地衣芽孢桿菌對雪茄煙葉發(fā)酵產(chǎn)香及菌群演替的影響

宋 雯，陳 曦，余 君，胡路路，陳 雄，王 志

（1.發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，湖北工業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430068；2.湖北省煙草科學(xué)研究院，湖北 武漢 430030）

2021 年國產(chǎn)手工雪茄銷量超過2 000 萬支[1]，但國產(chǎn)雪茄煙葉香氣不夠濃郁、化學(xué)成分不協(xié)調(diào)[2]，因此需要通過微生物、酶及一些化學(xué)作用共同完成雪茄煙葉的發(fā)酵以提升煙葉品質(zhì)。利用生物發(fā)酵技術(shù)改善雪茄煙葉品質(zhì)成為了一大研究熱點(diǎn)[3]。微生物的生長代謝使得煙葉中的木質(zhì)素、蛋白質(zhì)等生物大分子降解或轉(zhuǎn)化，形成一系列的揮發(fā)性香氣物質(zhì)，同時降低煙葉中的青雜氣，進(jìn)而提升發(fā)酵后煙葉品質(zhì)[4-5]。遲建國[6]為了降低煙葉中木質(zhì)素含量，從廢棄煙草中篩選出一株白腐菌并用于煙葉發(fā)酵，使得發(fā)酵后煙葉木質(zhì)素含量降低30%，并顯著提升了煙葉品質(zhì)；蔡文等[7]為了降低煙葉蛋白質(zhì)含量，采用源自煙葉的高斯芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，降低了煙葉總氮含量，且提高了煙葉中-紫羅蘭酮、E-大馬士酮等類胡蘿卜素降解產(chǎn)物的含量。張倩穎等[8]使用冬蟲夏草菌株發(fā)酵煙葉，提高了發(fā)酵后煙葉中茄酮等西柏烷類降解產(chǎn)物的香氣含量，且感官質(zhì)量評價明顯提升。地衣芽孢桿菌作為一種遺傳背景清楚的益生菌[9]，被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵等[10-11]，許多發(fā)酵食品特征性風(fēng)味化合物與地衣芽孢桿菌代謝特征關(guān)系密切[12-13]。目前地衣芽孢桿菌在煙草領(lǐng)域主要作為根際促生菌用于育苗過程[14-15]。

雪茄發(fā)酵過程中菌群演替規(guī)律對科學(xué)可控地設(shè)計雪茄發(fā)酵工藝具有重要意義[16]。由于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)的局限性，即使選擇多種培養(yǎng)基和分離條件，也僅能從樣品中分離出少量優(yōu)勢菌群[17]。而宏基因組測序技術(shù)可克服此缺陷，檢測出樣品中全部微小生物的基因組DNA[18]，全面地反映其微生物群落的真實(shí)組成，系統(tǒng)地分析發(fā)酵過程中核心微生物菌群和代謝通路的變化，并注釋風(fēng)味物質(zhì)形成的相關(guān)基因。劉愛平等[19]通過宏基因組技術(shù)研究了四川麩醋的微生物組和風(fēng)味形成相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)醋醅具備通過氨基酸代謝形成風(fēng)味物質(zhì)的基礎(chǔ)。陳曉東等[20]通過宏基因組測序技術(shù)分析了不同產(chǎn)地的酸筍中菌群結(jié)構(gòu)和代謝通路的差異，發(fā)現(xiàn)酸筍中的微生物差異與產(chǎn)地密不可分。

筆者在雪茄煙葉箱式發(fā)酵過程中施加地衣芽孢桿菌，結(jié)合宏基因組學(xué)技術(shù)研究了其對雪茄煙葉發(fā)酵后香氣成分的影響，揭示發(fā)酵后雪茄煙葉發(fā)酵菌系的演替特征以及其與香氣物質(zhì)代謝的關(guān)系，為構(gòu)建雪茄煙葉發(fā)酵香氣物質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)、提升其代謝效率提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）：從茄芯CX-14 表面分離得到，制備甘油管保藏于發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗室。

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L， 氯化鈉 10 g/L，pH 值 7.2～7.4，121℃滅菌20 min。

洗滌緩沖液：Tris-HCl 15.76 g/L，EDTA-Na218.612 g/L，NaCl 81.9 g/L，polyvinylpyrrolidone (PVP)20 g/L，Tween-20 1 g/L，pH 值8.0。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的活化取200 μL 甘油管保藏的地衣芽孢桿菌菌液接種到LB 液體培養(yǎng)基中，200 r/min 培養(yǎng)24 h 得到一級種子液；按接種量5%將一級種子液接種至LB 液體培養(yǎng)基中，200 r/min 培養(yǎng)24 h 得到二級種子液。

1.2.2 雪茄煙葉恒溫恒濕箱發(fā)酵整箱煙葉重量25 kg。測定雪茄煙葉初始含水率，按照稱重回潮法計算所需回潮水的量，使煙葉回潮至含水率34%，待水分平衡后裝入紙箱，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，37℃、80%濕度進(jìn)行發(fā)酵（對照組）。按照接種量2×108CFU/g計算所需菌體的量，將地衣芽孢桿菌二級種子液以10 000 r/min 的速度離心5 min 后棄上清收集菌體，加入計算好的回潮水進(jìn)行重懸，得到的菌懸液均勻噴灑在煙葉表面（地衣芽孢桿菌組）。發(fā)酵周期為30 d。

1.2.3 雪茄煙葉揮發(fā)性香氣成分測定及感官評價樣品預(yù)處理：樣品去主脈后烘干，用粉碎機(jī)粉碎后過40 目篩后，使用同時蒸餾萃取裝置提取致香物質(zhì)[21]，使用GC-MS 進(jìn)行分析。GC-MS 色譜條件如下。色譜柱：HP-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40℃保持2 min，以2 ℃/min 升至200 ℃，保持5 min，然后10℃/min 升至280 ℃；載氣（He）流速1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；分流比10 ∶1。電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230℃；質(zhì)量掃描范圍35～550 m/z。目標(biāo)化合物的峰識別基于國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究所數(shù)據(jù)庫（NIST14）進(jìn)行對比。

感官評價參照覃明娟等[22]報道的方法，由湖北省煙草科學(xué)院完成。

1.2.4 雪茄煙葉宏基因組樣品采集、宏基因提取及測序取10 g 葉片樣品，剪切成段，加入100 mL 洗滌緩沖液超聲15 min 后過濾，將收集到的濾液10 000 r/min離心10 min，棄上清收集微生物細(xì)胞，重復(fù)洗滌直至上清液幾乎無色。放入液氮罐中冷凍30 s 后迅速轉(zhuǎn)入－80℃保存。宏基因提取依據(jù)NEXTFLEX? Rapid DNASeq Kit 試劑盒的操作說明書完成。PE 文庫構(gòu)建及基因組測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2.5 序列質(zhì)控與組裝在測序?qū)嶒炛胁捎枚鄠€樣品平行混合測序，各樣品中的序列均引入了一段標(biāo)示其樣本來源信息的Index 標(biāo)簽序列。根據(jù)Index 序列區(qū)分各個樣品的數(shù)據(jù)，提取出的數(shù)據(jù)以fastq 格式保存?；谠紲y序數(shù)據(jù)，使用相應(yīng)軟件對其進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控，剪切掉數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量及含N 的reads，獲得后續(xù)分析需要的質(zhì)量更好的序列。

1.2.6 基因預(yù)測與非冗余基因集構(gòu)建此次使用MetaGene 對拼接結(jié)果中的contig 進(jìn)行ORF 預(yù)測，并將核酸長度大于等于100 bp 的基因翻譯為氨基酸序列。用CD-HIT 軟件將所有樣品預(yù)測出來的基因序列進(jìn)行聚類，每個類取最長的基因作為代表序列，進(jìn)行非冗余基因集的構(gòu)建。使用SOA Paligner 軟件分別將每個樣品的高質(zhì)量reads 與非冗余基因集進(jìn)行比對，統(tǒng)計基因在對應(yīng)樣品中的豐度信息。

1.2.7 α 多樣性、物種與功能注釋及物種貢獻(xiàn)度分析數(shù)據(jù)使用美吉云平臺的在線工具進(jìn)行分析。使用DIAMOND 軟件將非冗余基因集與NR 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，并通過NR 庫對應(yīng)的分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫獲得物種注釋，然后使用物種對應(yīng)的基因豐度總和計算該物種的豐度，并在各個分類學(xué)水平上統(tǒng)計物種在各個樣品中的豐度，從而構(gòu)建相應(yīng)分類學(xué)水平上的豐度譜。分別 利 用Chao 指數(shù)、Simpson 指數(shù)和 Shannon 指數(shù)公式計算細(xì)菌生態(tài)多樣性指數(shù)。使用DIAMOND 將非冗余基因集序列與 KEGG 的基因數(shù)據(jù)庫（GENES）進(jìn)行比對（E-value ≤10-5），根據(jù) KO、Pathway、EC、Module 對應(yīng)的基因豐度總和計算該功能類別的豐度。然后基于樣本的物種和功能的對應(yīng)關(guān)系，進(jìn)行物種與功能相對豐度之間的關(guān)聯(lián)分析，找出特定物種的功能貢獻(xiàn)度以及特定功能的物種貢獻(xiàn)度。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理測定數(shù)據(jù)為3 組平行試驗均值，采用SPSS 26 和Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并用Origin 2019b 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 地衣芽胞桿菌對雪茄煙葉發(fā)酵過程揮發(fā)性香味成分的影響

雪茄煙葉香氣物質(zhì)總量在某種程度上決定了雪茄的呈香[23]。苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可以賦予煙葉花香特征，增加余味的醇凈感[24]；類胡蘿卜素降解產(chǎn)物可以降低煙葉刺激性[5]。西柏烷類降解產(chǎn)物具有清新的香氣，可以增加煙氣的醇和感[21]。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可以對于賦予煙草堅果等香氣，使其香韻更加多樣化[25]。這些香氣成分的含量與雪茄品質(zhì)密切正相關(guān)[5]。地衣芽孢桿菌對雪茄煙葉發(fā)酵前后揮發(fā)性香氣含量和感官質(zhì)量評價的變化如圖1 所示。

圖1 雪茄煙葉揮發(fā)性香氣含量（a）和感官質(zhì)量（b）評價的變化

發(fā)酵前煙葉中揮發(fā)性香氣總量為398.2 μg/g，發(fā)酵后，自然發(fā)酵組（對照組）和地衣芽孢桿菌組分別達(dá)到878.5 和958.2 μg/g，分別比發(fā)酵前提高了1.2倍、1.4 倍。另外，地衣芽孢桿菌組也比對照組提高了9%。圖1a 表明：發(fā)酵前煙葉中苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、西柏烷類降解產(chǎn)物和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物分別為8.3、45.3、21.2 和9.1 μg/g。發(fā)酵后自然發(fā)酵組分別為15.2、64.6、27.4 和12.5 μg/g，地衣芽孢桿菌組分別為20.7、 93.0、 30.5 和14.7 μg/g，與發(fā)酵前相比均有提高。與自然發(fā)酵組相比，地衣芽孢桿菌組4 類揮發(fā)性香氣成分依次提高了36%、44%、11%和18%。

雪茄發(fā)酵前后的感官質(zhì)量評價。如圖1b 所示：發(fā)酵前雪茄煙刺激性較強(qiáng)，雜氣突出，香韻較弱且香氣不夠醇厚，煙葉整體的平衡感較差。發(fā)酵后，較自然發(fā)酵組而言，地衣芽孢桿菌組對煙葉雜氣與刺激性降幅更大，香氣醇厚感提升，余味更加醇凈舒適，煙葉整體平衡感更加出色。

綜合以上研究內(nèi)容可知，相較于自然發(fā)酵組，地衣芽孢桿菌組香氣含量提升明顯，內(nèi)部化學(xué)成分協(xié)調(diào)，感官評價較好。

2.2 宏基因組測序與質(zhì)控結(jié)果

Illumina 測序得到宏基因原始序列，如表1 所示，經(jīng)質(zhì)控、去宿主處理，兩組樣品每個平行分別得到reads 數(shù)約為 5 100 萬、4 300 萬、4 500 萬、4 700 萬、5 300 萬、5 300 萬條。對優(yōu)化后序列拼接組裝獲得的 contigs 進(jìn)行 ORF 預(yù)測，后基于ORF 預(yù)測基因進(jìn)行聚類、構(gòu)建。

表1 宏基因組測序的質(zhì)控及組裝信息

N50（N90）：將各contigs 序列按長度大小排序，掃描各條序列的長度值并進(jìn)行累加。當(dāng)累加值第一次超過所有序列總長度的50%（90%）時，此時掃描到的序列，其長度值即為N50（N90）；相比序列平均長度，N50（N90）更能準(zhǔn)確表示此次序列拼接的效果[26]；組裝結(jié)果顯示，各組 N50 均大于 500 bp，表明組裝良好，可用于進(jìn)行后續(xù)分析。

2.3 茄煙葉發(fā)酵宏基因組 NR 物種注釋

NR 是非冗余蛋白質(zhì)氨基酸序列庫，將構(gòu)建的非冗余基因集與NR 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對可以獲得物種分類學(xué)信息。由圖2 的NR 注釋結(jié)果來看，在域水平上，細(xì)菌的相對豐度高達(dá) 93.0%～97.9%，表明在高溫快速發(fā)酵過程中細(xì)菌是煙葉發(fā)酵香氣生成及其他的主要承擔(dān)者。

圖2 不同處理發(fā)酵后菌群域水平物種分布

α 多樣性指數(shù)可表示群落物種組成的多樣性，因此對2 組的細(xì)菌進(jìn)行了α 多樣性分析。Chao 是用chao1 算法估計樣本中物種總數(shù)。Simpson 也用來估算樣本中微生物多樣性，Simpson 指數(shù)值越大，群落多樣性越低。與Simpson 指數(shù)相反，Shannon 值越大，說明群落多樣性越高。自然發(fā)酵組和地衣芽孢桿菌組的細(xì)菌α 多樣性指數(shù)顯著性差異如圖3 所示：從chao 指數(shù)來看，較自然發(fā)酵組而言，地衣芽孢桿菌組的chao 指數(shù)更大，表示地衣芽孢桿菌的物種總數(shù)更多，且2 組的差異極顯著。從simpson 和shannon 指數(shù)來看，地衣芽孢桿菌組的simpson 明顯小于自然發(fā)酵組，而shannon 指數(shù)明顯大于自然發(fā)酵組，表示地衣芽孢桿菌組的群落多樣性更高。

圖3 不同處理發(fā)酵后菌群α 多樣性差異指數(shù)校驗圖

在屬水平上（圖4），葡萄球菌屬（Staphylococcus）是發(fā)酵后煙葉表面唯一優(yōu)勢屬，相對豐度占比高達(dá)91.7%。楊勇等[27]發(fā)現(xiàn)葡萄球菌屬對臘肉中的培根風(fēng)味形成有著重要影響。其次為煙草菌屬（Nicotiana），在自然發(fā)酵組和地衣芽孢桿菌組的相對豐度分別為1.2%和4.3%。

圖4 不同處理發(fā)酵后菌群屬水平物種分布

在種水平上（圖5），尼泊爾葡萄球菌（Staphylococcus nepalensis）占比高達(dá)55.7%～67.2%，豐度大于0.5%的種幾乎被葡萄球菌屬和煙草菌屬包攬，與屬水平結(jié)果一致。但豐度大于0.5%的種中并未發(fā)現(xiàn)地衣芽胞桿菌，可能是地衣芽孢桿菌不可耐受雪茄發(fā)酵的最高溫度，也可能是煙葉中存在未知的因素，不適宜地衣芽孢桿菌生長。

圖5 不同處理發(fā)酵后菌群種水平物種分布

由圖6 可以看出，自然發(fā)酵組注釋顯示菌系中的微生物有1 295 個屬，地衣芽孢桿菌組注釋顯示菌系中的微生物有1 615 個屬。自然發(fā)酵組有255 個特有菌屬，而地衣芽孢桿菌組有575 個獨(dú)有屬，增加了320 個屬，且增加的菌屬均為地衣芽孢桿菌組的特有屬。這說明：相較于自然發(fā)酵組，地衣芽孢桿菌的添加提升了煙葉表面物種的豐富度。

圖6 不同處理發(fā)酵后菌群屬水平物種Venn 圖

2.4 組間物種及差異分析

對自然發(fā)酵組與地衣芽孢桿菌組發(fā)酵后煙葉表面菌群進(jìn)行差異分析，如圖7a 所示：兩組相對豐度前15 的菌屬均存在顯著差異。與自然發(fā)酵組相比，發(fā)酵后地衣芽孢桿菌組煙葉表面葡萄球菌屬（Staphylococcus）豐度占比有所下降，但依然遠(yuǎn)高于其他菌屬；而煙草菌屬（Nicotiana）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鏈球菌屬（Streptococcus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）豐度占比均有不同程度的提升。再次說明在雪茄發(fā)酵過程中地衣芽孢桿菌的施加可以改變雪茄表面微生物群落結(jié)構(gòu)，增加菌群豐富度。

圖7 不同處理組間物種（a）及功能（b）差異檢驗

自然發(fā)酵組與地衣芽孢桿菌組的雪茄表面物種功能進(jìn)行差異分析，根據(jù)2 組間物種功能豐度的差異，可以獲得2 組間的顯著性差異功能（圖7）。對2 組發(fā)酵相對豐度前15 的功能通路記進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)：地衣芽孢桿菌的施加使得雪茄煙葉發(fā)酵中氨基酸的生物合成、碳代謝等代謝通路的相對豐度均有不同程度的提升，暗示菌群可能增強(qiáng)了其代謝強(qiáng)度以維持自身生存，其中氨基酸的生物合成可能更有利于煙葉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的合成[25]。氨糖與核糖的代謝通路增強(qiáng)有利于細(xì)胞生長。

2.5 雪茄煙葉表面微生物的功能貢獻(xiàn)度分析

通過計算微生物各屬水平在各代謝通路的相對豐度，可以展示雪茄煙葉發(fā)酵菌群與 KEGG 代謝通路之間的功能貢獻(xiàn)度。如圖8 所示，葡萄球菌屬對2 組豐度排前10 的功能貢獻(xiàn)度均超過了80%。結(jié)合屬水平的 NR 注釋結(jié)果，推測菌屬的相對豐度是其對代謝通路功能貢獻(xiàn)度重要因素。另外，假單胞菌屬對雙組分系統(tǒng)的功能貢獻(xiàn)度更高，說明假單胞菌屬有較強(qiáng)的應(yīng)對多種環(huán)境刺激的能力；煙草菌屬對核糖體的功能貢獻(xiàn)度更高，核糖體蛋白是核糖體生物發(fā)生和蛋白質(zhì)合成中不可或缺的物質(zhì)。這說明雪茄發(fā)酵過程中施加地衣芽孢桿菌可以使雪茄煙葉物種豐富度增加，對于促進(jìn)代謝功能有著積極的作用。

圖8 不同處理發(fā)酵后物種與功能貢獻(xiàn)度

3 結(jié) 論

采用地衣芽孢桿菌進(jìn)行雪茄恒溫恒濕箱發(fā)酵，結(jié)合宏基因組學(xué)測序技術(shù)與雪茄煙葉發(fā)酵前后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化明確了各菌屬在營養(yǎng)風(fēng)味物質(zhì)演變中的功能貢獻(xiàn)度。盡管在屬水平上，葡萄球菌屬是發(fā)酵后煙葉表面唯一優(yōu)勢屬，但地衣芽孢桿菌的添加改變了雪茄表面微生物群落結(jié)構(gòu)，提升了煙葉表面物種的豐富度，增強(qiáng)了氨基酸的生物合成、碳代謝等代謝通路的活性。另外， 相對自然發(fā)酵而言，地衣芽孢桿菌的添加使煙葉中的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、西柏烷類降解產(chǎn)物和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的含量分別提高了36%、44%、11%和18%，揮發(fā)性香氣總量提高9%。降低了煙葉雜氣與刺激性，提升了香氣醇厚感，使得余味更加醇凈舒適，煙葉整體平衡感更加出色。