細胞蠟塊與液基制片技術對細胞學樣本ICC染色的比較研究

蔣麗娟 唐福婷 景紅霞

1南京醫(yī)科大學附屬婦產醫(yī)院 南京市婦幼保健院病理科，南京 210004；2南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 江蘇省中醫(yī)院病理科，南京 210029；3南京醫(yī)科大學附屬江寧醫(yī)院病理科，南京 210000

細胞蠟塊與液基制片技術提高了細胞學腫瘤診斷的準確性［1-2］。目前，大多運用細胞蠟塊或液基制片技術行免疫細胞化學（immunocytochemistry，ICC）染色協(xié)助病理醫(yī)生診斷，但是少有文獻比較細胞蠟塊切片與液基涂片兩種不同的細胞學制片技術對ICC結果的影響［3］。本文收集50例診斷為肺腺癌患者的癌性胸水標本，比較角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）、上皮特異性抗原（MOC-31）、天冬氨酸蛋白酶A（Napsin-A）及甲狀腺轉錄因子（thyroid transcription factor-1，TTF-1）4種抗體在胸水細胞蠟塊切片與液基涂片上的免疫染色差異，探討這兩種細胞學技術對細胞學樣本ICC結果的影響，為病理醫(yī)生選擇不同載體的ICC染色提供依據。

資料與方法

1.材料

回顧性分析江蘇省中醫(yī)院2022年1月至12月診斷為肺腺癌的50例胸水樣本。選擇MOC-31、Napsin-A、CK7及TTF-1 4種抗體，分別在胸水細胞蠟塊切片及液基涂片上行4種抗體的ICC染色。

2.方法

2.1.胸水液基涂片的制作 取50 ml胸水于離心管，1 000 r/min離心5 min，去上清液，吸取細胞沉渣置于新柏氏非婦科液基保存液試劑瓶，靜置15 min后，用Thinpre 2 000液基制片機（美國豪洛捷公司）制作5張液基涂片，立即95%乙醇固定15 min，1張行巴氏染色，其余4張75℃烤片15 min，備ICC染色。

2.2.胸水細胞蠟塊切片的制作 取50 ml胸水于離心管，1 000 r/min離心5 min后去上清液后，加入10 ml 4%中性福爾馬林，固定30 min后再次1 000 r/min離心5 min，加入1%融化后的瓊脂糖，細胞沉渣凝固后放入組織包埋盒，常規(guī)脫水、包埋、3 μm切片、備ICC染色。

3.ICC染色

應用EnVision二步法原理，采用全自動免疫組化機（DAK0公司Omnis平臺）進行染色。對細胞蠟塊切片及液基涂片分別行MOC-31、Napsin-A、CK7及TTF-1免疫染色，4種即用型一抗均購自北京中衫金橋公司，同時設立陰性及陽性對照。MOC-31與CK7陽性信號定位于腫瘤細胞膜，Napsin-A定位于腫瘤細胞漿，TTF-1定位于腫瘤細胞核，免疫染色結果根據整張切片及液基涂片中的腫瘤染色強度分為陰性（無染色）、弱陽性（淺黃色）、強陽性（深黃色及棕色），弱陽性與強陽性表達判讀為陽性表達。

4.統(tǒng)計學方法

所有數據采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，定性數據結果運用χ2檢驗，不滿足χ2檢驗的數據，采用Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1.細胞蠟塊切片及免疫染色結果

細胞蠟塊切片中腺癌細胞呈腺管樣或小簇狀，細胞核重度異型，呈空泡核，核膜增厚，可見核仁，核漿比高（圖1A）。ICC染色細胞蠟塊切片免疫染色結果，33例TTF-1強陽性表達，10例弱陽性表達（圖1B），7例陰性表達；40例MOC-31強陽性表達，10例弱陽性表達（圖1C）；28例Napsin-A強陽性表達，14例弱陽性表達（圖1D），8例陰性表達；46例CK7強陽性表達，4例弱陽性表達。

圖1 細胞蠟塊切片及液基涂片肺腺癌細胞免疫染色表達的差異。A：細胞蠟塊切片，腫瘤細胞呈單個、小簇狀排列（HE染色 ×200）；B：細胞蠟塊切片，肺腺癌細胞細胞核TTF-1弱陽性表達（ICC染色 ×200）；C：細胞蠟塊切片，肺腺癌細胞細胞膜MOC-31弱陽性表達（ICC染色 ×200）；D：細胞蠟塊切片，肺腺癌細胞細胞漿Napsin-A弱陽性表達（ICC染色 ×200）；E：液基涂片，腫瘤細胞呈三維立體排列，腫瘤細胞細胞漿稀少，具有高核漿比（巴氏染色 ×200）；F：液基涂片，肺腺癌細胞細胞核TTF-1強陽性表達，腫瘤細胞的高核漿比，導致胞漿不明顯（ICC染色 ×200）；G：液基涂片，肺腺癌細胞細胞膜MOC-31強陽性表達，因腫瘤細胞呈三維立體排列，胞膜的染色遮蓋住細胞核（ICC染色 ×200）；H：液基涂片，肺腺癌細胞細胞漿Napsin-A強陽性表達，胞漿的染色遮蓋住細胞核（ICC染色 ×200）

2.液基涂片免疫染色結果

液基涂片中腺癌細胞呈三維立體狀（圖1E），細胞核重度異型，染色質深染，核膜增厚，核漿比高，可見增大的核仁，部分胞漿可見胞漿黏液空泡。44例TTF-1強陽性表達（圖1F），2例弱陽性表達，4例陰性表達；50例MOC-31強陽性表達（圖1G）；40例Napsin-A強陽性表達（圖1H），5例弱陽性表達，5例陰性表達；50例CK7強陽性表達。

3.比較4種抗體在液基涂片及細胞蠟塊切片中陽性表達率和強陽性率

CK7與MOC-31在細胞蠟塊切片與液基涂片上的陽性表達率均為100%，兩者無差異，Napsin-A與TTF-1的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。MOC-31、Napsin-A及TTF-1的細胞蠟塊切片與液基涂片強陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），CK7的細胞蠟塊切片與液基涂片強陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

表1 4種抗體在液基涂片及細胞蠟塊切片中陽性表達率比較 [%（例）]

表2 4種抗體在液基涂片及細胞蠟塊強陽性率比較[%（例）]

討論

細胞蠟塊技術是近年發(fā)展起來的一項新的儲存細胞的技術［4-5］。其主要原理是將細胞學樣本離心，富集細胞后經4%中性甲醛固定，獲得細胞沉渣后再行脫水、石蠟包埋，制作成細胞蠟塊，制作流程和常規(guī)組織基本一樣。因此，細胞蠟塊切片行免疫細胞染色會出現福爾馬林導致的抗原封閉現象，導致抗原不表達或表達變弱［6-7］。本研究中選擇的4個抗體，CK7與MOC-31兩個抗體表達于肺腺癌的細胞膜，Napsin-A表達于肺腺癌的細胞漿，TTF-1表達于肺腺癌的細胞核，在細胞蠟塊與液基涂片陽性表達率的比較中，4種定位于不同細胞部位抗體的陽性表達率差異均無統(tǒng)計學意義［8-13］。因此，兩種細胞存儲技術對于漿膜腔積液細胞的抗原保存均具有良好的作用。但是，細胞蠟塊切片與液基涂片的表達強度比較中，MOC-31、Napsin-A及TTF-1 3種抗體在液基涂片上的強陽性表達率比細胞蠟塊切片高，且差異有統(tǒng)計學意義，說明液基涂片能提高不同表達部位抗體的ICC染色強度。分析原因如下：細胞蠟塊技術通過4%的甲醛固定細胞，甲醛導致細胞中的蛋白變性，蛋白發(fā)生交聯(lián)，導致抗原封閉，后期抗原修復不能完全暴露抗原，導致免疫染色的強度降低，同時細胞蠟塊脫水過程中接觸乙醇、二甲苯等有機試劑進一步引起蛋白的變性，導致抗原活性的改變，從而降低免疫染色的強度。目前，常用的抗原修復方式是熱修復與化學試劑修復，常用的化學試劑修復液有EDTA、檸檬酸、EGTA、Tris、胰酶、胃酶等［14-16］。在使用相同的抗原修復液的條件下，熱修復溫度越高，免疫染色強度越強［17］。本研究中運用的全自動免疫組化儀采用的是微波熱修復抗原，液基涂片的細胞一般呈單層平鋪排列，相比于組織蠟塊的3 μm切片，化學修復試劑更易充分接觸細胞，微波熱修復更易修復細胞抗原，從而使液基涂片的免疫染色強度更強。CK7在液基涂片與細胞蠟塊切片的表達強度比較中差異無統(tǒng)計學意義，可能原因為CK7是日常工作中運用時間長且廣泛的一種抗體，提煉純度高、濃度高，研究表明濃度越高免疫染色越強［18］。

液基制片技術是1996年通過FDA認證的首先運用于宮頸癌篩查的一項技術，與傳統(tǒng)的普通細胞學相比，液基保存液具有消化黏液、紅細胞等作用，從而使液基涂片背景干凈，提高診斷的準確性［19-22］。因此，液基涂片也被廣泛運用于非婦科細胞學的診斷［23-25］。

非婦科細胞學液基制片技術是將離心后的細胞沉渣直接轉運到液基保存液中，全自動液基制片機完成制片后立即將液基涂片放入95%的乙醇固定，其標準化的制片使液基涂片的細胞量豐富、細胞厚度均勻，避免了傳統(tǒng)手工涂片細胞退變等缺點［24，26］。Dabbs等［27］運用液基涂片行ICC染色發(fā)現其染色強度強于傳統(tǒng)普通涂片。本研究中，在液基涂片行免疫染色之前，為避免細胞掉片，行15 min 75 ℃烤片，使細胞粘附于載玻片上，余免疫染色流程與細胞蠟塊切片完全相同，但是液基涂片的免疫染色結果更佳。其原因為：⑴液基涂片制作完成后立即采用95%的乙醇固定，避免細胞退變、抗原丟失，同時液基涂片細胞平鋪、分散，避免了細胞蠟塊切片的重疊擁擠，使抗原修復更充分，免疫染色結果更優(yōu)。⑵液基保存液是多成分的復合劑，含有不同濃度的甲醇、冰醋酸、二硫化碳等［28］。研究表明免疫染色的pH值越高，免疫染色強度越強［29］。相比于4%中性甲醛固定的細胞蠟塊樣本，液基保存液中的冰醋酸等酸性試劑導致細胞呈弱酸性，提高免疫染色的強度。⑶液基保存液保存細胞效果優(yōu)良，Sato等［30］研究表明液基保存液可以長達半年常溫保存細胞抗原，因此，液基涂片有利于免疫抗原的表達。⑷液基涂片無甲醛固定，二甲苯、浸蠟等脫水步驟，減少了抗原變性與封閉的機會。

本研究中4種抗體均為即用型抗體，目前即用型抗體主要是針對組織學樣本而配置。研究表明大部分組織學樣本與細胞學樣本免疫染色的抗體濃度相似，但是部分組織學樣本抗體濃度不適合細胞學樣本［27］。因此，每個實驗室應該根據實際情況驗證適合于細胞學樣本的抗體濃度，同時需要根據不同的制片方法，驗證不同的抗體濃度，使實驗結果最佳。標準化的非婦科細胞學標本送檢存在一定困難，細胞蠟塊制作流程復雜，導致漿膜腔積液制作的細胞蠟塊的細胞抗原存在一定的差異，從而導致細胞蠟塊切片的免疫染色存在一定的差異。因此，標準化的細胞蠟塊制作是減少免疫染色差異的方法。

雖然液基涂片的免疫染色效果優(yōu)于細胞蠟塊切片，但是細胞蠟塊富集更多的細胞，能重復切片驗證最佳的免疫染色條件，且能長年保存細胞。而液基涂片具有唯一性，不同的液基涂片的細胞可能導致免疫染色出現不同的結果，且液基保存液一般僅可制作5～8張涂片，明顯少于細胞蠟塊切片，不利于同一種細胞多種抗原的表達研究。因此，對于細胞蠟塊切片和液基涂片的免疫染色應根據實際情況綜合分析而定。若樣本中腫瘤細胞量少，制作細胞蠟塊困難，可以優(yōu)先選擇液基涂片行免疫染色，液基涂片更易觀察到陽性染色結果；若胞蠟塊切片免疫染色效果欠佳時，可以選擇液基涂片再次重復免疫染色，更有利于明確診斷；若積液中腫瘤量多，可選擇細胞蠟塊切片染色，雖然細胞蠟塊切片免疫染色的強度可能弱于液基制片，但染色的敏感性與液基涂片無差異，同時可組合多種抗體染色，提高診斷的準確性。

綜上分析，液基涂片與細胞蠟塊切片的免疫染色強度存在差異，但是細胞蠟塊存儲細胞量多，儲存細胞條件簡單，能重復多次免疫染色，液基涂片染色效果優(yōu)良，但是儲存細胞數量不確定。因此，液基涂片不能完全取代細胞蠟塊切片，兩者相結合，效果更好。實驗室應根據自己的條件，驗證適合細胞學樣本的免疫染色條件，病理醫(yī)生根據病例的具體情況選擇不同載體的免疫染色，為診斷助力。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明蔣麗娟：文章撰寫、醞釀和研究設計；唐福婷：采集數據、對文章的知識性內容作批評性審閱；景紅霞：工作支持和指導等