QuEChERS結合HPLC-Q-TOF MS 快速篩查霜膏類化妝品中297種風險物質(zhì)

王 璐，曾廣豐，侯穎燁，董 潔，蔡翠玲，肖可茵，張憲臣，李嘉儀，謝建軍*

（1．廣州海關技術中心，廣東 廣州 510623；2．國家級進出口食品質(zhì)量安全風險驗證評價實驗室（化妝品），廣東 廣州 510623；3．中山海關技術中心，廣東 中山 528400）

我國作為世界化妝品消費第一大國，化妝品安全問題日益成為關注焦點?；瘖y品禁用原料目錄包括1 284項禁用物質(zhì)［1］，其種類繁多，數(shù)量龐大，然而現(xiàn)有的檢測標準和文獻方法有限，可能會使某些違法添加行為處于監(jiān)測盲區(qū)［2］。因此，對于化妝品中風險物質(zhì)的檢測，亟需建立一種滿足定性與定量要求的快速、高效的廣譜篩查模式。

常見的廣譜篩查技術包括組學［3］、指紋圖譜［4］、拉曼光譜［5］、高分辨質(zhì)譜［6-8］等，其中，以飛行時間質(zhì)譜（TOF MS）為代表的高分辨質(zhì)譜技術因具有質(zhì)量分辨率高、掃描速度快、采集信息量大等優(yōu)勢，在有毒有害化合物篩查鑒定方面被廣泛應用［9-12］。例如，曾廣豐等［13］運用高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（HPLC-Q-TOF MS）非靶向快速篩查涼茶中的非法添加物；章璐幸等［14］建立了谷物中18 種真菌毒素的HPLC-Q-TOF MS 非靶向篩查方法；黎梓城等［15］利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF MS）建立了同時檢測食品接觸用塑料中50種添加劑遷移量的方法。

本研究選擇45 種化合物作為質(zhì)控化合物，基于超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術，建立了霜膏類化妝品的QuEChERS 前處理方法，并擴展運用于297 種風險物質(zhì)的HPLC-QTOF MS 靶向篩查，構建了化妝品風險物質(zhì)的高分辨質(zhì)譜篩查列表。風險物質(zhì)的種類覆蓋β-受體激動劑、阻斷劑類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類、非甾醇消炎藥類、苯并咪唑類、激素類、β-內(nèi)酰胺類、酰胺醇類、農(nóng)藥等。該方法可用于化妝品中風險物質(zhì)的識別和發(fā)現(xiàn)，能有效解決化妝品風險物質(zhì)“檢不全，檢不快”的問題，為化妝品質(zhì)量安全監(jiān)管提供了重要的技術手段。

1 實驗部分

1.1 標準品、試劑及樣品

297種標準品均購自天津阿爾塔科技有限公司，純度為89．3%～99．9%，質(zhì)量濃度均為100 mg/L。其中45 種質(zhì)控化合物分為2 組，組1：鹽酸克倫特羅、鹽酸妥布特羅、林可霉素鹽酸鹽、甲苯噻嗪、甲氧芐氨嘧啶、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氟羅沙星、氧氟沙星、奧比沙星、甲磺酸培氟沙星、2-氨基氟苯達唑、5-羥基甲苯咪唑、坎苯達唑、氟苯達唑、氨基甲苯咪唑、丙氧苯咪唑、噻苯噠唑、乙氧酰胺苯甲酯、氮哌酮、殺蟲脒、金剛烷胺、頭孢匹啉、頭孢拉定、阿莫西林三水合物、替諾昔康；組2：苯甲酰磺胺、磺胺甲基異唑、磺胺苯吡唑、磺胺喹啉、氟尼辛葡甲胺、苯硫胍、甲芬那酸、胺丙畏、潑尼松、曲安西龍、丙磺舒、二甲雙胍、鹽酸萘甲唑啉、胍乙啶、鹽酸苯乃嗪、布坦卡因鹽酸鹽、非諾唑酮、異唑肼、帕拉米松。

甲醇、乙腈、無水乙醇、甲酸均為HPLC 級，購自美國Thermo Fisher 公司。氯化鈉、中性氧化鋁（Al-N）、氨丙基粉（NH2）、石墨化炭黑（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）、硅膠粉、十八烷基鍵合硅膠（C18）均購自上海安譜公司。實驗用水為Milli-Q超純水。

霜膏類化妝品樣品主要為實驗室送檢樣品，包括面霜、護手霜、粉底霜等。

1.2 儀器條件

1.2.1 UPLC-MS/MS條件色譜條件見表1。質(zhì)譜條件：API 4000Q Trap UPLC-MS/MS（美國AB公司），配備ESI離子源；正離子掃描；多反應監(jiān)測（MRM）模式；氣簾氣壓力：1．03×105Pa；霧化氣壓力：3．45×105Pa；加熱輔助氣壓力：3．45×105Pa；碰撞氣壓力：Medium；電離壓力：5 500 V；離子源溫度：550 ℃。

表1 儀器色譜條件Table 1 Instrument chromatographic conditions

1.2.2 HPLC-Q-TOF MS 條件色譜條件見表1。質(zhì)譜條件：LC-20AD 液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司），TripleTOFTM5600高分辨質(zhì)譜儀（美國AB公司），配備ESI和APCI離子源，樣液為ESI離子化方式，APCI 源連接自動校正系統(tǒng)，每10個樣品自動校正1次；正負離子分別掃描；一級TOF MS掃描范圍m/z：100 ～1 000 Da，采集時間100 ms；二級IDA-MS掃描范圍m/z：50～1 000 Da，采集時間50 ms；氣簾氣壓力：2．76×105Pa；錐孔電壓：5 500 V；離子源溫度：650 ℃；去簇電壓：100 V；碰撞能量：40、55 eV。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理準確稱取0．5 g（精確至0．001 g）樣品于10 mL具塞比色管中，加入1．0 mL飽和氯化鈉溶液使樣品均勻分散，加入8 mL 無水乙醇，渦旋振蕩1 min，使試樣與提取溶劑充分混勻，超聲提取15 min，用無水乙醇定容至10 mL，搖勻，以10 000 r/min 離心5 min。吸取1．00 mL 上清液于裝有50 mg C18粉的1．5 mL 離心管中，渦旋振蕩2 min，以12 000 r/min 離心5 min，取上清液過0．22 μm 有機濾膜，待HPLC-Q-TOF MS測定，并采用空白樣品提取液配制標準曲線。

1.3.2 建立篩查列表將1 mg/L 的混合標準溶液按照“1．2．2”方法上機測定，得到所有化合物的一級和二級質(zhì)譜圖，并與文獻報道進行比較，建立297 種化合物的高分辨質(zhì)譜篩查表，包括化合物的名稱、分子式、離子化模式、保留時間、母離子及子離子等信息。

1.3.3 篩查方法利用PeakView 2．0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，將篩查表中化合物的英文名稱、分子式、離子化模式導入軟件，設置精確質(zhì)量數(shù)偏差范圍為± 1×10-5，保留時間偏差范圍為±0．2 min，比較化合物的一級、二級精確質(zhì)量數(shù)、保留時間、碎片離子豐度比的實測值和篩查列表理論值，匹配則鎖定為“可疑目標物”，并采用UPLC-MS/MS進行定量確證。

2 結果與討論

2.1 QuEChERS前處理質(zhì)控研究

選擇不同類別、不同結構、不同極性的45 種代表性化合物作為質(zhì)控化合物，包括β-受體激動劑、阻斷劑類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類、非甾醇消炎藥類、苯并咪唑類、激素類、β-內(nèi)酰胺類、酰胺醇類、農(nóng)藥等，以保證各類化合物的提取、凈化效果。質(zhì)控研究通過UPLC-MS/MS進行數(shù)據(jù)采集，并進行方法驗證，以確保方法穩(wěn)定可靠。

2.1.1 凈化劑種類及用量的優(yōu)化考察了C18、PSA、NH2、Al-N、GCB、硅膠粉6 種吸附劑在相同用量下的凈化效果及最佳用量，結果顯示，C18對45 種質(zhì)控化合物的吸附最小，回收率為56．0%～103%，其他5種吸附劑均影響較大，其中頭孢匹啉、頭孢拉定和替諾西康等的回收率不足40%，部分化合物的回收率偏高。同時考察了C18用量（30、50、70、90、110 mg）對凈化效果的影響，發(fā)現(xiàn)當C18用量為50 mg時，45種質(zhì)控化合物的回收率在99．5%～121%之間，吸附影響最?。划斢昧俊?0 mg時，隨著用量的增大，吸附影響越來越大。因此，選擇50 mg C18作為最佳凈化劑。

2.1.2 提取溶劑的選擇考察了甲醇、無水乙醇、乙腈對霜膏類化妝品的提取效果，發(fā)現(xiàn)使用甲醇作為提取溶劑時，大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類等的回收率偏低；使用乙腈和無水乙醇作為提取溶劑時，質(zhì)控化合物的回收率總體較好，而無水乙醇提取的響應和峰形優(yōu)于乙腈提取，因此，優(yōu)先考慮使用無水乙醇進行提取。考慮到霜膏類化妝品較為粘稠，分散溶劑穿透能力強，可使樣品更均勻，因此使用常見的飽和氯化鈉溶液作為分散溶劑，再使用無水乙醇提取的方法進一步優(yōu)化環(huán)丙沙星、噻苯噠唑等的回收率。結果顯示，45種質(zhì)控化合物的回收率為87．0%～119%，效果較好。

2.1.3 基質(zhì)效應通過標準曲線法考察基質(zhì)效應，采用無水乙醇和空白基質(zhì)溶液分別配制標準曲線。結果發(fā)現(xiàn)，用無水乙醇配制的標準曲線進行定量分析時，林可霉素鹽酸鹽、甲氧芐氨嘧啶、恩諾沙星等化合物的回收率偏低，最低僅為19．4%；5-羥基甲苯咪唑、頭孢匹啉等的回收率偏高，最高達316%。而用基質(zhì)配制的曲線定量時，回收率為83．8%～119%。因此，本研究采用空白樣品提取液配制標準曲線以消除基質(zhì)效應。

2.1.4 方法驗證在空白霜膏類化妝品中添加不同低濃度水平的質(zhì)控化合物標準溶液，處理后按“1．2．1”條件進行分析，部分質(zhì)控化合物的MRM 離子流色譜圖如圖1所示。結果顯示，45種質(zhì)控化合物在對應的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系，相關系數(shù)（r2）＞0．99。檢出限（LOD）為0．01～0．20 mg/kg，定量下限（LOQ）為0．04～0．40 mg/kg（見表2）。采用空白基質(zhì)進行低、中、高3個濃度水平的加標實驗，同時進行6 組平行實驗，結果顯示，45 種質(zhì)控化合物的回收率為81．5%～117%，相對標準偏差（RSD）為2．0%～14%，回收率和RSD均滿足要求。

圖1 部分質(zhì)控化合物的MRM離子流色譜圖Fig． 1 MRM ion flow chromatograms of partial quality control compounds A：clenbuterol hydrochloride；B：tulobuterol hydrochloride；C：lincomycin hydrochloride

表2 45種化合物的保留時間、質(zhì)譜參數(shù)、檢出限與定量下限Table 2 Retention times，MS parameters，limits of detection and limits of quantitation of 45 compounds

2.2 HPLC-Q-TOF MS 快速篩查

基于“2．1”所建立的QuEChERS前處理方法可知，其穩(wěn)定性好、靈敏度高，將其進一步擴展應用于霜膏類化妝品中297種風險物質(zhì)的靶向篩查。樣品經(jīng)提取、凈化，HPLC-Q-TOF MS 上機測定，采集一級質(zhì)譜信息（如保留時間、精確質(zhì)量數(shù)等）并與所建立的篩查列表（見表3）進行比對分析，對精確質(zhì)量數(shù)偏差在± 1×10-5內(nèi)，保留時間偏差在± 0．2 min 內(nèi)的化合物，繼續(xù)進行二級碎片離子信息的比對，若二級碎片離子及豐度比匹配，則鎖定“可疑目標物”，再采用UPLC-MS/MS 進行確證分析。UPLCMS/MS確證后則判定為檢出。本方法完全滿足霜膏類化妝品中297種風險物質(zhì)快速篩查的方法學要求。

表3 297種風險物質(zhì)的名稱、分子式、離子化模式、保留時間、母離子與子離子Table 3 Names，formula，ion modes，retention times，precursor ions and product ions of 297 risk substances

2.3 實際樣品檢測

隨機抽取29份霜膏類化妝品樣品，采用“1．2．2”方法快速定性篩查297種風險物質(zhì)，檢出的風險物質(zhì)再進行定量分析。結果表明，兩款面霜篩查出風險物質(zhì)，其中一款面霜檢出甲芬那酸、鹽酸賽庚啶、克林霉素，檢出量分別為0．099 4、318 0、0．042 mg/kg，另一款面霜檢出甲芬那酸、鹽酸賽庚啶和林可霉素，檢出量分別為0．102 2、0．157 4、412 mg/kg。

3 結 論

本研究基于 QuEChERS 結合HPLC-Q-TOF MS 建立了霜膏類化妝品中297 種風險物質(zhì)的篩查方法。選擇45 種化合物作為質(zhì)控化合物，優(yōu)化了QuEChERS 前處理條件，建立了297 種風險物質(zhì)的高分辨質(zhì)譜篩查列表。該方法操作簡單，具有較好的靈敏度和準確度，實現(xiàn)了對多種風險物質(zhì)殘留的快速篩查，解決了化妝品風險物質(zhì)殘留“檢不全，檢不快”的問題，可助力我國化妝品行業(yè)健康發(fā)展。