近紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)快速測定羊棲菜抗氧化活性

曹小青，曾 麗，黃 靜，韋思思，佟海濱，張 旭，吳明江*，楊 越*

（1．溫州大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2．浙江省水環(huán)境與海洋生物資源保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035）

羊棲菜是一種隸屬于馬尾藻科的食用褐藻，是韓國、日本和中國沿海居民的傳統(tǒng)美食［1］。羊棲菜與紫菜、海帶和裙帶菜同屬我國四大經(jīng)濟(jì)海藻［2］。與其它3種海藻的不同之處在于，羊棲菜不僅可以用作食材，還是一味具有悠久歷史的中草藥［3-4］，文獻(xiàn)報(bào)道其具有補(bǔ)血、降血壓、軟堅(jiān)化痰等功效［5-7］。多糖、多酚、總黃酮和巖藻黃質(zhì)等是羊棲菜的主要活性成分，均具備良好的抗氧化活性［6-7］。此外，羊棲菜還具有抗腫瘤、抗肥胖、消炎及降血脂等活性作用［8-9］。由于具備較高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值，羊棲菜在食品、醫(yī)藥和護(hù)膚品等領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景［10］。不同的生長環(huán)境如溫度、光照、鹽度和潮汐等因素會(huì)直接影響羊棲菜抗氧化物質(zhì)的積累及抗氧化活性，從而導(dǎo)致羊棲菜品質(zhì)存在明顯差異。基于健康和經(jīng)濟(jì)方面的考慮，食品品質(zhì)日益受到消費(fèi)者和經(jīng)銷商的關(guān)注。因此，非常有必要對羊棲菜的抗氧化活性進(jìn)行評價(jià)以保證羊棲菜的品質(zhì)和保護(hù)消費(fèi)者的利益。目前常見的抗氧化活性的測定方法有紫外-可見分光光度法［10-11］、化學(xué)發(fā)光法［12-13］和高效液相色譜法［14］。然而這些分析方法往往存在測定耗時(shí)、操作過程繁瑣、實(shí)驗(yàn)技能要求較高、使用的有機(jī)試劑污染環(huán)境等缺點(diǎn)。因此，亟需建立一種快速、簡便、準(zhǔn)確的羊棲菜抗氧化活性分析方法，以提升羊棲菜品質(zhì)控制水平，豐富其質(zhì)量評價(jià)體系。

近紅外光譜技術(shù)（Near-infrared spectroscopy，NIRS）是光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法和計(jì)算機(jī)技術(shù)的一種間接高新分析技術(shù)，具有快速、簡便、綠色、多組分同時(shí)測定和可實(shí)現(xiàn)在線分析等優(yōu)點(diǎn)［15-16］，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、煙草、石油化工等眾多領(lǐng)域［17-19］。目前已有少量研究報(bào)道了NIRS 在車?yán)遄?、藜麥等食品抗氧化活性測定方面的應(yīng)用［20-22］，然而其在可食用海藻相關(guān)方面的應(yīng)用尚未見報(bào)道。NIRS因具有簡單快速、不污染環(huán)境、測定成本低和樣品無需預(yù)處理等優(yōu)點(diǎn)，已被證實(shí)可以作為傳統(tǒng)體外抗氧化活性測定方法的替代方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，尚未發(fā)現(xiàn)基于NIRS對羊棲菜抗氧化活性定量分析的研究報(bào)道，羊棲菜抗氧化活性定量模型的建立將為羊棲菜的品質(zhì)提升和開發(fā)利用提供一定的借鑒，從而提高羊棲菜的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，并為NIRS應(yīng)用于海藻質(zhì)量評價(jià)提供理論依據(jù)和應(yīng)用支持，豐富和發(fā)展海藻質(zhì)量評價(jià)的方法體系。

本研究采用NIRS 和偏最小二乘法（PLS）構(gòu)建定量校正模型，并通過光譜預(yù)處理方法和變量選擇方法優(yōu)化模型性能，建立了一種快速、簡便、準(zhǔn)確的羊棲菜抗氧化活性分析方法，可在維護(hù)羊棲菜市場秩序、提升羊棲菜品質(zhì)控制水平、推動(dòng)我國羊棲菜產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定持續(xù)發(fā)展方面提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、過硫酸鉀、三吡啶三吖嗪、七水合硫酸亞鐵、無水醋酸鈉（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；冰醋酸、濃鹽酸（分析純，浙江中星化工試劑有限公司）；六水合三氯化鐵、無水乙醇（分析純，廣東西隴科學(xué)股份有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水（美國Millipore）。

羊棲菜，采集于浙江省洞頭市羊棲菜養(yǎng)殖基地，采集時(shí)間分別為2020年12月11日、2021年1月9日、2021 年2 月1 日、2021 年3 月5 日、2021 年4 月4 日、2021 年4 月19 日。每批在同一生長海域采集外觀、長短一致的25個(gè)羊棲菜樣本。

1.2 儀器與設(shè)備

Binder 恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)（上海合測實(shí)業(yè)公司）；Antaris Ⅱ傅里葉變換近紅外光譜儀（美國Thermo Fisher 公司）；TU1810 紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；JP-040S 超聲清洗機(jī)（深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司）；CT15RT 型高速冷凍離心機(jī)（上海天美生化儀器設(shè)備工程公司）；OSB-2200水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；800Y高速多功能粉碎機(jī)（永康鉑歐五金制品有限公司）；SQP型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 近紅外光譜的采集

羊棲菜用流動(dòng)水清洗干凈，置于恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)中于80 ℃下干燥4．5 h 至恒重。將干燥羊棲菜粉碎，過80 目篩網(wǎng)，每批得到25 份粒度均勻的羊棲菜粉末，6 批共計(jì)150 份羊棲菜粉末。取每份羊棲菜粉末樣本平鋪于樣品杯中，以空氣為參比，漫反射掃描模式，光譜掃描范圍為4 000～10 000 cm-1，掃描次數(shù)為64次，分辨率為8 cm-1，每個(gè)樣本掃描3次，取平均光譜用于后續(xù)數(shù)據(jù)處理。

1.4 抗氧化活性的測定

1.4.1 羊棲菜提取液的制備

精密稱取羊棲菜粉末50 mg于50 mL容量瓶中，用去離子水定容，于室溫在超聲清洗機(jī)功率240 W下超聲20 min，取出，3 000 r/min離心10 min，所得上清液即為羊棲菜提取液，于冰箱4 ℃保存。

1.4.2 測定DPPH自由基清除能力

參考Guo 等［23］的實(shí)驗(yàn)方法并進(jìn)行調(diào)整，將樣品溶液（2 mL）與DPPH 的乙醇溶液（0．1 mmol/L）2 mL（A1）或乙醇溶液2 mL（A2）混合，搖勻，室溫下避光反應(yīng)30 min。以去離子水（2 mL）與DPPH的乙醇溶液（2 mL）混合作為對照（A0），在517 nm處測定每種混合溶液的吸光度。每個(gè)樣品一式3份，清除率計(jì)算如下：

其中A0為對照組的吸光度，A1為樣品溶液混合DPPH乙醇溶液的吸光度，A2為樣品溶液與乙醇混合溶液的吸光度。

1.4.3 測定ABTS自由基清除能力

采用Muhammad等［24］的實(shí)驗(yàn)方法，并進(jìn)行調(diào)整。將ABTS水溶液（7 mmol/L）100 mL和過硫酸鉀溶液（140 mmol/L）1．76 mL 置棕色瓶中，混合均勻，于黑暗室溫環(huán)境中靜置12 h 得ABTS 母液。將ABTS 母液用去離子水稀釋至734 nm 處的吸光度為0．70±0．02，即得到ABTS 工作液。然后，將樣品溶液（200 μL）與ABTS 工作液4 mL（A1）或去離子水4 mL（A2）混合，室溫避光靜置30 min。以去離子水（200 μL）為對照（A0），在734 nm處測定每種混合溶液的吸光度。每個(gè)樣品一式3份，清除率由式（1）計(jì)算。式中A0為對照組的吸光度，A1為樣品溶液混合ABTS 工作液的吸光度，A2為不含ABTS 工作液的樣品溶液的吸光度。

1.4.4 鐵離子還原能力測定（FRAP法）

1.4.4.1 樣品溶液的測定參考Guan等［25］的方法進(jìn)行FRAP 法測定。將醋酸緩沖液（300 mmol/L，pH 3．6）100 mL、三吡啶三吖嗪-鹽酸溶液（10 mmol/L）10 mL、三氯化鐵溶液（20 mmol/L）10 mL 混合制備FRAP工作液，37 ℃水浴備用。然后，將樣品溶液（400 μL）與FRAP工作液（3．6 mL）混合，室溫暗處靜置30 min。以去離子水（400 μL）作為空白，在593 nm 處測定吸光度，每個(gè)樣品平行制備3 份。鐵離子還原能力以硫酸亞鐵濃度（μmol/L）表示。

1.4.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確稱取七水合硫酸亞鐵0．013 9 g 于容量瓶中，加去離子水溶解定容，即得1 000 μmol/L 的硫酸亞鐵溶液。配制0、50、100、200、300、400、500 μmol/L 的硫酸亞鐵溶液，精密移取不同濃度的硫酸亞鐵溶液0．4 mL于試管中，加入預(yù)熱到37 ℃的FRAP工作液3．6 mL，避光靜置30 min，于593 nm 波長處測定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，硫酸亞鐵濃度（X，μmol/L）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y= 0．001 7X+ 0．000 5，r2= 0．999 5，線性關(guān)系良好。

1.4.5 紫外-可見分光光度法方法學(xué)驗(yàn)證

1.4.5.1 精密度實(shí)驗(yàn)按照DPPH、ABTS和FRAP 方法連續(xù)測定6次樣品吸光度，各成分的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0．11%、0．080%、0．35%，均小于5．0%，精密度良好［26］。

1.4.5.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)平行制備6份樣品，分別測定其DPPH、ABTS和FRAP 抗氧化活性，各成分的RSD值分別為1．5%、2．9%、1．1%，均小于5．0%，重復(fù)性良好。

1.4.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一樣品，在1 h 內(nèi)測定其DPPH、ABTS 和FRAP 抗氧化活性，各成分的RSD值分別為2．3%、1．3%、3．5%，均小于5．0%，樣品在1 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.5 數(shù)據(jù)處理及模型性能評價(jià)

采用TQ Analyst 軟件進(jìn)行異常光譜的識(shí)別和光譜預(yù)處理方法的選擇，建模變量選擇采用MATLAB 2014a 軟件，制表軟件為Word 2019，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用Excel 2019 軟件，繪圖軟件為Origin 2021。模型性能評價(jià)參數(shù)通常包括校正集相關(guān)系數(shù)（RC）、校正集均方根誤差（RMSEC）、預(yù)測集相關(guān)系數(shù)（RP）和預(yù)測集均方根誤差（RMSEP）。通常RC和RP越接近于1，RMSEC 和RMSEP 越小且越接近表明模型預(yù)測性能越高。

2 結(jié)果與討論

2.1 近紅外光譜分析

圖1A 為羊棲菜在4 000～10 000 cm-1的近紅外原始光譜圖?？梢钥闯?，所有樣本的近紅外光譜變化趨勢基本一致。圖1中5 155 cm-1和6 944 cm-1處有兩個(gè)明顯的吸收峰，歸屬于水分子O—H 伸縮振動(dòng)的組合頻和一級倍頻。其他較強(qiáng)吸收主要位于4 288、4 389、5 774、8 230 cm-1附近，4 288、4 389 cm-1處的吸收譜帶歸屬于C—H 和—CH2伸縮和彎曲振動(dòng)的組合頻；5 774 cm-1處的峰與C—H 伸縮振動(dòng)的一級倍頻有關(guān)；8 230 cm-1處為C—H 伸縮振動(dòng)的二級倍頻［27］。采用馬氏距離法識(shí)別DPPH 模型的異常光譜（圖1B），可將異常光譜排除在閾值（虛線）之外。對于DPPH、ABTS 和FRAP 3 個(gè)抗氧化指標(biāo)，分別檢測出5、5和6個(gè)異常光譜。最終，DPPH、ABTS和FRAP的建模樣本數(shù)分別為145、145和144。

圖1 羊棲菜近紅外原始光譜圖（A）和DPPH模型異常光譜判別圖（B）Fig．1 Raw NIR spectra of Sargassum fusiforme（A） and discrimination of anomalous spectra for DPPH model（B）

2.2 校正集與預(yù)測集劃分

合理評價(jià)模型性能需要將樣本劃分為校正集和預(yù)測集，分別用于構(gòu)建和驗(yàn)證校正模型。本實(shí)驗(yàn)采用濃度梯度法選取3/4的樣本作為校正集，剩余1/4樣本作為預(yù)測集?？倶颖炯?、校正集和預(yù)測集樣本中參考值的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1?？梢钥闯?，對于3種抗氧化活性指標(biāo)，校正集和預(yù)測集樣本的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差均十分接近，并且校正集樣本參考值的范圍涵蓋了預(yù)測集的范圍，說明校正集與預(yù)測集的劃分合理，有助于建立穩(wěn)定的校正模型。

表1 樣本的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Statistics results of samples

2.3 光譜預(yù)處理方法的選擇

近紅外光譜重疊嚴(yán)重，光譜易受到噪聲、基線漂移、信號(hào)本底、光散射以及樣品顆粒不均勻等帶來的干擾［28-30］。因此有必要對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，提高模型的穩(wěn)健性和預(yù)測性能。

本研究采用表2 中的4 種光譜預(yù)處理方法對原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化：一階導(dǎo)數(shù)結(jié)合Savitzky-Golay平滑（1D+SG）、二階導(dǎo)數(shù)結(jié)合Savitzky-Golay 平滑（2D+SG）、多元散射校正（MSC）和標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（SNV），其中SG平滑的窗口寬度為5，多項(xiàng)式次數(shù)為2。使用1D+SG、2D+SG、MSC和SNV方法可以分離重疊峰、消除光譜散射效應(yīng)和基線漂移。表2 中粗體表示最佳光譜預(yù)處理方法下的建模結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，DPPH、ABTS和FRAP 模型均在選擇1D+SG 光譜預(yù)處理方法時(shí)RMSEP 最小，分別為2．65、0．89和3．54。由于近紅外光譜中包含大量冗余信息，且波長變量數(shù)過多，需要通過變量選擇算法來選擇關(guān)鍵變量。競爭性自適應(yīng)重加權(quán)采樣（CARS）算法是一種多變量優(yōu)化方法，特別適用于高維數(shù)據(jù)的變量選擇。與其他方法相比，CARS利用指數(shù)衰減函數(shù)（EDF）去除回歸系數(shù)絕對值較小的波長，可有效避免過擬合風(fēng)險(xiǎn)［31］。后續(xù)基于1D+SG 預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)分別建立DPPH、ABTS 和FRAP 的Full-PLS 模型和CARS-PLS模型，并比較其預(yù)測效果。

表2 不同光譜預(yù)處理方法的建模結(jié)果Table 2 Modeling results of different spectral preprocessing methods

2.4 建模變量的選擇

CARS算法采用蒙特卡羅采樣方法，即從校正集隨機(jī)抽取一部分樣本建立PLS模型，反復(fù)進(jìn)行上百次取樣，對變量逐個(gè)篩選，最終選取關(guān)鍵的波長變量，同時(shí)CARS 通過引入EDF 解決了變量選擇中的組合爆炸問題［31］。CARS 和PLS 相結(jié)合可以簡化建模過程，提高預(yù)測模型的精度。在本研究中，CARS算法運(yùn)行100 次，每次運(yùn)行均使用80%的隨機(jī)樣本建立PLS 模型。圖2A～C 分別顯示了CARS 程序運(yùn)行過程中DPPH 模型采樣變量數(shù)、交叉驗(yàn)證均方根誤差（RMSECV）的變化趨勢以及各變量的回歸系數(shù)路徑。從圖2A可以看出，在基于EDF的變量提取的第一階段，隨著采樣次數(shù)的增加，保留變量的數(shù)量迅速減少，第二階段則緩慢減少，屬于典型的EDF 兩步篩選。從圖2B 中可以看出，采樣運(yùn)行次數(shù)在0～58范圍內(nèi)，由于剔除了大量不相關(guān)變量，RMSECV 緩慢下降；在58次采樣運(yùn)行后，RMSECV 基本保持穩(wěn)定，直到去除一些有用信息變量后，RMSECV 才顯著增加。如圖2C 所示，當(dāng)采樣次數(shù)為58 次時(shí)，RMSECV 達(dá)到最小值，在圖2C 中用藍(lán)色垂直星號(hào)線標(biāo)記，第58 次采樣時(shí)保留的變量數(shù)為34。通過CARS，DPPH、ABTS和FRAP分別選擇34、66和50個(gè)變量進(jìn)行建模。

圖2 DPPH光譜數(shù)據(jù)的CARS變量選擇圖Fig．2 Plots of CARS variables selection on spectra data for DPPH A，B and C show the changing trend of the number of sampled wavelengths，RMSECV values and the regression coefficient path of each wavelength with the increase of sampling runs，respectively

2.5 潛在變量數(shù)量的選擇

采用PLS法建立定量校正模型時(shí)，潛在變量（LVs）數(shù)量的選擇是否合適對于所建定量模型的預(yù)測性能影響較大，LVs數(shù)量太多會(huì)出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象；LVs數(shù)量太少，則會(huì)導(dǎo)致建模信息不全，模型預(yù)測性能下降［32］。本研究采用“留一法”交互驗(yàn)證選擇LVs數(shù)量，“留一法”交互驗(yàn)證是對某一個(gè)LVs數(shù)量，從n個(gè)校正樣本中選取1個(gè)樣本進(jìn)行預(yù)測，用n-1個(gè)樣本建立校正模型，預(yù)測留取的這一個(gè)樣本，經(jīng)反復(fù)建模及預(yù)測，直至這n個(gè)樣本均被預(yù)測1 次且只被預(yù)測1 次，則得到對應(yīng)這一LVs 數(shù)量的RMSECV，選擇最小RMSECV對應(yīng)的LVs數(shù)量為最佳LVs數(shù)量。由圖3可知，當(dāng)CARS-PLS模型的LVs數(shù)為7時(shí)（如圖3 中星號(hào)所示），RMSECV 最小。表3 中給出了DPPH、ABTS 和FRAP 的CARS-PLS 模型的最佳LVs 數(shù)量，分別為7、9和10。

表3 Full-PLS和CARS-PLS模型結(jié)果Table 3 Results of the Full-PLS and CARS-PLS models

圖3 DPPH的CARS-PLS模型在不同LVs數(shù)量下的RMSECV值Fig．3 RMSECV values at different numbers of LVs for DPPH CARS-PLS model

3 討 論

表3 給出了DPPH、ABTS 和FRAP 的Full-PLS 和CARS-PLS 建模結(jié)果，粗體表示最佳模型建模結(jié)果。可以看出，3 個(gè)抗氧化活性指標(biāo)的CARS-PLS 模型均明顯優(yōu)于Full-PLS 模型。RMSEP 分別由2．63%、0．89%和3．63μmol/L 下降至2．42%、0．73%和3．60 μmol/L。因此分別建立了DPPH、ABTS 和FRAP 的CARS-PLS 定量校正模型，校正模型參考值與預(yù)測值的相關(guān)性見圖4。圖4 中樣本的參考值與預(yù)測值均勻分布在回歸線兩側(cè)，3 個(gè)抗氧化活性指標(biāo)CARS-PLS 模型的RC和RP均大于0．96，預(yù)測性能較高。

圖4 CARS-PLS模型參考值與預(yù)測值的相關(guān)性圖Fig．4 Correlation diagrams of reference values and predicted values for the CARS-PLS models

圖5 為預(yù)測集參考值與預(yù)測值的對比圖。圖中3 個(gè)抗氧化活性模型的近紅外預(yù)測值與參考值均十分接近，變化趨勢基本保持一致，表明預(yù)測集樣本各指標(biāo)抗氧化活性的預(yù)測值與參考值之間呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，3個(gè)模型均可準(zhǔn)確預(yù)測羊棲菜的抗氧化活性。

圖5 預(yù)測集參考值與預(yù)測值的對比圖Fig．5 Comparison diagrams of reference values and predicted values of prediction sets

4 結(jié) 論

本研究采用NIRS 結(jié)合CARS 算法建立了一種快速測定羊棲菜抗氧化活性的方法。基于近紅外光譜和抗氧化活性指標(biāo)建立PLS 定量模型，采用異常光譜識(shí)別方法、光譜預(yù)處理方法和建模變量選擇方法優(yōu)化模型性能。結(jié)果顯示，所構(gòu)建的3種抗氧化活性指標(biāo)的CARS-PLS模型均可達(dá)到定量分析要求，RP均在0．96以上，證實(shí)了NIRS和CARS算法在羊棲菜抗氧化活性快速測定中的可行性。所構(gòu)建的方法快速、便捷、環(huán)保，有助于提升羊棲菜的質(zhì)量控制水平，推動(dòng)我國羊棲菜走向國際市場。