鼻咽癌組織VEGF、LMP1表達(dá)變化與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

盧大松，王武峰，趙娜，馮勇軍，牟忠林

1 海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，?？?70311；2 海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院放療科；3 海南醫(yī)學(xué)院研究生院

鼻咽癌惡性程度較高，發(fā)病率及病死率均處于較高水平。鼻咽癌早期階段給予積極有效的臨床干預(yù)可顯著提高患者的5年生存率，然而大部分患者確診時(shí)已至中晚期，臨床預(yù)后差，嚴(yán)重影響患者的生命健康。鼻咽癌的病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，可能與EB病毒感染、環(huán)境、遺傳等因素密切相關(guān)［1］。探討鼻咽癌發(fā)生機(jī)制并尋求與鼻咽癌預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物具有重要意義。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控因子，其表達(dá)異常升高與惡性腫瘤病程、轉(zhuǎn)移及腫瘤分期密切相關(guān)，在腫瘤形成及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［2-3］。EB病毒潛伏膜蛋白1（LMP1）在鼻咽癌轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用，是誘導(dǎo)鼻咽癌形成及轉(zhuǎn)移的主要基因之一，可作為預(yù)測鼻咽癌轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志［4-5］。本研究通過觀察鼻咽癌組織中VEGF、LMP1的表達(dá)變化，探討二者與鼻咽癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年1月—2016年8月我院收治的初診鼻咽癌患者78例，均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。其中男42例、女36例，年齡≤60歲37例、＞60歲41例，腫瘤分級中/高分化15例、低分化63例，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期20例、Ⅲ～Ⅳ期58例，合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例，有吸煙史30例。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床病理資料不完整；復(fù)發(fā)性鼻咽癌；合并嚴(yán)重感染性疾病或惡性腫瘤、自身免疫性疾??；合并心肝腎等重要器官功能障礙。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過（批號2022230），患者或家屬同意參與本研究并簽署知情同意書。

1.2 癌組織和癌旁組織VEGF、LMP1檢測 取癌組織及正常癌旁組織，置于4%甲醛溶液中浸泡固定，石蠟包埋，連續(xù)切片。加入二甲苯及梯度乙醇脫蠟至水，采用免疫組化法檢測VEGF、LMP1表達(dá)。將已知陽性標(biāo)本作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。VEGF定位于細(xì)胞質(zhì)，LMP1定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒判斷為陽性細(xì)胞。染色強(qiáng)度評分：未著色為0分，輕度著色為1分，中度著色為2分，重度著色為3分。陽性細(xì)胞百分率評分：未發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞為0分，≤10%為1分，＞10%～50%為2分，＞50%為3分。將兩項(xiàng)評分相加，＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.3 預(yù)后隨訪 采用電話隨訪的方式，自手術(shù)之日起至隨訪結(jié)束或死亡，隨訪時(shí)間為5年。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析VEGF、LMP1表達(dá)與鼻咽癌患者臨床特征的關(guān)系，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，兩組間比較采用Log-Rank檢驗(yàn)；采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型對鼻咽癌患者進(jìn)行多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌組織與正常癌旁組織VEGF、LMP1表達(dá)比較 鼻咽癌組織VEGF陽性57例（73.08%），LMP1陽性53例（67.95%）；癌旁組織VEGF陽性22例（28.21%），LMP1陽性11例（14.10%）。鼻咽癌組織VEGF、LMP1陽性表達(dá)率均高于癌旁組織（P均＜0.05）。

2.2 不同臨床病理特征鼻咽癌患者鼻咽癌組織VEGF、LMP1表達(dá)比較 TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的VEGF陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期、中/高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P均＜0.05）；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的LMP1陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P＜0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理特征鼻咽癌患者鼻咽癌組織VEGF、LMP1陽性表達(dá)率比較（%）

2.3 VEGF、LMP1陽性與陰性表達(dá)的鼻咽癌患者預(yù)后比較 隨訪5年，患者生存59例，死亡19例。VEGF和LMP1陽性表達(dá)患者的5年生存率分別為59.14%、56.23%，VEGF和LMP1陰性表達(dá)患者分別為86.37%、87.91%，VEGF及LMP1陽性表達(dá)患者的5年生存率較VEGF及LMP1陰性表達(dá)患者降低（P均＜0.05）。

2.4 VEGF及LMP1表達(dá)與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系 Cox單因素分析顯示，腫瘤分化、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、VEGF及LMP1表達(dá)是鼻咽癌患者預(yù)后的影響因素（P均＜0.05）；Cox多因素分析顯示，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、VEGF及LMP1表達(dá)是鼻咽癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（P均＜0.05）。見表2、3。

表2 鼻咽癌患者預(yù)后影響因素的Cox單因素分析結(jié)果

表3 鼻咽癌患者預(yù)后影響因素的Cox多因素分析結(jié)果

3 討論

早期鼻咽癌臨床癥狀缺乏特異性，一旦發(fā)病極易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且經(jīng)治療后仍有較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，因此當(dāng)下針對鼻咽癌的治療效果并不理想，5年生存率較低。目前關(guān)于鼻咽癌的病因及發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，因此深入探究鼻咽癌病因及發(fā)生機(jī)制并尋求可有效判斷鼻咽癌患者預(yù)后的指標(biāo)尤為重要。

腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲與新生血管形成密不可分，而VEGF是一種與新生血管形成相關(guān)的主要調(diào)控因子［6-7］。VEGF作為促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子之一，其可通過作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞而參與細(xì)胞有絲分裂及增殖相關(guān)過程，可導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性升高，最終促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展［8］。雍軍等［9］研究表明，VEGF可導(dǎo)致淋巴管內(nèi)皮通透性及腫瘤細(xì)胞黏附性發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。研究顯示，VEGF在機(jī)體多種正常組織中均呈低表達(dá)，但在實(shí)體瘤中表達(dá)明顯上調(diào)，且隨著腫瘤惡性程度增加而增加［10-11］。既往研究顯示，VEGF與病理分型有關(guān)，腫瘤分化越差，VEGF陽性表達(dá)率越高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［12］。本研究結(jié)果顯示，VEGF在鼻咽癌組織中的陽性表達(dá)率較癌旁組織顯著升高，且TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的VEGF陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期、中/高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。與既往文獻(xiàn)結(jié)果基本一致，提示VEGF在鼻咽癌組織中的表達(dá)上調(diào)可作為評估鼻咽癌浸潤、轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)，在鼻咽癌形成及進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。我們對78例鼻咽癌患者進(jìn)行為期5年隨訪，發(fā)現(xiàn)VEGF陽性表達(dá)患者5年生存率較VEGF陰性表達(dá)患者明顯下降，且Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析發(fā)現(xiàn)VEGF是影響鼻咽癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這可能是由于VEGF表達(dá)異常上調(diào)可誘導(dǎo)微淋巴管生成，而腫瘤細(xì)胞可經(jīng)脈管間隙入侵至脈管系統(tǒng)，最終引發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，對鼻咽癌患者預(yù)后造成不良影響。

EBV病毒在鼻咽癌患者出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)發(fā)揮重要作用，而其最為突出的是持續(xù)不斷的表達(dá)LMP1，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤血管生成及腫瘤增殖轉(zhuǎn)移［13］。LMP1是公認(rèn)的EBV致瘤蛋白，其可通過激活多種信號途徑而參與鼻咽癌形成及進(jìn)展過程［14］。張逸錚等［10］研究顯示，LMP1可使促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。李曉雪等［15］報(bào)道，LMP1可誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)鼻咽癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。周業(yè)等［16］報(bào)道，LMP1可增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞增殖能力，其作用機(jī)制可能是通過激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)經(jīng)典信號途徑Wnt通路實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示，LMP1在鼻咽癌組織中的陽性表達(dá)率較癌旁組織顯著升高，且其表達(dá)與鼻咽癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。這可能是由于鼻咽癌作為一種EB病毒相關(guān)腫瘤，在其形成過程中EBV病毒活化，進(jìn)而引發(fā)LMP1表達(dá)，而LMP1可通過激活細(xì)胞內(nèi)多種途徑而誘導(dǎo)VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶等腫瘤基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而引發(fā)腫瘤出現(xiàn)侵襲及轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。生存分析及Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示，VEGF及LMP1陽性表達(dá)患者5年生存率均較VEGF及LMP1陰性表達(dá)患者顯著降低，且其可獨(dú)立影響鼻咽癌患者預(yù)后，VEGF及LMP1表達(dá)越高，鼻咽癌患者預(yù)后越差，二者可作為判斷鼻咽癌預(yù)后的潛在標(biāo)志物。

綜上所述，VEGF、LMP1在鼻咽癌組織中的表達(dá)明顯升高，兩者可能在鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用；VEGF、LMP1表達(dá)水平越高，患者的臨床預(yù)后越差，二者可能作為判斷鼻咽癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。關(guān)于VEGF、LMP1在鼻咽癌形成及進(jìn)展過程中的具體作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究探索。