實(shí)時(shí)熒光PCR 法檢測(cè)芝麻醬中的芝麻成分

李 娟，陳茵茵，梅 巖，陳雪華，王 達(dá)，黃嘉文

（1.廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東廣州 510000；2.廣東省食品檢驗(yàn)所，廣東廣州 510000）

芝麻又稱(chēng)胡麻，既是油料作物，又可直接食用。芝麻醬是由芝麻炒熟、磨碎制成，其香味濃郁，色澤金黃，口感細(xì)滑，是廣大消費(fèi)者喜愛(ài)的一種調(diào)味品[1]。芝麻醬的營(yíng)養(yǎng)豐富，含有不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、維生素E、礦物質(zhì)、鐵等對(duì)人體有益的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]。芝麻醬的制作工藝簡(jiǎn)單，不需要特殊的大型設(shè)備，但因市場(chǎng)準(zhǔn)入門(mén)檻低等使得生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量相差很大，各種摻假方式層出不窮，如摻入其他油料作物、用淀粉香精調(diào)制等[3]。因此，芝麻醬作為消費(fèi)者生活中必不可少的調(diào)味品，其摻假檢測(cè)非常必要。

目前，芝麻醬的摻偽鑒定還未有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)出臺(tái)，最常用的芝麻醬摻偽鑒別方式是感官鑒別，對(duì)其色、香、味、形進(jìn)行判定，但一般消費(fèi)者并不具備相關(guān)的知識(shí)導(dǎo)致難以分辨是否摻偽。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)于芝麻醬的研究也較少，其鑒定指標(biāo)/技術(shù)有采用色譜法測(cè)定脂肪酸、采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定特征風(fēng)味物質(zhì)[4]、分子生物學(xué)技術(shù)PCR 法等[5]。分子生物學(xué)技術(shù)現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于多種動(dòng)植物產(chǎn)品摻假鑒定中，本項(xiàng)目應(yīng)用的實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)可直接判讀芝麻醬產(chǎn)品是否含有芝麻源性成分或其他標(biāo)簽未標(biāo)識(shí)的其他源性成分，靈敏度高、操作簡(jiǎn)便。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熒 光PCR 試 劑：Takara Premix Ex Taq（Probe qPCR）RR390A，分析純；異丙醇，分析純；DNA提取試劑：QIAGEN DNeasy mericon Food Kit（Code No.69514），分析純，德國(guó)QIAGEN 公司；引物，生工生物上海有限公司。

Bio-rad CFX96 熒光定量PCR 儀，美國(guó)Bio-rad公司；Biospec-nano 核酸蛋白測(cè)定儀，日本島津公司；1300 系列A2 級(jí)別生物安全柜，美國(guó)Thermofisher 公司；Sorvall ST 8 離心機(jī)，美國(guó)Thermofisher 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將芝麻醬樣品進(jìn)行均質(zhì)，按照優(yōu)化后的植物DNA 提取流程或成品的試劑盒DNA 提取流程進(jìn)行DNA 的提取，之后以提取的DNA 為模板，采用2S albumim mRNA 基因的特異性引物、探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)，觀察是否出現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光PCR 的增幅現(xiàn)象，判斷待檢樣品中是否含有芝麻源性成分，實(shí)現(xiàn)芝麻源性成分的鑒定。

1.2.1 樣品前處理

將芝麻醬樣品中析出的上層油質(zhì)去除，盡量去除干凈，否則影響芝麻醬DNA 的提取，用潔凈的玻璃棒攪拌均勻，取芝麻醬樣品約500 mg 置于離心管中，4 ℃冷凍離心，去上清留沉淀，置于-20 ℃冰箱中保存，以備下一步進(jìn)行核酸提取。

1.2.2 DNA 提取

試劑盒優(yōu)化法：①取經(jīng)過(guò)前處理后的樣品約1 000 mg，加入等體積的異丙醇溶液，輕輕渦旋振蕩；②振蕩后將其置于4 ℃冰箱中靜置30 min，后取出于4 ℃冷凍離心；③按照商業(yè)化DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)中的要求進(jìn)行DNA 提取。提取過(guò)程中設(shè)置提取對(duì)照，以滅菌去離子水代替樣品進(jìn)行DNA 提取。

1.2.3 DNA 濃度測(cè)定

采用Biospec-nano 核酸蛋白分析儀對(duì)提取的DNA 進(jìn)行濃度測(cè)定。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增及其質(zhì)控設(shè)置

芝 麻 源 性 成 分 檢 測(cè)2S albumim mRNA基因的特異性引物探針序列， 上游引物：CCAGAGGGCTAGGGACCTTC； 下 游 引 物：CTCGGAATTGGCATTGCTG； 探 針 序 列：FAMTCGCAGGTGCAACATGCGACC- TAMRA。

芝麻源性成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系采用25 μL 反應(yīng)體系，PCR 緩沖液加入2.5 μL，其工作濃度為10 倍Buあer；上下游引物、探針各加1 μL，其工作濃度均為10 μmol·L-1；dNTPs 加入2 μL，其工作濃度均為10 μmol·L-1，Taq DNA 聚合酶加入0.2 μL，其工作濃度為2.5 U·μL-1；DNA模板加入量為10～100 ng，最后用滅菌去離子水補(bǔ)足25 μL 反應(yīng)體系。

芝麻源性成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)程序：50 ℃/2 min，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃/15 min，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃/15 s，60 ℃/1 min，40 個(gè)循環(huán)；在每次循環(huán)退火時(shí)收集熒光信號(hào)。反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)基因擴(kuò)增儀型號(hào)以及所使用試劑的不同進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

以芝麻中提取的DNA 為陽(yáng)性對(duì)照，以花生提取的DNA 為陰性對(duì)照，以滅菌水為空白對(duì)照，以水為樣品進(jìn)行提取作為提取過(guò)程的對(duì)照。

1.2.5 熒光PCR 擴(kuò)增結(jié)果判斷與表述

閾值的設(shè)定根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線（無(wú)規(guī)則的噪音線）的最高點(diǎn)，且Ct 值不出現(xiàn)任何數(shù)值為準(zhǔn)。

（1）各對(duì)照結(jié)果應(yīng)符合以下要求。①陰性對(duì)照：無(wú)熒光增幅現(xiàn)象。②提取對(duì)照及空白對(duì)照：無(wú)熒光增幅現(xiàn)象。③陽(yáng)性對(duì)照：有明顯的熒光增幅現(xiàn)象。④內(nèi)參照：有明顯的熒光增幅現(xiàn)象。⑤以上指標(biāo)有一項(xiàng)不符合均視為此次實(shí)驗(yàn)無(wú)效。

（2）結(jié)果判定。①同時(shí)進(jìn)行的內(nèi)參照、陰性、陽(yáng)性、空白和提取對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果正常，檢測(cè)樣品無(wú)熒光增幅現(xiàn)象，Ct 值＞40.0，判斷被檢樣品陰性，未檢出芝麻源性成分。②同時(shí)進(jìn)行的內(nèi)參照、陰性、陽(yáng)性、空白、提取對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果正常，檢測(cè)樣品有明顯的熒光增幅曲線，且Ct 值＜35.0，判斷被檢樣品陽(yáng)性，檢出芝麻源性成分。③同時(shí)進(jìn)行的內(nèi)參照、陰性、陽(yáng)性、空白、提取對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果正常，且檢測(cè)樣品熒光增幅曲線的Ct值在35.0～40.0，則應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。再次擴(kuò)增出的結(jié)果Ct 值仍在35.0 ～40.0，可判斷被檢樣品可疑，否則可判斷被檢樣品陰性。

1.2.6 方法特異性研究

在芝麻醬產(chǎn)品中可能會(huì)摻雜花生成分[1]，為驗(yàn)證該方法的特異性，以花生樣品提取的DNA 為模板，以本研究中芝麻的上下游引物、探針進(jìn)行擴(kuò)增，查看擴(kuò)增結(jié)果是否出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

1.2.7 方法檢出限研究

樣品中若芝麻成分含量少，提取到的DNA 濃度過(guò)低，可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)不出芝麻源性成分，因此需要對(duì)本研究中的上下游引物、探針進(jìn)行檢出限的驗(yàn)證。對(duì)芝麻樣品提取的DNA 進(jìn)行稀釋?zhuān)瑵舛确謩e為提取后濃度的10%、1%、0.1%、0.01%，以不同比例稀釋后的DNA 為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法特異性驗(yàn)證結(jié)果

從圖1 中看出，以花生樣品提取的DNA 為陰性對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增后，無(wú)熒光增幅現(xiàn)象，說(shuō)明本研究中應(yīng)用的上下游引物、探針具有特異性，可特異性擴(kuò)增芝麻源性成分。

圖1 芝麻源性成分2S albumim mRNA 基因檢測(cè)

2.2 方法檢出限驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)芝麻樣品提取的DNA 進(jìn)行稀釋后，濃度分別為原濃度的10%、1%、0.1%、0.01%，以此為模板擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖中可看出，在DNA 濃度為0.01%時(shí)仍有熒光增幅現(xiàn)象，且Ct 值＜35，說(shuō)明該方法的最低檢出限（LOD）為0.01%。

圖2 芝麻源性成分檢測(cè)檢出限

2.3 市售樣品檢測(cè)結(jié)果

超市購(gòu)買(mǎi)芝麻醬待檢品3 份，產(chǎn)品均有明確的標(biāo)簽標(biāo)識(shí)，其中2 份標(biāo)識(shí)含有芝麻源性成分和花生源性成分，一份標(biāo)識(shí)僅含有花生源性成分。用本方法進(jìn)行芝麻源性成分的鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖1 及表1，結(jié)果顯示同時(shí)進(jìn)行的陰性、陽(yáng)性、空白、提取對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果正常，兩份樣品能檢測(cè)出芝麻源性成分，標(biāo)簽僅含花生源性成分的樣品未檢出芝麻源性成分。

表1 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了利用實(shí)時(shí)熒光PCR 法對(duì)芝麻源性成分進(jìn)行檢測(cè)的方法，并利用該方法對(duì)市售樣品進(jìn)行了檢測(cè)。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，該方法的特異性及檢出限均能滿足檢測(cè)要求，市售樣品檢測(cè)結(jié)果均符合產(chǎn)品標(biāo)簽，說(shuō)明該方法檢測(cè)結(jié)果可靠。