解毒消癥飲調控β-catenin轉位抑制人Huh7和PLC/PRF/5細胞株側群細胞增殖的機制

楊瑞明 薛易 江芷珊 曹治云 陳旭征

1福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福州 350122；2福建省中西醫(yī)結合老年性疾病重點實驗室，福州 350122；3福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122

中藥復方解毒消癥飲（Jiedu Xiaozheng Yin，JXY）是全國名中醫(yī)杜建教授的自擬經驗方，成分包括白花蛇舌草、夏枯草、山慈菇和苦參，臨床上主要用于熱毒熾盛證型的消化道腫瘤患者，具有清熱解毒、消腫散結等功效。研究發(fā)現，JXY乙酸乙酯提取物（ethyl acetate extract from JXY，EE-JXY）可以通過Wnt/β-Catenin通路抑制肝癌細胞的增殖［1］。EE-JXY還被發(fā)現可以降低肝癌側群（side population，SP）細胞在肝癌細胞中的比例，并抑制肝癌細胞中具有干性特征的相關因子CD133、c-kit、Oct4、Nanog、Sox2等的表達［2-3］，可能具有抑制肝癌干細胞生長的作用。但是，EE-JXY抑制肝癌干細胞生長的作用是否也與Wnt/β-Catenin通路相關尚未可知。2023年1月至5月，本研究通過體外培養(yǎng)Huh7和PLC/PRF/5人肝癌細胞株，觀察EE-JXY對肝癌細胞中SP細胞比例的影響，并對分選出的SP細胞進行平板克隆實驗和克隆球形成實驗，從Wnt/β-Catenin通路進一步闡明EE-JXY抑制肝癌干細胞生長的作用機制，為EE-JXY在臨床肝癌防治中的應用提供實驗依據。

材料與方法

1.試劑和儀器

胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；維拉帕米（Verapamil）、Hoechst33342染料購自美國Sigma公司；青霉素-鏈霉素混合溶液（100×雙抗）、重組人堿性成纖維生長因子（bFGF）、重組人表皮生長因子（EGF）購自美國PeproTech公司；B27購自美國Invitrogen公司；β-catenin抗體購自英國Abcam公司；4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）、Alexa Fluor 555標記的驢抗兔二抗、結晶紫染料購自碧云天生物公司。

倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；低速離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；MOFLO XDP分選型流式細胞儀（美國Beckman coulter公司）；細胞計數儀（美國CountStar公司）；高內涵細胞分析系統(tǒng)Pathway 855（美國BD Biosciences公司）。

2.細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞株Huh7和PLC/PRF/5細胞購買于中國上海中科院細胞庫，細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中（含1×105U/L的青鏈霉素），放在條件為37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)及傳代。

3.EE-JXY的制備

白花蛇舌草、山慈菇、夏枯草、苦參從香港培力藥業(yè)有限公司購買，按照2∶1∶1∶1的比例混合并粉碎均勻，10倍體積的75%乙醇浸泡30 min，回流提取2遍，每遍1 h，隨即混合提取液，過濾后采用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮。濃縮液經石油醚萃取3次，乙酸乙酯萃取3次，歸并乙酸乙酯萃取液，再次采用旋轉蒸發(fā)儀進行減壓濃縮，真空干燥后獲得粉末，即EE-JXY。

4.流式細胞儀檢測SP細胞比例并分選

將人肝癌細胞Huh7和PLC/PRF/5接種在6孔板中，0.25 g/L的EE-JXY分別干預24 h，消化細胞，制備成濃度為1×109個/L的單細胞懸液，再加入Hoechst33342染料，使染料的終濃度為5 mg/L，將水浴鍋升溫至37 ℃，將制備好的細胞懸液避光振蕩90 min，于4 ℃離心，在預冷的含2%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中重懸細胞，加入終濃度為2 mg/L的PI染液用以排除死亡細胞，上流式細胞儀檢測SP細胞的比例并分選。實驗同時設置Verapamil組，即在加入Hoechst33342染料的同時加入終濃度為50 μmol/L的Verapamil，其余步驟與其他各組相同。

5.平板克隆實驗

將上述實驗分選到的Huh7和PLC/PRF/5肝癌SP細胞懸液以200個/孔的細胞數接種在6孔板中，并緩慢晃動，使細胞均勻分布，培養(yǎng)2～3周。當觀察到6孔板中出現明顯的克隆時停止培養(yǎng)，棄去上清，用PBS洗滌1次，4%多聚甲醛固定細胞，并用結晶紫染色15 min，PBS洗滌后拍照。

6.克隆球形成實驗

將Huh7和PLC/PRF/5肝癌SP細胞接種在超低黏附6孔板中，按3×108個/L的密度接種培養(yǎng)過夜，用EE-JXY干預24 h，然后消化離心，并按500個/孔的密度把收集的細胞再次分別接種于超低黏附6孔板，在干細胞培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)10 d。期間，每隔3 d添加1 ml干細胞培養(yǎng)基［含有B-27（1∶50）、bFGF（20 μg/L）、EGF（20 μg/L）的DMEM/F12培養(yǎng)液］，倒置顯微鏡下觀察克隆球的形態(tài)和數量，并拍照。

7.免疫細胞熒光染色

將分選后的Huh7肝癌SP細胞接種在96孔板中24 h，0.25 g/L EE-JXY處理后，用4%多聚甲醛固定細胞10 min，在含有Triton X-100的阻斷緩沖液中孵育20 min。兔抗β-catenin抗體（1∶250），在4 °C下孵育過夜。PBS沖洗3次，每次10 min，細胞在Alexa Fluor 555標記的驢抗兔二抗（1∶1 000）避光孵育2 h，再沖洗3次后，孔中加入300 μg/L的DAPI染色5 min后，使用高內涵細胞分析系統(tǒng)檢測熒光表達的位置。

結果

1.EE-JXY降低Huh7和PLC/PRF/5細胞中SP細胞的比例

利用SP細胞具有將Hoechst33342染料泵出細胞外的特性，筆者通過流式細胞術檢測了肝癌細胞中SP細胞的比例。結果如圖1所示，Hoechst33342染料在紫外激發(fā)光的作用下，可發(fā)射450 nm（FL6）的藍光和675 nm（FL7）的紅光。但是，由于SP細胞對Hoechst33342染料拒染，在流式細胞圖上顯示為左下方有一群Hoechst33342熒光低表達的細胞群。當肝癌細胞未受到干預的時候，SP細胞含量在PLC/PRF/5中約占9.92%（圖1a），在Huh7中約占1.10%（圖1d）；當加入Verapamil后，這群細胞數量有所減少或完全消失（圖1b和1e）。當EE-JXY干預Huh7和PLC/PRF/5細胞24h后，PLC/PRF/5細胞中SP細胞含量從9.92%下降至0.59%，Huh7細胞中SP細胞含量從1.10%下降至0.58%，都有很明顯的下降趨勢（圖1c、圖1f），可見EE-JXY可以顯著降低SP細胞在肝癌細胞中的占比。

圖1 EE-JXY對Huh7和PLC/PRF/5細胞中SP細胞含量的影響

2.EE-JXY抑制分選后的Huh7和PLC/PRF/5肝癌SP細胞的克隆形成

如圖2所示，將上述流式細胞術分選出的Huh7和PLC/PRF/5肝癌SP細胞接種在6孔板中進行平板克隆實驗，結果發(fā)現，未受干預的SP細胞正常培養(yǎng)2～3周后均出現散在的克隆，大小不一，而經0.25 g/L的EE-JXY干預后分選出的SP細胞形成克隆的數量明顯減少，說明給藥后SP細胞的增殖能力明顯下降，難以形成克隆。

圖2 EE-JXY抑制肝癌SP細胞的克隆形成

3.EE-JXY對分選后肝癌SP細胞體外成球能力的影響

如圖3所示，在倒置顯微鏡下觀察克隆球數目，可見分選后的未受干預的Huh7和PLC/PRF/5肝癌SP細胞生長旺盛，成球狀況良好，而EE-JXY干預后克隆球數目較空白組明顯減少，說明EE-JXY減弱了肝癌SP細胞體外成球的能力，抑制了肝癌SP細胞的增殖。

圖3 EE-JXY抑制肝癌SP細胞克隆球的形成（200×）

4.EE-JXY對肝癌SP細胞Wnt/β-catenin通路中β-catenin蛋白轉位的影響

如圖4所示，在未處理的SP細胞中，β-catenin主要聚集在細胞質或細胞核中。經EE-JXY處理后，β-catenin出現在部分細胞的細胞膜中。顯然，EE-JXY可以促進β-catenin從細胞漿向細胞膜的轉位，這說明EE-JXY可以抑制β-catenin的活性。

圖4 EE-JXY對肝癌SP細胞β-catenin蛋白轉位的影響（400×）

討論

肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球常見的惡性腫瘤。目前，其治療方法主要有手術切除、放化療、靶向藥物治療等，但是由于肝癌細胞易轉移、對放化療和靶向藥物不敏感，以及這些藥物嚴重的不良反應等特點導致患者生存率沒有顯著提高。許多中藥復方在輔助腫瘤治療中發(fā)揮著良好的增效減毒作用，如在抑制肝癌細胞增殖、抑制肝癌細胞侵襲、誘導肝癌細胞凋亡等方面均被發(fā)現有很好的功效［4］。有關中藥復方抑制肝癌生長的作用機制，目前大多數研究以肝癌細胞為主要研究對象，較少關注肝癌組織中的癌干細胞（cancer stem cells，CSCs），而CSCs正是癌癥轉移的關鍵［5-6］。這群細胞因具有不斷自我更新、無限增殖等干細胞樣特性，具有一定的化療抵抗能力，導致肝癌易復發(fā)轉移［7］。目前，人們在研究肝癌CSCs的過程中還沒有發(fā)現一種靈敏度和特異度均較高的標志物。因此，對于了解肝癌CSCs有哪些特點、抗癌靶點的篩選以及肝癌CSCs的功能進行研究成了疑難問題［8］。近年來，學者們研究癌癥時發(fā)現一些細胞群可以將Hoechst33342熒光染料從細胞核排出細胞外，流式細胞術和熒光顯微鏡檢測均未觀察到染色或弱染色，學者稱其為SP細胞。SP細胞具有自我更新、多向分化、耐藥性及高致瘤性，這些特征與CSCs特征非常相似，SP細胞逐漸成為CSCs研究的切入點［9-10］。

CSCs發(fā)揮其干細胞樣特性與幾條信號通路如Wnt/β-catenin、Hippo-YAP/TAZ、JAK/STAT、Notch等關系密切，其中Wnt/β-catenin信號通路是研究最為明確的一條［11-13］。當該通路沒有被Wnt配體激活時，β-catenin匯聚在細胞質內，不能向核內易位，β-catenin會被糖原合成酶激酶3β（GSK3β）、酪蛋白激酶1（CK1）磷酸化，從而引起有關的蛋白酶體降解；當Wnt配體存在時，與細胞膜上的卷曲同源物和肺耐藥蛋白5/6（LRP5/6）結合并且受體共表達，激活該通路，細胞質內的β-catenin不會被GSK3β磷酸化，β-catenin轉移到細胞核內，調節(jié)Wnt信號通路下游的相關靶基因，然后發(fā)揮一系列的作用［14-15］。Wnt/β-catenin信號通路在CSCs中發(fā)揮著重要功能，促進CSCs耐藥和轉移，維持CSCs的增殖生長、自我更新和干細胞表型［16-18］。研究發(fā)現，EE-JXY可以明顯改善Huh7細胞對小劑量化療藥的抵抗，也可以抑制Hep3B細胞的干細胞樣特性，EE-JXY通過wnt/β-catenin通路抑制肝癌細胞增殖［2］。本研究首先對分選出來的Huh7和PLC/PRF/5細胞的SP細胞的百分含量進行測定，可以看出，在正常的Huh7和PLC/PRF/5細胞中SP細胞是有一定存在比例的，加入Verapamil后PLC/PRF/5和Huh7細胞中SP細胞的比例下降，這是因為SP細胞高表達ATP結合蛋白G2（ABCG2），這種蛋白可以將有毒的藥物排出細胞外，逃避化療藥物的損害，而Verapamil會特異性阻斷ABCG2，使其不能發(fā)揮功能，干細胞就會被殺傷，SP細胞含量顯著降低。本研究發(fā)現，EE-JXY能顯著降低肝細胞株中SP細胞的比例，與Verapamil有相同的作用，這說明EE-JXY對肝癌CSCs的抑制能力比對肝癌細胞更加敏感。緊接著本研究分選出這兩種細胞的SP細胞進行平板克隆實驗和克隆球實驗，發(fā)現EE-JXY組SP細胞平板克隆能力和克隆成球能力均明顯下降，進一步說明JXY可以抑制SP細胞的生長和增殖。鑒于前期發(fā)現EE-JXY可以通過Wnt/β-catenin信號通路抑制肝癌細胞的生長，本研究還考察了EE-JXY對肝癌SP細胞β-catenin的表達是否有抑制作用［19-20］，結果發(fā)現，正常情況下β-catenin多表達在細胞漿和細胞核內，加了EE-JXY后部分細胞的β-catenin轉位到了細胞膜上，說明EE-JXY抑制了β-catenin的活化。

綜上所述，EE-JXY可能通過影響Wnt/β-catenin信號通路，抑制β-catenin的活化，進而影響SP細胞的增殖，這可能是EE-JXY抑制肝癌細胞生長的機制之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明楊瑞明、薛易、江芷珊：實施研究，采集數據，起草文章，統(tǒng)計分析；曹治云：醞釀和設計試驗，對文章的知識性內容作批評性閱讀，支持性貢獻；陳旭征：醞釀和設計試驗，對文章的知識性內容作批評性閱讀，統(tǒng)計分析，獲取研究經費，指導，支持性貢獻