桃紅四物湯合五苓散抗靜脈血栓的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

宋潔菲 周迎光

南京中醫(yī)藥大學(xué)連云港附屬醫(yī)院骨傷科，連云港 222004

靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism，VTE）是指血液在靜脈系統(tǒng)內(nèi)不正常凝集的疾病，包括肺動(dòng)脈栓塞（pulmonary embolism，PE）和深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）［1］。VTE主要臨床表現(xiàn)為患肢腫脹、疼痛，出現(xiàn)不明原因的呼吸困難、胸痛，甚至死亡。中醫(yī)將本病歸于“股腫”，主要病機(jī)為氣滯血瘀，水濕泛濫?！督饏T要略·水氣病脈證并治》中有：“血不利則為水，名曰血分”?？梢?jiàn)血水相互轉(zhuǎn)化，相互影響，臨床上采用“活血利水”能起到較好防治效果［2］。

桃紅四物湯出自清代吳謙《醫(yī)宗金鑒·婦科心法要訣》，五苓散出自漢代張仲景《傷寒論·辨太陽(yáng)病脈證并治》，分別為活血化瘀、利水滲濕的代表方，兩方合用共奏活血化瘀、行氣利水之效。目前，已有文獻(xiàn)表明桃紅四物湯和五苓散均具有抗血小板、抗炎作用，復(fù)方具有預(yù)防VTE的功效［3-5］，但桃紅四物湯合五苓散發(fā)揮抗靜脈血栓作用的具體機(jī)制仍未被完全闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是結(jié)合生物學(xué)、藥理學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)等所形成的一門新興學(xué)科［6］，能夠較全面系統(tǒng)地揭示中藥及其復(fù)方的作用機(jī)理。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討治桃紅四物湯合五苓散抗靜脈血栓生成的潛在作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1.桃紅四物湯合五苓散相關(guān)靶點(diǎn)篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索關(guān)鍵詞“熟地”“白芍”“當(dāng)歸”“川芎”“桃仁”“紅花”“豬苓”“茯苓”“澤瀉”“白術(shù)”“桂枝”，根據(jù)口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18［7］，篩選主要有效成分和靶點(diǎn)。將獲得的靶點(diǎn)去重，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org/）統(tǒng)一命名。

2.VTE相關(guān)靶點(diǎn)篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）、Gene數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）、藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)（TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）中檢索關(guān)鍵詞“venous thromboembolism”。結(jié)果去重獲得VTE相關(guān)靶點(diǎn)，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)一命名。

3.構(gòu)建藥物-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

利用Venny2.1.0獲取藥物和疾病的共同靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。利用Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建藥物-成分-疾病靶點(diǎn)交互網(wǎng)絡(luò)圖。

4.構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

將篩選得到藥物和疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.5（https：//string-db.org/）在線數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置物種來(lái)源為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值為“highest confidence”（＞0.9），其余為默認(rèn)值。導(dǎo)出結(jié)果并使用Cytoscape3.9.1繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

5.基因本體（GO）富集分析與京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）富集分析

使用Metascape平臺(tái)（https：//metascape.org）進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，使用微生信平臺(tái)（http：//www.bioinformatics.com.cn/）可視化。

6.成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

選取藥物-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中Degree值前5的靶點(diǎn)與有效成分進(jìn)行分子對(duì)接。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB，https：//www.rcsb.org/）中下載靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)“.pdb”格式文件，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中下載3D結(jié)構(gòu)的“.mol2”格式文件。將靶點(diǎn)和有效成分3D結(jié)構(gòu)AutoDock Tools1.5.7，經(jīng)過(guò)去水、加氫、分配電荷等處理，保存為“.pdbqt”格式文件。使用AutoDock Vina 1.1.2軟件設(shè)置對(duì)接口袋，使用qvina-w軟件進(jìn)行盲對(duì)接。用結(jié)合能評(píng)價(jià)化合物與靶點(diǎn)的對(duì)接情況。

結(jié)果

1.桃紅四物湯合五苓散有效成分和靶點(diǎn)

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得桃紅四物湯合五苓散有效成分，共計(jì)103個(gè)。其中熟地2個(gè)，白芍13個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，川芎7個(gè)，桃仁23個(gè)，紅花22個(gè)，豬苓11個(gè)，茯苓15個(gè)，澤瀉10個(gè)，白術(shù)7個(gè)，桂枝7個(gè)。中藥共有成分9種（表1）。檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，去重校正后獲得人源靶點(diǎn)213個(gè)。

表1 桃紅四物湯合五苓散中9種中藥共有成分

2.VTE相關(guān)靶點(diǎn)

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索“venous thromboembolism”，取relevance score≥1，獲得1 984個(gè)潛在靶點(diǎn)。在Gene數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索“venous thromboembolism”，與GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果去重，構(gòu)成VTE相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得靶點(diǎn)共1 991個(gè)。

3.藥物-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

利用Venny2.1.0平臺(tái)，將有效成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖（圖1），獲得68個(gè)共同靶點(diǎn)。將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.9.1，構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)（圖2）。使用NetworkAnalyzer工具分析網(wǎng)絡(luò)特征，得到按照Degree排名前20的有效成分及靶點(diǎn)（表2）。

圖1 有效成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 藥物-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表2 按照Degree排名前20的關(guān)鍵靶點(diǎn)和成分

4.PPI網(wǎng)絡(luò)圖

將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.5，構(gòu)建疾病與藥物關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并通過(guò)Cytoscape3.9.1進(jìn)行可視化，其中顏色越深、圖形越大表示相關(guān)性越高（圖3）。去除游離節(jié)點(diǎn)后，該網(wǎng)絡(luò)涉及67個(gè)節(jié)點(diǎn)，743條邊。使用NetworkAnalyzer工具分析，得到按照Degree排名前20的靶點(diǎn)（圖4），主要為腫瘤壞死因子（TNF）、蛋白激酶B（AKT）1、白細(xì)胞介素（IL）1B、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）A、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）等。

圖3 桃紅四物湯合五苓散-VTE靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 桃紅四物湯合五苓散治療VTE的關(guān)鍵靶點(diǎn)（前20）

5.GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

GO富集分析生物學(xué)過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）3個(gè)類別，得到按照P值篩選每個(gè)類別排名前10的項(xiàng)目（圖5A）。桃紅四物湯合五苓散干預(yù)血栓形成主要涉及BP包括細(xì)胞遷移的正調(diào)控、炎性反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、血液循環(huán)、對(duì)氧含量下降的反應(yīng)；CC包括膜筏、細(xì)胞外間質(zhì)、血小板α顆粒腔；參與分子功能包括信號(hào)受體調(diào)節(jié)器活性、氧還原酶活性、絲氨酸水解酶活性等。KEGG富集分析在160個(gè)交集靶點(diǎn)中富集到相關(guān)信號(hào)通路有98條，通過(guò)P值篩選得到排名前19的通路（圖5B），主要涉及流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化等信號(hào)通路。

圖5 基因本體（GO）富集分析（A）與京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）富集分析（B）

6.分子對(duì)接驗(yàn)證

選擇桃紅四物湯合五苓散干預(yù)靜脈血栓的中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)中Degree值排名前5的有效成分：槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇，與PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree值排名前5的靶點(diǎn)：TNF、AKT1、IL1B、VEGFA、MMP9，分別進(jìn)行分子對(duì)接并計(jì)算結(jié)合能（表3）。一般認(rèn)為結(jié)合能小于-5 kcal/mol表示化合物與靶點(diǎn)結(jié)合能力較好［8］。所選化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol，說(shuō)明結(jié)合能力較好。其中TNF與山奈酚、木犀草素，ATK1與β-谷甾醇，IL1B與豆甾醇，VEGFA與β-谷甾醇，MMP9與木犀草素結(jié)合能較低。將結(jié)果利用PyMOL軟件進(jìn)行可視化處理（圖6）。

圖6 分子對(duì)接模型（A為TNF與山奈酚，B為TNF與木犀草素，C為ATK1與β-谷甾醇，D為IL1B與豆甾醇，E為VEGFA與β-谷甾醇，F(xiàn)為MMP9與木犀草素）

表3 分子對(duì)接結(jié)合能（kcal/mol）

討論

VTE是臨床上最常見(jiàn)的血管疾病，癌癥、手術(shù)等多種原因均可導(dǎo)致VTE的發(fā)生［9］，并有可能導(dǎo)致肺動(dòng)脈栓塞等嚴(yán)重后果，是圍手術(shù)期非預(yù)期死亡的主要原因［10］。如何更安全有效地預(yù)防VTE的發(fā)生成為當(dāng)前亟待解決問(wèn)題。臨床應(yīng)用已表明中醫(yī)藥在防治VTE方面療效確切且不良反應(yīng)較小［11］，但具體作用機(jī)制的研究仍較缺乏。

本研究初步篩選出桃紅四物湯合五苓散有效成分共103個(gè)，關(guān)鍵靶點(diǎn)68個(gè)。其中，主要成分槲皮素、山奈酚和木犀草素均屬于黃酮類化合物，能夠調(diào)控多種信號(hào)通路，具有抗炎、抗氧化、改善血流動(dòng)力學(xué)［12-13］等多種生物活性；β-谷甾醇、豆甾醇具有非競(jìng)爭(zhēng)性抑制凝血酶發(fā)揮抗血小板和溶栓作用［14］。

桃紅四物湯合五苓散干預(yù)VTE關(guān)鍵靶點(diǎn)主要為TNF、AKT1、IL1B、VEGFA、MMP9等。PPI網(wǎng)絡(luò)圖中，TNF是最核心靶點(diǎn)，在炎性反應(yīng)中具有重要的作用。文獻(xiàn)研究表明，槲皮素可以下調(diào)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子-κB（NF-κB）等信號(hào)通路抑制TNF-α、IL-1β等炎癥因子的產(chǎn)生［15-16］。山奈酚可以降低血清中包括TNF-α、IL-1β等多種促炎因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用［17］，保護(hù)血管［18］。木犀草素可以抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路，抑制IL-1β誘導(dǎo)NF-κB激活的過(guò)程［19］，逆轉(zhuǎn)IL-1β誘導(dǎo)的Ⅱ型膠原降解［20］。TNF-α與IL-1β是重要的炎癥因子，在細(xì)胞免疫反應(yīng)中有重要的作用，可以與凝血系統(tǒng)的激活相互影響［21-22］，與VTE的發(fā)生具有一定相關(guān)性［23］。TNF-α、IL-1β等炎癥因子可以促進(jìn)炎性發(fā)生與血液高凝狀態(tài)的形成，進(jìn)一步損傷內(nèi)皮細(xì)胞［24］。TNF-α激活后可通過(guò)PI3K/AKT等信號(hào)傳導(dǎo)通路，最終激活NF-κB，導(dǎo)致IL-1β、IL-8等促炎因子共同激活，引起炎癥的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，進(jìn)一步加重血管損傷。同時(shí)，活化的AKT還可增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）1α活性，激活HIF-1信號(hào)通路下游靶基因，如VEGF轉(zhuǎn)錄［25］。VEGF在缺氧狀態(tài)下可以促進(jìn)一氧化氮產(chǎn)生，使環(huán)狀鳥(niǎo)苷酸增加，也有促進(jìn)血小板聚集、引起血栓的作用［26］?？寡仔苑磻?yīng)或許可以成為抗血栓形成，治療VTE的新方向。

MMP也是重要靶點(diǎn)之一。槲皮素、木犀草素可以抑制MMP-9的產(chǎn)生［16，27］。MMP具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的生物活性，具有促進(jìn)血管生成的作用［28］。在生理狀態(tài)下，它與其生物抑制劑金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP）在組織中保持動(dòng)態(tài)平衡，MMP/TIMP失衡可能是VTE的原因之一［29］。但是，MMP在血栓的形成和再通中具有雙向作用。在血栓形成過(guò)程中，MMP的高度表達(dá)使細(xì)胞外機(jī)制過(guò)度降解，損傷血管壁，增加血管通透性，與TNF、IL-1等促炎癥因子共同作用，促進(jìn)血栓的形成；在血栓再通階段，MMP通過(guò)降低血管致密性，使血管更易向外擴(kuò)張，促進(jìn)新生血管形成，加速血栓的再通［30］。桃紅四物湯合五苓散能否雙向調(diào)節(jié)該通路仍需進(jìn)一步研究。

GO和KEGG富集分析顯示，桃紅四物湯合五苓散干預(yù)血栓形成的靶基因主要涉及的生物過(guò)程包括細(xì)胞遷移的正調(diào)控、炎性反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)等；細(xì)胞組分包括膜筏、細(xì)胞外間質(zhì)、血小板α顆粒腔等；參與分子功能包括信號(hào)受體調(diào)節(jié)器活性、氧還原酶活性、絲氨酸水解酶活性等；主要涉及流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化等信號(hào)通路，與PPI關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)果相符合。分子對(duì)接顯示桃紅四物湯合五苓散的核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能力均較好，進(jìn)一步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，說(shuō)明中藥復(fù)方可通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮作用，反映了中醫(yī)思維的整體觀。

本研究仍存在一定局限性，如：篩選藥物作用僅局限于數(shù)據(jù)庫(kù)范圍，未考慮多味中藥有效成分之間的相互作用等，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)，初步揭示桃紅四物湯合五苓散抗靜脈血栓的可能有效成分和作用靶點(diǎn)，并構(gòu)建相關(guān)作用網(wǎng)絡(luò)，為深入研究其作用機(jī)制提供了一定理論基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明宋潔菲：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，統(tǒng)計(jì)分析；周迎光：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，實(shí)施研究，分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，獲取研究經(jīng)費(fèi)，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)