶液：量取上述還原前供試品溶液10 μL，加入80 μL 水和10 μL 0．1 mol·L-1TCEP·HCl溶液，混勻后室溫下反應(yīng)5 min，用于目標(biāo)物肽序列與三硫鍵連接位點(diǎn)的測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 生長(zhǎng)抑素三硫化物粗品的合成

文獻(xiàn)報(bào)道，使用硫化氫氣體［15］或硫代硫酸鹽［16］與蛋白質(zhì)類(lèi)藥物反應(yīng)可生成三硫化物。由于硫化氫氣體有毒性且易燃易爆，不易操作，從安全角度出發(fā)，本研究首先加入硫化鈉與生長(zhǎng)抑素反應(yīng)，未獲得目標(biāo)物。然后改用Na2S2O3與生長(zhǎng)抑素反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)抑素與Na2S2O3的摩爾比為1∶2，60 ℃水浴反應(yīng)1 h 后可獲得生長(zhǎng)抑素三硫化物，經(jīng)HPLC 檢測(cè)目標(biāo)物的純度約為10%，能夠滿足后期的制備純化要求。

2.2 生長(zhǎng)抑素三硫化物的純化

目前檢測(cè)生長(zhǎng)抑素三硫化物的HPLC 方法中流動(dòng)相A 含有三乙胺，會(huì)與色譜柱填料中的硅醇基結(jié)合，對(duì)色譜柱填料產(chǎn)生不易逆轉(zhuǎn)的影響，導(dǎo)致柱效下降，因此未采用其作為高壓制備液相色譜的流動(dòng)相。本研究采用pH 2．2 的磷酸二氫銨溶液作為流動(dòng)相A，乙腈作為流動(dòng)相B，經(jīng)優(yōu)化梯度，第一次制備純化的色譜圖見(jiàn)圖2A，可將生長(zhǎng)抑素三硫化物（圖中保留時(shí)間為27．1 min 的峰）與其他干擾物分開(kāi)。然后對(duì)該目標(biāo)物進(jìn)行收集與濃縮，HPLC 檢測(cè)其純度大于70%，作為二次制備純化的供試品溶液。第二次制備純化采用等度洗脫方法，其色譜圖見(jiàn)圖2B，對(duì)保留時(shí)間約為18．0 min 的峰進(jìn)行收集濃縮，HPLC 檢測(cè)其純度大于95%，作為三次制備純化的供試品溶液。第三次制備純化采用易揮發(fā)的乙酸水作為流動(dòng)相A，乙腈作為流動(dòng)相B，優(yōu)化梯度后，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行收集濃縮，即可將二次制備樣品中的磷酸鹽轉(zhuǎn)為乙酸，而乙酸在濃縮與凍干步驟中可揮發(fā)去除，因此不影響下一步的質(zhì)譜分析。經(jīng)過(guò)凍干后，HPLC 檢測(cè)其純度大于95%，其色譜圖見(jiàn)圖3。

圖2 生長(zhǎng)抑素三硫化物的一次制備（A）與二次制備（B）色譜圖Fig．2 The first preparation（A） and second preparation（B） chromatograms of somatostatin trisulfide

圖3 生長(zhǎng)抑素三硫化物凍干后的色譜圖Fig．3 Chromatogram of somatostatin trisulfide after freeze-dried

2.3 生長(zhǎng)抑素三硫化物的質(zhì)譜分析

多肽分子由于分子量較大，通過(guò)紫外光譜、紅外光譜、核磁共振波譜等進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析存在困難［8］，目前多采用LC-MS 法進(jìn)行分析［17-18］。本研究采用LC-MS 法對(duì)生長(zhǎng)抑素三硫化物的精確分子量、肽序列與三硫鍵連接位點(diǎn)進(jìn)行了分析，具體結(jié)果如下。

2.3.1 精確分子量的測(cè)定由圖1 可知，生長(zhǎng)抑素三硫化物的分子式為C76H104N18O19S3，精確的單同位素分子量為1 668．688 7。還原前供試品溶液的一級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4，其加合離子［M+2H］2+的質(zhì)荷比（m/z）為835．353 9、［M+3H］3+的m/z為557．236 9，與生長(zhǎng)抑素三硫化物理論計(jì)算值（［M+2H］2+的m/z為835．351 6、［M+3H］3+的m/z為557．236 9）的質(zhì)量誤差均小于10×10-6，表明與目標(biāo)物的理論分子量相符。

圖4 生長(zhǎng)抑素三硫化物的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig．4 MS spectrum of somatostatin trisulfide

2.3.2 肽序列分析多肽藥物離子化后進(jìn)入質(zhì)譜質(zhì)量分析器和離子碰撞池，施加適當(dāng)?shù)碾妷汉团鲎矚怏w后，其骨架發(fā)生斷裂，在ESI 源下誘導(dǎo)碰撞解離（CID）后形成一系列b 離子和y 離子，再通過(guò)軟件進(jìn)行拼接，可得到肽段的序列［19-20］。在CID 下，一般優(yōu)先引起肽骨架斷裂，但不會(huì)導(dǎo)致二硫鍵斷裂［21］，目前常用還原劑對(duì)二硫鍵還原后再進(jìn)行測(cè)序［22］。有報(bào)道顯示抗體藥物中的三硫鍵在TCEP 還原下，可生成二硫鍵與游離巰基，其機(jī)理見(jiàn)圖5［23］。因此，本研究使用TCEP 對(duì)生長(zhǎng)抑素三硫化物還原后再進(jìn)行肽序列測(cè)定。

圖5 三硫化物與TCEP還原反應(yīng)機(jī)理Fig．5 The mechanism of trisulfide reduction with TCEP

還原后供試品溶液經(jīng)質(zhì)譜分析的總離子流圖（TIC）如圖6 所示，主要生成了化合物1（保留時(shí)間為9．74 min）與化合物2（保留時(shí)間為9．52 min）。

圖6 生長(zhǎng)抑素三硫化物還原后的總離子流圖Fig．6 Total ion chromatogram of reduced somatostatin trisulfide

其中化合物1 的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖7A，其加合離子［M+2H］2+的m/z為819．367 0、［M+3H］3+的m/z為546．579 1，均與生長(zhǎng)抑素的理論計(jì)算值（［M+2H］2+819．365 6、［M+3H］3+546．579 5）吻合，質(zhì)量誤差小于10×10-6?；衔? 的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖7B，其加合離子［M+2H］2+的m/z為820．375 4、［M+3H］3+的m/z為547．251 6，與生長(zhǎng)抑素相比，該化合物的相對(duì)分子質(zhì)量增加2 Da，可初步判斷為生長(zhǎng)抑素線性肽（C76H106N18O19S2），質(zhì)量誤差小于10×10-6。結(jié)合圖5 所示反應(yīng)機(jī)理，初步判斷生長(zhǎng)抑素三硫化物與TCEP反應(yīng)后生成了生長(zhǎng)抑素（化合物1）與生長(zhǎng)抑素線性肽（化合物2）。其中生長(zhǎng)抑素線性肽可用于肽序列的測(cè)定，經(jīng)檢索后的匹配圖見(jiàn)圖8，具體b/y 離子匹配表見(jiàn)表1，表中加粗部分為匹配上的離子，匹配度較高，可知樣品序列為：A-G-C-K-N-F-F-W-K-T-F-T-S-C，與生長(zhǎng)抑素三硫化物的理論肽序列信息相符。

表1 生長(zhǎng)抑素三硫化物（還原后）肽序列匹配表Table 1 Peptide sequence matching table of reduced somatostatin trisulfide

圖7 化合物1（A）與化合物2（B）的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig．7 MS spectra of compound 1（A） and compound 2（B）

圖 8 生長(zhǎng)抑素三硫化物（還原后）的肽序列匹配圖Fig．8 Peptide sequence matching map of reduced somatostatin trisulfide

2.3.3 三硫鍵連接位點(diǎn)確認(rèn)目前關(guān)于二硫鍵的鑒定方法報(bào)道較多，包括柱后在線還原法［24］、離子源內(nèi)部分還原法［25］、化學(xué)裂解法［26-27］與溶液中的試劑還原法［28］，而三硫鍵的鑒定多集中在抗體類(lèi)藥物［15，23，29］，多肽類(lèi)藥物中的三硫鍵定位未見(jiàn)報(bào)道。本研究建立了多肽類(lèi)藥物中三硫鍵的定位方法。通過(guò)優(yōu)化TCEP 與生長(zhǎng)抑素三硫化物的反應(yīng)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)在室溫下反應(yīng)5 min，可將其還原為生長(zhǎng)抑素與生長(zhǎng)抑素線性肽。與上述文獻(xiàn)方法相比，本方法反應(yīng)時(shí)間短，無(wú)需烷基化且易于操作。通過(guò)“2．3．2”的肽序列可知，該結(jié)構(gòu)中存在2 個(gè)半胱氨酸，理論上只存在1 對(duì)三硫鍵。生長(zhǎng)抑素三硫化物與生長(zhǎng)抑素線性肽序列的結(jié)構(gòu)如圖9 所示，由于三硫鍵在CID下不易碎裂，因此生長(zhǎng)抑素三硫化物理論上不會(huì)產(chǎn)生y9、y10、y11等碎片離子，而通過(guò)比較二者特征離子y12的質(zhì)量差可判斷三硫鍵連接位點(diǎn)。經(jīng)檢測(cè)，生長(zhǎng)抑素三硫化物的y12離子m/z為1 541．649 0，生長(zhǎng)抑素線性肽的y12離子m/z為1 511．684 5，前者比后者多30 Da，由此確證三硫鍵連接位點(diǎn)為Cys（3）-Cys（14），與生長(zhǎng)抑素三硫化物的理論結(jié)構(gòu)相符。

圖9 生長(zhǎng)抑素三硫化物（A）與生長(zhǎng)抑素線性肽（B）的結(jié)構(gòu)Fig．9 The structures of somatostatin trisulfide（A） and somatostatin linear peptide（B）

3 結(jié) 論

本研究將生長(zhǎng)抑素與Na2S2O3以摩爾比1∶2 在60 ℃水浴下反應(yīng)1 h后，制得的生長(zhǎng)抑素三硫化物的純度約10%，此反應(yīng)液經(jīng)3次制備純化后凍干，獲得了純度大于95%的目標(biāo)物。經(jīng)過(guò)質(zhì)譜分析，其精確分子量、肽序列與三硫鍵連接位點(diǎn)均與理論結(jié)構(gòu)一致。目前未見(jiàn)該化合物的相關(guān)報(bào)道，該研究為進(jìn)一步開(kāi)展生長(zhǎng)抑素的質(zhì)量研究提供了參考，對(duì)其他多肽類(lèi)藥物的三硫化物雜質(zhì)研究也具有重要意義。