氮摻雜碳納米管增強中空纖維液相微萃取-高效液相色譜法測定生物樣本中溴系阻燃劑

馬琳琳，張澤霖，清江，孟桃于，焦葉，陳茂龍，文 李，程云輝，丁 利*

（1．長沙理工大學 食品科學與生物工程學院，湖南 長沙 410114；2．上海海關(guān)工業(yè)品與原材料檢測中心，上海200135；3．長沙和合醫(yī)學實驗室有限公司，湖南 長沙 410000）

溴系阻燃劑（BFRs）是全球應用最廣泛的阻燃劑之一，常被添加到紡織品、塑料制品和電子產(chǎn)品中［1-2］。據(jù)不完全統(tǒng)計，BFRs 在有機阻燃劑市場的占比達35%。其中四溴雙酚A（TBBPA）和十溴二苯醚（BDE209）是使用最廣泛的兩種溴系阻燃劑（結(jié)構(gòu)式見圖1），其使用量占據(jù)了全球溴系阻燃劑市場的60%。近年來，TBBPA 和BDE209對人體健康的影響備受關(guān)注。美國國家毒理學計劃的研究顯示TBBPA 具有神經(jīng)毒性［3］和急性毒性［4］，它可通過血液直接接觸免疫細胞，引起潛在的免疫毒性［5］。此外，TBBPA 是一種潛在的內(nèi)分泌干擾物，會導致內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)功能紊亂［6-7］，已經(jīng)被國際癌癥研究中心列為2A致癌物［8］。BDE209 具有環(huán)境持久性、遠距離遷移、生物累積性等［9］，在2017 年《斯德哥爾摩公約》中被列為新的持久性有機污染物（Persistent organic pollutants，POPs），歐盟也于2008 年正式將其在電子電器產(chǎn)品中的限量設(shè)定為1 000 mg/L。目前，在灰塵［10］、廢水［11］、水生生物［12］、污泥［13］和土壤［14］中均檢出TBBPA 和BDE209，其均可能通過食物鏈進入人體內(nèi)不斷累積和放大，最終對人類健康產(chǎn)生危害。傅家謨及其團隊［15］測定了廣州某醫(yī)院血清樣品中的多溴聯(lián)苯醚，其含量為1．5～17 ng/g；張圣虎等［16］對人體尿液中TBBPA進行檢測，含量在0．03～0．173 μg/L之間。因此，測定人體生物樣本中TBBPA和BDE209的含量對人體健康監(jiān)測具有重要意義。

圖1 四溴雙酚A（A）和十溴二苯醚（B）的結(jié)構(gòu)式Fig．1 Structural formulas of TBBPA（A） and BDE209（B）

目前，主要檢測的溴系阻燃劑有TBBPA、多溴二苯醚和六溴環(huán)十二烷等，測定對象主要為塑料制品、紡織制品、環(huán)境基質(zhì)等，常用的檢測方法包括液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）［15］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）［16-17］和高效液相色譜法（HPLC）［11］?；谏飿颖净|(zhì)復雜和污染物含量較低的特點，樣品前處理在其檢測環(huán)節(jié)中至關(guān)重要。Bergant等［18］采用甲酸沉淀血清中蛋白質(zhì)，異辛烷液液萃取的方式，建立了測定血清中多溴聯(lián)苯醚（包括BDE209 在內(nèi)的38 種同系物）的GC-MS 法。Hayama等［19］利用甲醇沉淀血清中蛋白質(zhì)，離心樣本通過固相萃取小柱，結(jié)合LC-MS/MS 法測定人血清中TBBPA。Lee等［20］采用新型QuEChERS法萃取富集血清中BDE209，血清樣本采用1 mL 乙酸乙酯-己烷-丙酮混合液提取，無水MgSO4和NaCl 鹽析后，提取液經(jīng)含PSA 的離心管凈化，氮吹干后，40 μL 異辛烷復溶并注入GC-MS/MS 進行分析。在液液萃取以及固相萃取等前處理方法中，均需先沉淀蛋白質(zhì)，步驟繁瑣，有機溶劑消耗較大。中空纖維液相微萃?。℉F-LPME）是集采樣、萃取、富集于一體的新型前處理方法。相較于傳統(tǒng)方法，HF-LPME 只需使用微量的有機溶劑即可獲得高的富集倍數(shù)（EF）［21］，且中空纖維膜壁孔徑在0．0925～0．2457 μm之間［22］，能有效排阻樣品中的大分子物質(zhì)［23］。為了進一步提高HF-LPME 的萃取富集能力，加入不同功能化的納米材料［24］，通過協(xié)同萃取作用提高對目標分析物的萃取效率。例如Darvishnejad 等［25］制備了MIL-101（Cr）@氧化石墨烯復合材料用于增強HF-LPME 萃取，建立了番茄、黃瓜和農(nóng)業(yè)用水中二嗪磷和毒死蜱殘留量的測定方法。Sun 等［26］通過石墨烯增強HF-LPME，用于牛奶中苯基脲類除草劑的檢測。氮摻雜碳納米管（N-CNTs）是基于碳納米管摻雜N 原子，增加了表面缺陷和反應位點，使其具有更大的比表面積和特定官能團［27］。由于π-π堆疊作用，NCNTs 容易萃取含苯環(huán)化合物。Han 等［28］使用N-CNTs 增強HF-LPME 富集番茄中的兩種植物生長激素，富集效果優(yōu)異。因此，利用N-CNTs 的增強吸附能力和中空纖維的大分子排阻能力，簡化了血清和尿液中TBBPA和BDE209的前處理步驟，對提高檢測靈敏度具有一定的研究意義。

本研究以血清和尿液中TBBPA 和BDE209為研究對象，采用N-CNTs增強HF-LPME（N-CNTs-HFLPME），建立了血清和尿液中溴系阻燃劑的高效萃取富集及同時一步去除蛋白的方法（圖2），并通過結(jié)合HPLC法，實現(xiàn)了血清和尿液中TBBPA和BDE209的同時檢測。

圖2 N-CNTs-HF-LPME 分析生物樣品中溴系阻燃劑的示意圖Fig．2 Schematic of analysis for brominated flame retardants in biological samples by N-CNTs-HF-LPME

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

Waters 2695 高效液相色譜儀（美國Waters公司），配備紫外檢測器及色譜工作站；KQ5200B 超聲波振蕩器（昆山超聲儀器有限公司）；AX224ZH 分析天平（感量：0．000 1 g，常州 OHAUS 公司）；掃描電子顯微鏡（SEM，F(xiàn)EI Co． Hillsboro，OR，USA）檢查材料的形態(tài)；1．0 mL微量注射器（型號702SNR，江西錦勝醫(yī)療器械集團有限公司）。

正己烷、正辛醇、甲苯、乙酸乙酯、氯化鈉（NaCl）均為分析純，購自國藥化學試劑有限公司（北京）；乙腈（色譜純，美國天地有限公司）；溴系阻燃劑標準品：TBBPA（純度 98% ）、BDE209（純度 ＞95% ）均購于麥克林（上海）；聚丙烯中空纖維膜（內(nèi)徑為0．6 mm，壁厚為0．2 mm，壁孔徑為0．45 μm）由Membrana（德國伍珀塔爾）提供。Milli-Q超純水（18．2 MΩ．cm， Millipore公司），實驗用水均為超純水。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取TBBPA和BDE209各100 mg，分別用甲醇和甲苯配制成單個標準儲備溶液（1 mg/mL）。然后分別移取1．0 mL 單標準儲備溶液于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10 mg/L 混合標準溶液，于4 ℃冷藏避光保存。使用時用甲醇稀釋成合適質(zhì)量濃度的標準溶液。

1.3 N-CNTs增強中空纖維（N-CNTs-HF）的制備

N-CNTs-HF 的制備參考文獻［28］：將十六烷基三甲基溴化銨（0．068 g， CTAB）超聲溶解在20 mL 水中，再將N-CNT-HF（0．06 g）加入到上述溶液中超聲處理30 min，在4 000 r/min 下離心1 h，以確保NCNTs-HF 分散均勻。將HF 膜切成約3 cm，轉(zhuǎn)移至N-CNTs-HF 的水分散體中，超聲處理3 h 后，用水清洗N-CNTs-HF的表面和內(nèi)腔，在70 ℃真空干燥2 h后，備用。

1.4 血清和尿液樣品預處理

血清樣品收集自湖南省人民醫(yī)院（中國長沙）的志愿者。尿液樣本來自長沙理工大學的志愿者，所有樣本均保存在-4 ℃。用水將樣本稀釋10倍，再用0．1 mmol/L鹽酸溶液將樣品溶液調(diào)至pH 7．0，最終體積為7 mL，置于血清瓶中。

1.5 N-CNTs-HF-LPME 前處理

將N-CNTs-HF 膜浸漬在選取的萃取溶劑中10 min，使萃取溶劑完全浸入纖維孔中。然后用微量取樣器將15 μL 萃取溶劑從HF 膜的一端注入管腔，兩端熱封。將封閉后的N-CNTs-HF 膜放置于裝有預處理后的生物樣本的血清瓶中，在磁力攪拌器上按照固定的轉(zhuǎn)速提取10 min。完成提取后，將HF膜剪成三段置于離心管中，加入乙腈超聲解析。最后，將所得溶液通過0．22 μm 有機濾膜過濾，進行HPLC-UV分析。

1.6 HPLC條件

色譜柱：Kjnetex EVO C18（2．1 mm × 150 mm，5 μm）；柱溫為30 ℃；進樣量：10 μL；紫外檢測波長：235 nm；流動相A：水，流動相B：乙腈；流速：0．3 mL/min；梯度洗脫程序為：0～3．0 min，30%～60% A；3．1～4．0 min，60%～30% A；4．1～5．0 min，30% A。

2 結(jié)果與討論

2.1 HF和N-CNTs-HF的表征

圖3A 是HF 和N-CNTs-HF 的照片，可以看出其外觀由白色變?yōu)楹谏?，表明中空纖維上成功摻雜N-CNTs。圖3B為HF的SEM 圖，可以看到HF的壁上有很多孔隙，這為容納材料提供了空間。圖3C中可觀察到N-CNTs的規(guī)則條狀和10～30 μm范圍內(nèi)的長度。圖3D顯示在HF的孔中可以觀察到條形的NCNTs，表明成功制備了N-CNTs-HF。

圖3 原始HF（左）和N- CNTs-HF（右）的物理視圖（A）；原始HF（B）、N-CNTs（C）及N-CNTs-HF（D）的SEM圖Fig．3 Physical views of original HF（left） and original N-CNTs-HF（right）（A）；SEM images of original HF（B），N-CNTs（C） and N-CNTs-HF（D）

2.2 N-CNTs-HF-LPME 的優(yōu)化

對影響萃取效率的參數(shù)，包括萃取溶劑的類型、樣品pH 值、NaCl 濃度、萃取時間、攪拌速度和解吸溶劑的種類進行以下優(yōu)化，并使用萃取效率進行量化。

2.2.1 萃取溶劑的優(yōu)化HF-LPME 的本質(zhì)是基于相似相溶原理，萃取溶劑的組成會顯著影響HFLPME［29］的萃取效率。根據(jù)TBBPA和BDE209的化學性質(zhì)，選取乙酸乙酯、甲苯、正己烷和正辛醇作為萃取溶劑進行優(yōu)化。尿液樣本的提取結(jié)果如圖4A 所示。BDE209 的最佳萃取溶劑為甲苯，萃取效率接近80%。TBBPA 的最佳萃取溶劑為正辛醇，萃取效率約為85%。為同時優(yōu)化BDE209 和TBBPA 的富集效率，考察了不同比例（1∶4、2∶3、3∶2、4∶1、1∶1）甲苯-正辛醇溶液的影響。結(jié)果顯示，甲苯-正辛醇（1∶1）的萃取效率最高，BDE209和TBBPA的萃取效率均在90%以上（圖4B）。因此，實驗選擇甲苯-正辛醇（1∶1）作為尿液樣品的最佳萃取溶劑。

圖4 萃取溶劑類型（A）及甲苯-正辛醇比例（B）對尿液中兩種溴系阻燃劑富集的影響Fig．4 Effects of extraction solvent type（A） and ratio of toluene to octyl alcohol（B） on the enrichment of two brominated flame retardants in urine

采用同樣方法考察了萃取溶劑對血清樣本中BDE209和TBBPA 萃取效率的影響，結(jié)果顯示，以乙酸乙酯為萃取溶劑時，TBBPA 的富集因子最高，而BDE209的萃取效率小于40%。以甲苯為萃取溶劑時，BDE209 的萃取效率高達80%，然而TBBPA 的萃取效率在35%左右。為獲得兩種分析物的最佳萃取效率，考察了不同比例（1∶4、2∶3、3∶2、4∶1、1∶1）甲苯-乙酸乙酯溶液的影響。結(jié)果顯示，甲苯-乙酸乙酯（1∶1）顯示出最佳的萃取效率，兩種溴系阻燃劑的萃取效率均大于90%。因此，實驗選擇甲苯-乙酸乙酯（1∶1）作血清樣品的萃取溶劑。

2.2.2 N-CNTs 濃度的優(yōu)化增加摻雜材料的用量通常會提高對目標物的吸附，但材料過多可能會堵塞HF 的孔隙。因此，本研究對NCNTs 的濃度進行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，N-CNTs濃度在0～3 mg/mL 之間時，通過N-CNTs 和HF的協(xié)同萃取作用，TBBPA 和BDE209 的萃取效率隨著N-CNTs 濃度的增加而增加。當NCNTs 的濃度從3 mg/mL 增至5 mg/mL 時，目標物的萃取效率反而下降，這可能是由于NCNTs濃度過高時易形成大塊物質(zhì)，堵塞HF 微孔膜，不利于化合物的傳質(zhì)作用，從而降低有機溶劑的萃取效率。因此，實驗選擇3 mg/mL N-CNTs作為化合物提取的最佳濃度。

2.2.3 NaCl 濃度的優(yōu)化考察了不同NaCl濃度（0、5%、10%、15%、20%）對萃取效率的影響［30］。尿液提取結(jié)果顯示，目標物的萃取效率在NaCl添加量為10%時最佳。然而，隨著血清中NaCl的加入，目標物的萃取效率逐漸降低，這種現(xiàn)象可能是由于血清本身含有蛋白質(zhì)、激素等內(nèi)源性物質(zhì)，粘度較高；鹽離子的加入增加了溶液的離子強度，導致溶液的粘度進一步增加，從而影響了目標物向萃取溶劑的傳質(zhì)，降低了萃取容量和擴散系數(shù)。因此，后續(xù)實驗選擇在尿樣中加入10% NaCl，在血清中不加入NaCl。

2.2.4 攪拌速度的優(yōu)化考察了0～1 000 r/min的攪拌速率對TBBPA和BDE209萃取效率的影響。結(jié)果顯示，隨著攪拌速率的增加，萃取效率先增大后減小，攪拌速率為200 r/min 時對尿液的富集效果最好。血清中的萃取效率在轉(zhuǎn)速為600 r/min 時最高，可能是因為血清中粘度較高，需較大轉(zhuǎn)速促進目標物的轉(zhuǎn)移。但轉(zhuǎn)速過高時，劇烈攪拌下可能在HF膜中形成氣泡，阻礙了分析物的進入，同時萃取劑也發(fā)生損失，從而導致萃取效率降低。因此，尿液和血清樣本分別選擇200 r/min和600 r/min為最佳攪拌速率。

2.2.5 提取時間的優(yōu)化目標分析物在樣品溶液和萃取溶劑之間的轉(zhuǎn)移是一個動態(tài)平衡過程，需要一定的時間達到平衡，以獲得最大的萃取效率［31］。本實驗優(yōu)化了不同提取時間（5～60 min）對兩種待測溴系阻燃劑的影響。結(jié)果顯示，提取效率在0～10 min 時逐漸增加，10 min 后達到提取平衡。當提取時間超過10 min 時，萃取效率開始降低，可能是由于提取時間較長導致有機溶劑揮發(fā)所致。因此，選擇最佳提取時間為10 min。

2.2.6 pH值的優(yōu)化樣品溶液的pH值會影響目標分析物的電離形式，從而影響萃取效率［28］。本文研究了樣品pH 值在3．0～9．0 范圍內(nèi)的影響。如圖5A 所示，當pH 值從3．0 增加到7．0 時，TBBPA 的萃取效率稍微增加。當pH 值從7．0 增加到11．0 時，萃取效率降低。此結(jié)果歸因于TBBPA 在pH 值大于8．0開始去質(zhì)子化［32］，以離子形式存在，不利于吸附。對于BDE209，pH 值在3．0～9．0 的較寬范圍內(nèi)，萃取效率超過120%，pH 值為9．0～11．0 時略有下降（圖5B）。這可能是由于BDE-209 在pH 值3．0～11．0 范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。因此，實驗選擇最佳pH值為7．0。

圖5 pH值對尿液（A）和血清（B）中兩種溴系阻燃劑富集的影響Fig．5 Effects of pH values on the enrichment of two brominated flame retardants in urine（A） and serum（B）

2.2.7 解吸溶劑的優(yōu)化被吸附在N-CNTs-HF 中的分析物經(jīng)萃取后需采用有機溶劑超聲解吸。實驗考察了乙腈和甲醇作為解吸溶劑時對尿液和血清中TBBPA 和BDE209 的萃取效率。結(jié)果顯示，使用乙腈解吸時，尿液和血清中TBBPA 和BDE209 的萃取效率均大于80%。采用甲醇時，TBBPA 的解吸效率較低，萃取效率小于50%。因此，實驗選擇乙腈作為最佳解吸溶劑。

為了證明增強HF-LPME 的富集效果，基于上述優(yōu)化結(jié)果，將沉淀蛋白后的血清樣本與經(jīng)N-CNTs-HF-LPME 處理后的樣本進行比較。結(jié)果顯示，經(jīng)增強中空纖維膜前處理后，TBBPA 和BDE209 得到明顯有效的富集，且二者的出峰位置處無其他物質(zhì)干擾（見圖6）。

圖6 200 ng/L BFRs經(jīng)N-CNTs-HF-LPME 處理前（a）后（b）的色譜圖Fig．6 Chromatograms of 200 ng/L BFRs before（a） and after（b） treatment with N-CNTs-HF-LPME

2.3 方法確證

在優(yōu)化條件下，采用N-CNTs-HF-LPME結(jié)合HPLC 對兩種溴系阻燃劑的系列質(zhì)量濃度標準樣品進行檢測。結(jié)果顯示，TBBPA 和BDE209 分別在2～200 ng/mL 和10～200 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）分別為0．999 和0．995。TBBPA 和BDE209 的檢出限（LOD）分別為0．375 ng/mL 和2．8 ng/mL，定量下限（LOQ）分別為9．4 ng/mL 和1．25 ng/mL。為驗證方法的準確性和重復性，在空白生物樣品中，加入適量標準溶液進行3個水平的加標回收實驗，每個水平進行5次重復，連續(xù)3 d，結(jié)果見表1。兩種目標分析物的平均加標回收率為84．5%～114%。BDE209 和TBBPA 的日內(nèi)和日間相對標準偏差（RSD）為1．4%～7．5%，符合方法學要求。實驗結(jié)果表明方法具有較高的準確性和重復性。

表1 血清和尿液中兩種目標分析物的回收率及相對標準偏差Table 1 Recoveries and RSDs of two target analytes in serum and urine

2.4 N-CNTs-HF的重復性

為了驗證N-CNTs-HF 的批次制備重復性，對實驗中分批次制備的N-CNTs-HF 進行稱量，質(zhì)量均在（3．0±0．1） mg，且在實驗應用中的萃取效率均大于80%（見圖7）。表明N-CNTs-HF 的批次制備重復性良好。

圖7 分批次制備的N-CNTs-HF的質(zhì)量以及對BDE209和TBBPA的萃取效率Fig．7 Mass of N-CNTs-HF prepared in batches and extraction efficiencies of BDE209 and TBBPA

2.5 與其他前處理方法的比較

本文與其他文獻報道的樣品前處理技術(shù)進行比較，結(jié)果如表2所示。本方法的前處理僅需10 min，且在富集目標物的同時可一步去除蛋白，有機溶劑使用量低。該方法高效快速，但與質(zhì)譜法相比檢出限略高。

表2 本方法與已報道的BFRs檢測方法的比較Table 2 Comparison of the established method with the reported methods for detection of BFRs

2.6 實際樣品分析

根據(jù)建立的方法對實際樣品進行分析，血清實際樣本共有50 份，其中5～20 歲的血清樣品2 份、20～30 歲的血清樣品38 份、30～40 歲的血清樣品10份；尿液樣本8 份，年齡在20～30 歲之間。所分析的樣本均未檢出TBBPA 和BDE209，圖8 為實際樣本和加標樣本的色譜圖。

圖8 生物樣品及加標生物樣品（200 ng/mL）的色譜圖Fig．8 Chromatograms of a biological sample and the sample spiked with 200 ng/mL of analytes

3 結(jié) 論

本文建立了N-CNTs-HF-LPME-HPLC 檢測生物樣品中溴系阻燃劑的分析方法。該方法使用NCNTs 修飾HF，通過固相協(xié)同作用增強了對TBBPA和BDE209的萃取效率；同時利用HF在萃取目標物的同時進行了蛋白質(zhì)排阻，簡化了前處理步驟，縮短了分析時間。與傳統(tǒng)方法相比，該方法準確快速，靈敏度高，使用有機溶劑少，綠色環(huán)保，適用于復雜基質(zhì)中TBBPA和BDE209的檢測，可為N-CNTs-HF-LPME 在生物樣品中持久性有機污染物的分析提供參考。