乳頭狀腎細(xì)胞癌診斷和預(yù)后相關(guān)miRNA的生物信息學(xué)研究

王寧,劉昌偉,褚校涵,王曉甫,趙興華,郝斌,許長寶

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 泌尿外科,河南 鄭州 453000)

腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)致死率最高的惡性腫瘤,且發(fā)病率持續(xù)升高。乳頭狀腎細(xì)胞癌(papillary renal cell carcinoma,PRCC)是第二常見的腎細(xì)胞癌,占15%～20%[1]。根據(jù)病理學(xué)特征,PRCC可分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型PRCC的瘤體由管狀及小核仁的乳頭狀嗜堿性細(xì)胞組成;Ⅱ型PRCC的瘤體則由大核仁的嗜酸性細(xì)胞組成。Ⅱ型PRCC細(xì)胞生物惡性度相對(duì)較高,常對(duì)應(yīng)高T分期和差的核分級(jí),易出現(xiàn)血管浸潤或遠(yuǎn)處遷移,預(yù)后更差[2]。目前早期PRCC患者的首選治療方式是手術(shù)治療,晚期患者缺乏有效的治療方法[3]。早發(fā)現(xiàn)、早治療PRCC十分重要。本研究基于生物信息學(xué)挖掘PRCC生物標(biāo)志物有助于診斷和預(yù)后評(píng)估,可為臨床治療提供新思路。

miRNA是一類內(nèi)源性、非編碼、單鏈小RNA,通過調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)參與一系列生物過程[4-5]。miRNA可通過正向或負(fù)向調(diào)控靶基因,發(fā)揮促癌或抑癌作用[6],也可參與腫瘤免疫識(shí)別以及免疫逃逸,引起免疫系統(tǒng)紊亂,進(jìn)而影響癌癥進(jìn)展[7]。基于miRNA在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用,miRNA作為癌癥生物學(xué)標(biāo)志物被廣泛用于早期診斷及預(yù)后評(píng)估[8-9]。本研究通過生物信息學(xué)方法分析TCGA數(shù)據(jù)庫中PRCC臨床信息及miRNAs表達(dá),旨在挖掘PRCC診斷和預(yù)后相關(guān)的miRNA生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的獲取與處理

從TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)數(shù)據(jù)庫下載326例樣本miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)(292例PRCC樣本,34例正常樣本)及匹配的臨床數(shù)據(jù)(291例PRCC樣本,34例正常樣本),如年齡、性別、腫瘤分期、生存狀態(tài)等(項(xiàng)目ID為TCGA-KIRP)。

1.2 差異表達(dá)miRNA篩選

利用R軟件“edgeR”包篩選出差異表達(dá)miRNAs(|log2FC|>1,P<0.05),并繪制熱圖和火山圖。

1.3 篩選PRCC診斷及預(yù)后相關(guān)的差異表達(dá)miRNA

利用單因素Cox回歸、LASSO及多因素Cox回歸分析篩選與生存相關(guān)的miRNAs(P<0.05)。借助R軟件“Survival”包繪制生存曲線。并借助受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線評(píng)價(jià)其診斷PRCC的準(zhǔn)確度。

1.4 轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

借助GeneCards(https://www.genecards.org)和TransmiR (https://www.cuilab.cn/transmir)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)篩選差異表達(dá)miRNAs的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF),并對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果取交集。運(yùn)用Cytoscape軟件將miRNAs及其TFs進(jìn)行可視化。

1.5 靶基因預(yù)測(cè)

借助miRDB(http://www.mirdb.org)、TargetScan(https://www.targetscan.org/vert_80/)、miRTarBase(https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/～miRTarBase/miRTarBase_2022/php/index.php)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異表達(dá)miRNAs的靶基因預(yù)測(cè),其中miRDB數(shù)據(jù)庫中選取靶基因預(yù)測(cè)得分>80。取3個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)結(jié)果的交集,并運(yùn)用Cytoscape軟件將miRNAs及其靶基因進(jìn)行可視化。

1.6 靶基因的功能富集分析

借助DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)將篩選的差異表達(dá)miRNAs靶基因進(jìn)行GO以及KEGG富集分析,探索靶基因涉及的生物學(xué)過程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)、分子功能(melecular function,MF)以及參與的信號(hào)通路。

1.7 免疫浸潤

借助TIMER 2.0免疫浸潤數(shù)據(jù)庫(http://cistrome.dfci.harvard.edu/TIMER/)分析miRNA靶基因與多種免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用R軟件進(jìn)行差異表達(dá)miRNA篩選、單因素Cox、LASSO及多因素Cox回歸分析及ROC曲線繪制和生存分析。借助GraphPad Prism9軟件進(jìn)行不同腫瘤Stage、TMN分期的miRNA表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析,采用單因素ANOVA分析及Bonferroni法校正。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)miRNAs

TCGA數(shù)據(jù)庫中292例PRCC樣本和34例正常樣本共篩選出163個(gè)差異表達(dá)miRNAs(|log2FC|>1,P<0.05),其中82個(gè)miRNAs上調(diào),81個(gè)miRNAs下調(diào)。顯著上調(diào)的5個(gè)miRNAs分別為hsa-miR-21、hsa-miR-106b、hsa-miR-589、hsa-miR-671和hsa-miR-93;顯著下調(diào)的5個(gè)miRNAs分別為hsa-miR-184、hsa-miR-33a、hsa-miR-129-2、hsa-miR-129-1、hsa-miR-126(圖1)。

圖1 差異表達(dá)的miRNA

2.2 篩選預(yù)后相關(guān)及診斷PRCC的差異表達(dá)miRNAs

為分析差異表達(dá)miRNAs對(duì)PRCC的預(yù)后影響及其診斷意義,選取TCGA數(shù)據(jù)庫共291例PRCC樣本的生存時(shí)間信息進(jìn)行處理。單因素Cox回歸初篩出14個(gè)差異表達(dá)miRNAs與患者的總體生存率相關(guān)(P<0.05,HR>1),分別為hsa-miR-589、hsa-miR-219a-1、hsa-miR-34a、hsa-miR-3170、hsa-miR-875、hsa-miR-599、hsa-miR-4636、hsa-miR-211、hsa-miR-551b、hsa-miR-1258、hsa-miR-4423、hsa-miR-486-2、hsa-miR-486-1、hsa-miR-4732。采用LASSO回歸進(jìn)一步篩選出6個(gè)與預(yù)后相關(guān)的差異表達(dá)miRNAs,分別為:hsa-miR-219a-1、hsa-miR-34a、hsa-miR-3170、hsa-miR-551b、hsa-miR-1258、hsa-miR-4423。采用多因素Cox回歸分析進(jìn)一步篩選,結(jié)果顯示hsa-miR-34a和hsa-miR-551b與PRCC預(yù)后相關(guān)(P<0.05,圖2A)。以miRNA的中位表達(dá)量將PRCC樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,并繪制生存曲線。生存分析顯示, hsa-miR-34a及 hsa-miR-551b高表達(dá)組的生存期明顯長于低表達(dá)組(P<0.001,圖2B)。

A為多因素Cox回歸分析結(jié)果;B為hsa-miR-34a及hsa-miR-551b的生存曲線圖,以其在PRCC樣本表達(dá)量的中位數(shù)為基準(zhǔn)劃分高表達(dá)和低表達(dá);C為hsa-miR-34a及hsa-miR-551b在不同分期的表達(dá)量(**P<0.01,***P<0.001)。

為進(jìn)一步探索hsa-miR-34a及hsa-miR-551b表達(dá)量與PRCC臨床分期的關(guān)系,本文分析hsa-miR-34a及hsa-miR-551b在PRCC不同腫瘤Stage、TMN分期中的表達(dá)量。結(jié)果顯示,hsa-miR-34a在PRCC Stage Ⅲ、Ⅳ期、M1期、N2期、T3期的表達(dá)量下調(diào)(P<0.01,圖2C),提示hsa-miR-34a表達(dá)水平與臨床分期相關(guān),對(duì)PRCC發(fā)展可能存在一定的抑制作用。對(duì)比hsa-miR-551b在PRCC不同腫瘤Stage、TMN分期中的表達(dá)量,圖2C顯示隨著腫瘤進(jìn)展,hsa-miR-551b表達(dá)水平出現(xiàn)不同程度的下調(diào)。

繪制hsa-miR-34a及hsa-miR-551b的ROC,結(jié)果顯示hsa-miR-34a的曲線下面積(area under curve,AUC)>0.7,診斷PRCC的準(zhǔn)確度和敏感度更高(圖3)。

圖3 hsa-miR-34a及hsa-miR-551b的ROC曲線

2.3 轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

轉(zhuǎn)錄因子可激活或抑制miRNA,介導(dǎo)miRNA成熟。圖4顯示,hsa-miR-34a的上游轉(zhuǎn)錄因子包含經(jīng)典的TP53、STAT1、STAT3及FOS等共26個(gè)。

圖4 hsa-miR-34a的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

2.4 靶基因功能分析

TargetScan、miRDB(靶基因預(yù)測(cè)得分>80)及miRTarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)結(jié)果取交集顯示hsa-miR-34a的靶基因共28個(gè)(圖5A)。GO富集分析顯示,hsa-miR-34a靶基因主要參與以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控及細(xì)胞因子生成負(fù)調(diào)控等生物學(xué)過程(圖5B)。其中靶基因PPP1R11及LGR4參與細(xì)胞因子生成負(fù)調(diào)控。細(xì)胞定位分析顯示靶基因主要位于細(xì)胞核(圖5C)。KEGG分析顯示靶基因主要富集在癌癥中的miRNAs通路和甲狀腺激素通路(圖5D)。

A為hsa-miR-34a的預(yù)測(cè)靶基因;B為靶基因的GO-生物過程分析;C為靶基因的亞細(xì)胞定位;D為靶基因的KEGG通路分析。

2.5 PPP1R11及LGR4與免疫細(xì)胞的關(guān)系

T細(xì)胞、B細(xì)胞可誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生,進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)。GO-BP分析顯示hsa-miR-34a的靶基因PPP1R11及LGR4參與細(xì)胞因子生成的負(fù)調(diào)控。借助TIMER2.0分析PPP1R11及LGR4表達(dá)與多種免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞)浸潤水平的相關(guān)性。結(jié)果顯示,PRCC患者PPP1R11表達(dá)與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的浸潤水平呈正相關(guān)(圖6A);LGR4表達(dá)與樹突狀細(xì)胞的浸潤水平呈正相關(guān)(圖6B)。

圖6 PPP1R11及LGR4表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤水平的關(guān)系

3 討論

miRNA表達(dá)穩(wěn)定、特異性強(qiáng)且檢測(cè)靈敏度高,因此被廣泛用于疾病及癌癥的早期檢測(cè)、療效預(yù)測(cè)、實(shí)時(shí)并發(fā)癥監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷[10-12]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)miRNA在RCC腫瘤組織鑒別、組織學(xué)分型及預(yù)后判斷方面發(fā)揮作用[13-14]。Faragalla 等[15]發(fā)現(xiàn)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌及PRCC患者h(yuǎn)sa-miR-21表達(dá)升高,且其表達(dá)量與癌癥Stage分期呈正相關(guān),與生存周期呈負(fù)相關(guān),可用于鑒別診斷透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌、PRCC與嫌色腎細(xì)胞癌、嗜酸細(xì)胞瘤。上述研究提示miRNA在PRCC早期診斷、分期鑒定及預(yù)后評(píng)估中的潛在作用。

本研究對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫共292例PRCC樣本及34例正常樣本的miRNA進(jìn)行差異分析,篩選出163個(gè)差異表達(dá)miRNAs,其中82個(gè)上調(diào),81個(gè)下調(diào)。進(jìn)一步利用單因素Cox、LASSO及多因素Cox回歸篩選出2個(gè)與PRCC預(yù)后相關(guān)的miRNAs:hsa-miR-34a和hsa-miR-551b,其中hsa-miR-34a的診斷準(zhǔn)確度和敏感度更高。隨著腫瘤瘤體增大,浸潤程度增加,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)遷移,患者預(yù)后不良且hsa-miR-34a表達(dá)降低,而hsa-miR-34a高表達(dá)的PRCC患者預(yù)后良好,提示hsa-miR-34a可能抑制PRCC發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-34a抑制癌細(xì)胞增殖與浸潤,抑制腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展[16-18],且對(duì)乳腺癌、結(jié)腸癌等多種實(shí)體瘤均存在抑制作用[19-21]。因此,hsa-miR-34a有望成為PRCC新的診斷及預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。

轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合miRNA的特定序列,調(diào)控miRNA表達(dá)。本文借助GeneCards及TransmiR數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)hsa-miR-34的上游轉(zhuǎn)錄因子,其中TP53、STAT3等參與癌細(xì)胞浸潤與轉(zhuǎn)移,影響癌癥發(fā)生發(fā)展,與相關(guān)研究結(jié)果[22-23]一致。抑癌因子p53可占據(jù)hsa-miR-34a轉(zhuǎn)錄起始位置附近的高度保守結(jié)合位點(diǎn),激活hsa-miR-34a轉(zhuǎn)錄,抑制上皮細(xì)胞間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT),抑制癌細(xì)胞浸潤與轉(zhuǎn)移[22]。STAT3磷酸化則抑制hsa-miR-34a表達(dá),促進(jìn)EMT、腫瘤細(xì)胞浸潤與轉(zhuǎn)移[22-23]。

為探索hsa-miR-34a參與抑制PRCC的潛在機(jī)制,本文借助多個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)其靶基因并進(jìn)行通路富集和功能分析。其中,hsa-miR-34a可引起PPP1R11表達(dá)下調(diào),進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT與浸潤[24]。SHCBP1在多種癌癥中過表達(dá),抑制SHCBP1表達(dá)可誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡、抑制遷移與浸潤[25-27]。研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中DCAF7表達(dá)上調(diào)[28]。采用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因功能富集分析。KEGG分析顯示,hsa-miR-34a的靶基因不僅參與miRNAs與癌癥通路,也通過甲狀腺激素通路介導(dǎo)PRCC的發(fā)生發(fā)展。研究表明miRNAs與癌癥通路也參與肺腺癌預(yù)后相關(guān)miRNA靶基因調(diào)控通路[29]。甲狀腺激素T3和T4借助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入胞內(nèi),隨后T4轉(zhuǎn)化為T3,T3轉(zhuǎn)移入核,與配體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,招募聚合酶Ⅲ,進(jìn)而激活下游基因表達(dá)[30]。甲狀腺激素紊亂可增加患多種癌癥的風(fēng)險(xiǎn),研究表明甲亢患者患甲狀腺癌、乳腺癌、前列腺癌及肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)增加[31-32]。且甲亢病史10 a甚至更長的患者,尤其是女性患者,患肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)更高[33]。GO富集結(jié)果顯示,hsa-miR-34a的靶基因參與RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、炎癥因子生成負(fù)調(diào)控等生物學(xué)過程,且上述生物學(xué)過程均與癌癥的產(chǎn)生及發(fā)生發(fā)展相關(guān)[34-35]。研究表明炎癥與癌癥關(guān)系密切,炎癥過程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子等炎癥介質(zhì)誘發(fā)癌癥[36]。炎癥因子生成減少,炎癥反應(yīng)減輕,癌癥發(fā)生率降低。本研究結(jié)果顯示靶基因PPP1R11、LGR4與細(xì)胞因子生成負(fù)調(diào)控緊密相關(guān)。PPP1R11可抑制炎癥因子分泌,減輕炎癥反應(yīng)[37]。而LGR4可激活NF-κB信號(hào)通路,誘導(dǎo)炎癥因子等產(chǎn)生,引起炎癥反應(yīng)[38]。

T細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥調(diào)控可影響癌癥免疫豁免、免疫監(jiān)測(cè),參與癌癥的發(fā)生發(fā)展[39-41]。本文發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞因子生成負(fù)性調(diào)控的靶基因表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤水平關(guān)系緊密。PPP1R11表達(dá)與PRCC中B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的浸潤水平呈正相關(guān)。Joshi等[37]也發(fā)現(xiàn)PPP1R11可調(diào)節(jié)T細(xì)胞對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)抑制作用的敏感度。LGR4表達(dá)與PRCC中樹突狀細(xì)胞的浸潤水平呈正相關(guān)。LGR4表達(dá)變化引起免疫平衡改變,CD4+T、CD16+NK細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD20+B細(xì)胞等免疫細(xì)胞數(shù)量發(fā)生不同改變[42]。Tan等[43]發(fā)現(xiàn)LGR4通過介導(dǎo)LGR4/ERK/STAT3通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化,誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖及浸潤。由此推測(cè)hsa-miR-34a的靶基因PPP1R11及LGR4參與細(xì)胞因子生成負(fù)性調(diào)節(jié),且可通過影響PRCC多種免疫細(xì)胞浸潤,影響患者預(yù)后。

4 結(jié)論

本研究采用生物信息學(xué)方法篩選出hsa-miR-34a與PRCC診斷及預(yù)后相關(guān)。hsa-miR-34a對(duì)多種癌癥均有一定的抑制作用,但影響PRCC預(yù)后的研究鮮有報(bào)道,有望成為新的PRCC早期篩查及預(yù)后判斷標(biāo)志物。