紅和綠香椿芽貯藏過程中花青素和木質(zhì)素含量及相關(guān)基因表達分析

趙 倩,朱順華,蔡 霞,文曉鵬,譚國飛,孟平紅*

(1 貴州大學 生命科學學院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院,山地植物資源保護與保護種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室,貴陽 550025;2 貴州省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所/貴州省園藝工程技術(shù)研究中心,貴陽 550006;3 吉林農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院,長春 130118)

香椿(ToonasinensisL.),是中國特有的木本蔬菜之一[1-2],富含多種營養(yǎng)與活性物質(zhì),具有抗氧化、抗癌、抗炎、降血糖等保健功效[3-4]。根據(jù)香椿嫩芽的顏色,可將香椿分為紅香椿和綠香椿兩大類[5]。新鮮香椿芽含水量高,采后新陳代謝旺盛,在室溫下不耐貯藏,采后貯藏過程中紫紅色逐漸變?yōu)樯罹G色[6],且極易發(fā)生萎焉、腐爛、褐變及木質(zhì)化等現(xiàn)象,貨架期短,嚴重影響了香椿的商品和經(jīng)濟價值[7]。

低溫貯藏是果蔬貯藏常用的貯藏方式,在一定溫度范圍內(nèi),可抑制果蔬的呼吸作用和蒸騰作用,減少乙烯的釋放和營養(yǎng)物質(zhì)的流失,延緩腐爛、衰老和組織褐變,延長貯藏期和貨架期[8]。近年來,關(guān)于香椿芽低溫貯藏的研究已有報道,主要集中在貯藏溫度[9]、包裝材料[10-13]、噴施外源物質(zhì)[14-17]對紅香椿芽貯藏期間營養(yǎng)物質(zhì)、微生物多樣性及酶活性變化的影響等方面。

花青素和木質(zhì)素作為香椿芽的重要物質(zhì)成分,是評價香椿芽品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標之一。研究香椿芽采后貯藏過程中花青素和木質(zhì)素含量對其品質(zhì)調(diào)控具有積極意義。然而,國內(nèi)外對香椿芽采后花青素和木質(zhì)素含量變化的研究較少。本研究以4月上旬采自貴州省織金縣板橋鎮(zhèn)紅光村相同樹齡(4年)的紅和綠香椿芽為試驗材料,觀察香椿芽采后低溫貯藏過程中色澤變化,并測定香椿芽葉和葉柄花青素和木質(zhì)素含量,且通過石蠟切片觀察其葉和葉柄木質(zhì)部細胞的變化。另外,根據(jù)課題組建立的香椿芽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,檢索和鑒定與香椿芽花青素和木質(zhì)素合成途徑相關(guān)基因,并利用qRT-PCR對紅和綠香椿芽葉和葉柄花青素與木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達水平進行分析,旨在為進一步指導香椿芽貯藏保鮮及其品質(zhì)調(diào)控研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料采集和固定

2022年4月上旬,采摘種植于貴州省織金縣板橋鎮(zhèn)紅光村(105.71°E, 26.79°N)相同樹齡(4年)、生長狀況一致、無機械損傷的紅和綠香椿芽。采摘后分別裝入聚乙烯包裝袋中進行4 ℃低溫黑暗貯藏。分別于貯藏0 d(采摘當天)、1 d、2 d、3 d的同一時間(早上7:00)取樣。取樣時選取不同貯藏期的紅和綠香椿芽各3個,進行3次生物學重復,分別將紅和綠香椿芽的葉片和葉柄用錫箔紙包好,一部分快速放入液氮中速凍,并保存于-80 ℃冰箱,用于紅和綠香椿芽葉片和葉柄RNA的提取和花青素含量的測定,一部分置于烘箱80 ℃烘干至恒重,用于木質(zhì)素含量的測定。同時,分別取紅和綠香椿芽不同貯藏期葉片及葉柄用FAA(Formalin-Aceto-Alcohol)固定液(70%酒精90 mL,福爾馬林5 mL,冰醋酸5 mL)[18]進行固定,用于組織切片,觀察葉脈和葉柄的組織結(jié)構(gòu)。

1.2 香椿芽色澤及葉片、葉柄組織結(jié)構(gòu)觀察

先仔細觀察不同貯藏時期香椿芽的色澤變化,然后制作石蠟切片和進行組織化學染色。用FAA固定液分別將不同貯藏期紅、綠香椿芽同一部位的葉片和葉柄固定24 h,經(jīng)乙醇梯度脫水,使用石蠟浸透與包埋。

利用石蠟切片機將樣品切成4 μm厚的切片,用番紅—固綠染色液染色,乙醇梯度脫色脫水后封片,最后在光學顯微鏡下(NIKON ECLIPSE E100,尼康儀器上海有限公司)觀察葉脈及葉柄組織結(jié)構(gòu),并進行拍照。

1.3 香椿芽葉片和葉柄花青素和木質(zhì)素含量測定

1.3.1 花青素含量

花青素的提取及其含量的測定參照王歡等[19]和譚國飛等[20]的方法進行。

具體步驟:使用液氮將采后不同貯藏期紅和綠香椿芽葉片和葉柄研磨成粉末后,各稱取約0.2 g放入20 mL 95%乙醇中,室溫暗光下浸提8 h。浸提液用0.25 μm濾頭過濾后,使用紫外分光光度計(Alpha-1860,上海譜元儀器有限公司)測定其在530,620,650 nm波長下的吸光度值D530、D620和D650。

根據(jù)公式[D=(D530-D620)-0.1(D650-D620)]并按照0.1個吸光度為1個花青素單位,計算不同貯藏期紅和綠香椿芽葉片和葉柄花青素含量。每個樣品進行3次生物學重復。

1.3.2 木質(zhì)素含量

取不同貯藏期的紅、綠香椿芽葉片和葉柄干樣置于研缽研磨成粉末,過30～50目篩,然后使用Solarbio生物科技有限公司的木質(zhì)素含量檢測試劑盒,提取木質(zhì)素并計算木質(zhì)素含量。每個樣品進行3次生物學重復

1.4 香椿芽葉片和葉柄花青素和木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達分析

1.4.1 RNA提取及cDNA合成

將-80 ℃冰箱保存的香椿芽樣品,分別置于滅菌的研缽中,用液氮將不同貯藏期紅和綠香椿芽葉片和葉柄研磨成粉末。各取約0.1 g裝入2 mL無酶的離心管中,采用植物 RNA 提取試劑盒(北京華越洋生物科技有限公司,GX型)提取香椿芽的總 RNA。

使用1.5%的瓊脂糖凝膠檢測香椿芽總RNA的完整性及使用微量分光光度計Nanodrop ND-100 (Nanodrop Technology Inc., DE, USA)檢測香椿芽總RNA的濃度。利用HiScriptⅢ 1st Strandc DNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司,該試劑盒中有去除基因組成分),按照說明書將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。最后,用滅菌的ddH2O 稀釋15倍,保存于-20 ℃冰箱備用。

1.4.2 花青素和木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達分析

根據(jù)花青素和木質(zhì)素合成的代謝通路,從香椿芽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中檢索獲得花青素合成基因苯丙氨酸解氨酶基因(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、肉桂酸-4-羥化酶基因(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)、查爾酮合成酶基因(chalcone synthase,CHS)、查爾酮異構(gòu)酶基因(chalcone isomerase,CHI)、黃烷酮-3-羥化酶基因(flavanone 3-hydroxylase,F3H)、類黃酮3′,5′羥化酶基因(flavonol 3′,5′ hydroxylase,F3′5′H)、二氫黃酮醇還原酶基因(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)、花青素合成酶基因(anthocyanidin synthesis,ANS)、花青素-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase,3GT)等9個,以及木質(zhì)素合成基因4-香豆酸輔酶A連接酶基因(4-coumarate CoA ligase,4CL)、肉桂酰輔酶A還原酶基因(cinnamoyl-CoA reductase,CCR)、肉桂醇脫氫酶基因(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)、莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因(shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase,HCT)、香豆酸-3-羥化酶基因(coumaroyl shikimate/quinate 3′-hydroxylase,C3′H)、咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(caffeic acidO-methy Itransferase,COMT)、阿魏酸-5-羥化酶基因(ferulate 5-hydroxylase,F5H)、咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(caffeoyl CoAO-methy Itransferase,CCoAOMT)和漆酶基因(Laccase,LAC)等9個。

以香椿Actin基因(TsActin)作為內(nèi)參基因,設(shè)計qRT-PCR引物(引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,表1)。使用SYBR PremixExTaq 試劑盒(TaKaRa,大連)進行熒光定量實驗。反應體系為20 μL,包括10 μL 2×SYBR qPCR Master Mix,2 μL稀釋的模板cDNA,上、下游引物各0.5 μL,7 μL滅菌的ddH2O,香椿TsActin基因與目的基因一起擴增。每個樣品進行3次生物學重復。PCR反應程序為:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性10 s,54 ℃退火30 s,65 ℃延伸10 s,40個循環(huán);最后8 ℃保存。相對定量表達參照2-ΔΔCT法。

表1 花青素和木質(zhì)素合成相關(guān)基因的qRT-PCR引物

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2007軟件作數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,用IBM Statistics 20.0軟件進行顯著性分析,顯著水平設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 香椿芽貯藏過程中色澤和葉脈、葉柄解剖結(jié)構(gòu)的變化

香椿芽采后4 ℃低溫黑暗貯藏過程中,紅香椿芽貯藏3 d后仍色彩鮮艷,而綠香椿芽采后貯藏1 d葉柄開始出現(xiàn)黑色斑點,隨貯藏時間的延長,黑色斑點逐漸增加,且黑色逐漸加深(圖1),表明綠香椿芽的貯藏時間短。同時,紅、綠香椿芽在采后貯藏期間,葉片紫紅色逐漸變淺,而葉柄的顏色變化甚微。

A. 紅香椿芽;B. 綠香椿芽;Ⅰ. 0 d; Ⅱ. 1 d; Ⅲ. 2 d; Ⅳ. 3 d。下同。

番紅染液可以使細胞壁中的木質(zhì)素呈現(xiàn)紅色,染色時染色程度越深說明木質(zhì)素含量越高[21]。利用顯微鏡觀察紅、綠香椿芽采后4 ℃低溫貯藏過程中葉脈和葉柄細胞結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明,紅香椿芽葉脈(圖2,A-Ⅰ～A-Ⅳ)和葉柄(圖3,A-Ⅰ～A-Ⅳ)木質(zhì)部細胞比綠香椿芽葉脈(圖2,B-Ⅰ～B-Ⅳ)和葉柄(圖3,B-Ⅰ～B-Ⅳ)木質(zhì)部細胞小且細胞數(shù)量少;紅、綠香椿芽采后貯藏過程中,次生細胞壁逐漸增厚,且細胞染色程度上綠香椿芽葉及葉柄紅色較深,表明紅、綠香椿芽貯藏過程中均發(fā)生了木質(zhì)化,但綠香椿芽的木質(zhì)化程度更高。另外,蒸騰作用使組織細胞失水而失去新鮮狀態(tài)[22],貯藏過程中紅香椿芽葉脈和葉柄的木質(zhì)部細胞逐漸增大;而綠香椿芽葉脈和葉柄木質(zhì)部細胞先增大(0～1 d)后變小(2～3 d),表明貯藏過程中綠香椿芽的蒸騰作用較強,水分流失嚴重。

A. 紅香椿芽;B. 綠香椿芽;Ⅰ. 0 d; Ⅱ. 1 d; Ⅲ. 2 d; Ⅳ. 3 d; X. 木質(zhì)部。下同。

圖3 4 ℃低溫貯藏期間香椿芽葉柄結(jié)構(gòu)

2.2 香椿芽貯藏過程中葉片和葉柄花青素和木質(zhì)素含量的變化

圖4,A顯示,在4 ℃低溫貯藏期間,紅香椿芽葉片和葉柄中花青素含量始終明顯高于相應的綠香椿芽,而在同一品種香椿芽內(nèi)又表現(xiàn)為葉片中花青素含量始終高于葉柄。其中,隨貯藏時間的延長,紅、綠香椿芽葉片和葉柄花青素含量均逐漸降低,貯藏3 d時紅香椿芽葉片和葉柄花青素含量分別比采摘當天降低35.88%、33.33%,綠香椿芽葉片和葉柄花青素含量則比采摘當天分別顯著降低了39.13%、37.50%,表明綠香椿芽中花青素降解速率較快。香椿芽木質(zhì)素含量的高低是評價香椿芽品質(zhì)的重要因素。從圖4,B可知,在低溫貯藏期間,2個香椿品種芽內(nèi)木質(zhì)素含量差異較大,始終表現(xiàn)為綠香椿芽木質(zhì)素含量高于紅香椿芽,且紅、綠香椿芽中葉柄木質(zhì)素含量高于葉片。

不同小寫字母表示各貯藏時期間差異顯著(P<0.05)。下同。

其中,隨貯藏時間延長,紅香椿芽葉片木質(zhì)素含量逐漸升高,其葉柄木質(zhì)素含量先上升后下降,而同期的綠香椿芽葉片和葉柄木質(zhì)素含量均呈先上升后下降的趨勢;與貯藏0 d時相比,兩個品種香椿芽葉片和葉柄中木質(zhì)素含量總體均呈升高趨勢,在貯藏3 d時紅香椿芽葉片和葉柄中木質(zhì)素含量分別顯著升高了77.94%和48.71%,綠香椿芽則分別升高了15.30%和30.46%,表明香椿芽在冷藏過程中,紅香椿芽中木質(zhì)素的積累速率較快。

2.3 香椿芽葉片和葉柄花青素和木質(zhì)素合成相關(guān)基因表達量的變化

在紅香椿芽中,隨著貯藏時間的延長,花青素合成相關(guān)基因TsPAL(葉柄)和TsC4H的表達量均呈先升高后下降趨勢,TsCHS、TsF3H和TsANS的表達量均呈逐漸降低的趨勢,TsPAL(葉片)和Ts3GT的表達量呈先降低后升高,然后再降低的趨勢;而TsCHI、TsF3′5′H和TsDFR的表達量在紅香椿芽葉片和葉柄中的變化趨勢不一致,如TsCHI在葉片的表達量呈逐漸降低的趨勢,在葉柄中則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

在綠香椿芽中,隨著貯藏時間的延長,葉片和葉柄中TsPAL基因的表達量均呈先升高后降低的變化趨勢,TsCHI和TsF3H基因的表達量均呈逐漸降低的趨勢;而TsC4H、TsCHS、TsF3′5′H、TsDFR、TsANS和Ts3GT基因的表達量在綠香椿芽不同組織中存在差異,但整體均呈現(xiàn)下降趨勢(圖5)。

圖5 低溫貯藏期間香椿芽花青素合成基因的相對表達量

可見,在香椿芽低溫貯藏過程中,葉片和葉柄中各花青素合成相關(guān)基因的表達量均發(fā)生了顯著變化,但變化趨勢存在差異,除TsPAL和TsC4H基因外,其他花青素合成相關(guān)基因的表達量均顯著下降。

同時,不同品種香椿芽葉片和葉柄冷藏過程中木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達水平具有顯著差異。紅香椿芽采后冷藏過程中,TsHCT基因在葉片中的表達量顯著升高,而在葉柄中的表達量則降低;TsCAD、TsC3′H、TsCOMT、TsF5H和TsCCoAOMT基因的表達量在紅香椿芽葉柄中呈現(xiàn)升高的趨勢,而在紅香椿芽葉片中的表達量降低。在綠香椿芽葉片冷藏過程中,Ts4CL、TsHCT和TsCCoAOMT基因的表達量升高,其中Ts4CL和TsHCT基因的表達量顯著升高;而TsCAD、TsC3′H、TsCOMT和TsLAC基因的表達量顯著下降;TsCCR和TsF5H基因的表達量下降,但差異不顯著。在綠香椿芽葉柄冷藏過程中,TsCCR、TsHCT、TsF5H、TsCCoAOMT和TsLAC基因的表達量升高,其中TsCCR、TsHCT和TsLAC基因的表達量顯著升高,而Ts4CL、TsCAD、TsC3′H和TsCOMT基因的表達量下降,但差異不顯著(圖6)。

圖6 低溫貯藏期間香椿芽木質(zhì)素合成基因的相對表達量

3 討 論

花青素是存在于果蔬中的一種天然水溶性色素,可以作為評價果蔬新鮮程度和綠色植物衰老的指標[23-24]。本研究中紅和綠香椿芽花青素含量在采后4 ℃低溫黑暗貯藏過程中隨貯藏時間的延長呈逐漸下降的趨勢,這與范林林等[25]關(guān)于茄子果皮中花青素含量在貯藏過程中變化趨勢的報道一致,即果蔬貯藏過程中衰老現(xiàn)象的產(chǎn)生與花青素的降解密切相關(guān)。從貯藏性能來看,本研究中綠香椿芽采后低溫貯藏1 d開始出現(xiàn)黑色斑點,且黑色斑點隨貯藏時間的增加而逐漸增多,而紅香椿芽在采后貯藏3 d也未有黑色斑點產(chǎn)生,表明綠香椿芽的貯藏時間短,貯藏保鮮困難。另外,香椿芽不同部位的衰老速度也存在差異,葉柄花青素降解速度比葉片快。

木質(zhì)素是植物細胞壁的主要成分,也是影響果蔬采后貯藏品質(zhì)的重要因素[26]。研究表明,‘濰縣蘿卜’肉質(zhì)根貯藏過程中木質(zhì)素含量顯著增加,這與蘿卜肉質(zhì)根的糠心程度顯著增加高度相關(guān)[27]。竹筍在采后4 ℃低溫貯藏過程中,木質(zhì)素含量呈逐漸上升的趨勢,硬度增加,品質(zhì)下降[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn),香椿芽在采后4 ℃低溫貯藏過程中表現(xiàn)出葉脈和葉柄的次生細胞壁逐漸增厚,木質(zhì)素含量逐漸增加。另外,本實驗中綠香椿芽的木質(zhì)素含量比紅香椿芽高,且紅和綠香椿芽葉柄的木質(zhì)素比葉片高,表明綠香椿芽不耐貯藏以及葉柄的貯藏性能差。同時,香椿芽在低溫冷藏過程中紅香椿芽中木質(zhì)素的積累速度較快,可能是由于將紅香椿芽采收后放于4 ℃進行冷藏,溫度差異變化較大所致。此外,木質(zhì)素的積累還會引起果銹及褐變現(xiàn)象的產(chǎn)生[30-31]。香椿芽貯藏過程中,綠香椿芽產(chǎn)生黑色斑點的時間比紅香椿芽早,表明香椿芽采后黑色斑點的產(chǎn)生與貯藏過程中木質(zhì)素的積累密切相關(guān)。

花青素和木質(zhì)素均是植物苯丙烷類代謝的產(chǎn)物,研究表明,花青素和木質(zhì)素相關(guān)基因的上調(diào)和下調(diào)表達可以顯著增加或減少花青素和木質(zhì)素的含量[32-35]。香椿芽采后貯藏過程中,花青素和木質(zhì)素合成相關(guān)基因(除TsPAL和TsC4H)的表達水平與花青素和木質(zhì)素的含量變化趨勢一致,表明香椿芽采后貯藏過程中花青素和木質(zhì)素含量的差異與合成相關(guān)基因的表達水平具有一定的相關(guān)性。在香椿芽貯藏過程中,TsPAL和TsC4H的表達水平呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,且整體呈下降趨勢,這可能是由于TsPAL和TsC4H既可以調(diào)控花青素的合成,也可以調(diào)控木質(zhì)素的合成,且在貯藏前期主要調(diào)控木質(zhì)素的合成,而在貯藏后期參與調(diào)控花青素的合成。TsPAL和TsC4H基因是否在貯藏前期參與香椿芽木質(zhì)素合成,在貯藏后期參與花青素的合成還需要進一步探究。

綜上所述,在紅、綠香椿芽采后4 ℃低溫貯藏過程中,葉片、葉柄組織的花青素含量降低,木質(zhì)素含量升高,而次生細胞壁增厚,發(fā)生了不同程度的木質(zhì)化。同時,紅香椿芽的花青素含量比綠香椿芽高,而木質(zhì)素含量比綠香椿芽低。綜合香椿芽色澤、外觀、花青素和木質(zhì)素含量變化特征,表明紅香椿芽的貯藏時間較長,且葉柄貯藏保鮮比葉片更困難。另外,葉片、葉柄組織中花青素和木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達量與香椿芽貯藏過程中花青素和木質(zhì)素含量的變化趨勢一致。本研究結(jié)果對于指導紅和綠香椿芽的貯藏保鮮和食用具有實際意義,也為通過調(diào)控花青素和木質(zhì)素基因表達水平來提高香椿芽采后品質(zhì)提供了理論依據(jù)。