長江刀鱭FABP1基因遺傳多態(tài)性及其與生長性狀的相關(guān)性分析

于愛清 施永海 徐嘉波 嚴銀龍 鄧平平

(上海市水產(chǎn)研究所,上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站,上海 200433)

脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid binding proteins,FABPs)隸屬于蛋白分子量在14～16 kD的胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合蛋白超家族成員,與脂肪酸和膽固醇等親脂性物質(zhì)結(jié)合而參與疏水性長鏈脂肪酸在細胞內(nèi)、外的轉(zhuǎn)導,并影響脂類代謝酶的活性、胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導及基因的轉(zhuǎn)錄,也能夠作為分泌型蛋白調(diào)控細胞的生長和增殖[1-2]。FABP1與其他FABPs家族成員一樣,均具有類似的結(jié)構(gòu):一個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋域和由10個反平行β鏈組成的β桶,配體長鏈脂肪酸結(jié)合在β折疊內(nèi)空洞中心,空洞中心的水分子能夠置換脂肪酸,維持空洞內(nèi)的靜電網(wǎng)絡和蛋白穩(wěn)定性[1-2]。目前,哺乳動物FABPs按照首次分離或鑒定的時間和表達的組織特異性,主要分為FABP1(肝臟型)、FABP2(小腸型)、FABP3(心臟型)、FABP4(脂肪型)、FABP5(表皮型)、FABP6(回腸型)、FABP7(腦型)、FABP8(髓鞘型)和FABP9(睪丸型)等9種類型[3]。不同類型的FABPs基因序列之間具有高度同源性,分別高度表達于不同的組織,而伴隨著研究的深入,該蛋白家族的生物學功能不斷被挖掘和擴展到生長、發(fā)育、營養(yǎng)及免疫等諸多方面。

哺乳動物和禽類的FABP1基因往往與動物的肌內(nèi)脂肪酸沉積[4]、肌內(nèi)脂肪酸含量[5]和肉質(zhì)緊密相關(guān),被應用于生產(chǎn)性狀的遺傳改良和品種/系的選育研究。在魚類中,FABPs基因家族的研究主要集中于基因克隆、組織表達和表達模式、基因多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪酸沉積及生長性狀的相關(guān)性分析等方面[6-7]。Liu等[8]開展了斑馬魚(Daniorerio)FABP3基因的結(jié)構(gòu)和功能研究,發(fā)現(xiàn)斑馬魚FABP3在各組織均有表達,在心臟中表達量最高,并且與斑馬魚的卵黃發(fā)育和肝臟脂肪酸代謝功能密切相關(guān)。廖玉英等[9]對暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)FABP3基因進行了克隆和表達研究,探明暗紋東方鲀的FABP3基因主要參與脂肪酸分解過程,并探討了在暗紋東方鲀飼料中用豆油替代魚油的可行性。林亞秋等[10]開展了齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)和鯉(Cyprinuscarpio)FABP3基因的克隆、表達模式及其與肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat,IMF)含量的相關(guān)性研究,發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚FABP3基因的表達量與IMF含量呈顯著正相關(guān),而鯉的FABP3基因則與IMF含量呈顯著負相關(guān)。俞菊華等[2]開展了建鯉(C.carpiovarJian)FABP3基因多態(tài)性與增重性狀的相關(guān)性研究,獲得了1個與建鯉雌、雄魚魚種階段和雌魚成魚階段增重顯著相關(guān)(P<0.05)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(C30G),發(fā)現(xiàn)CC基因型個體增重顯著快于CG型個體,有望應用于建鯉的分子輔助良種研究。楊曉等[7]開展了紅鰭東方鲀(T.rubripes)FABP7基因多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián)性研究,獲得了兩個與紅鰭東方鲀生長性狀顯著相關(guān)的位點(G676A和A731C),有望應用于后期紅鰭東方鲀的分子育種研究。截至目前,長江刀鱭FABPs基因家族的相關(guān)研究鮮見報道。

刀鱭(Coiliaectenes)又名長頜鱭,俗稱刀魚、毛刀魚,隸屬于鯡形目(Clupeiformes)、鳀科(Engraulidae)、鱭屬(Coilia),主要分布于我國黃渤海、東海海域及以長江為代表的通海江河[11-12]。長江下游刀鱭的產(chǎn)量最高,因其魚體豐腴肥滿、肉質(zhì)細嫩鮮美而享有“長江三鮮”之首的美譽[13-15]。近年來,由于受到棲息地水域環(huán)境的污染、人類工程建設及酷漁濫捕等因素的影響,長江刀鱭自然種質(zhì)資源急劇衰退[16]。但隨著人工繁育和養(yǎng)殖技術(shù)的日趨成熟,以及長江流域十年禁捕政策的實施,自然種質(zhì)資源衰退的現(xiàn)狀得到了極大緩解。與此同時,養(yǎng)殖需求日益擴大,而良種卻極為匱乏,亟需選育出一個具有優(yōu)良性狀的長江刀鱭新品系進行推廣養(yǎng)殖。

本研究以上海市水產(chǎn)研究所的長江刀鱭核心選育群體F3為研究對象,基于長江刀鱭的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得長江刀鱭FABP1基因(CeFABP1基因)的部分cDNA序列,利用基因克隆和直接測序技術(shù)獲得CeFABP1基因的cDNA全長序列和基因組DNA序列,通過對該基因DNA上的多態(tài)性SNP位點進行篩選,開展基因多態(tài)性與生長性狀的相關(guān)性研究,以期能夠為長江刀鱭種質(zhì)資源評估和分子標記輔助育種提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用長江刀鱭均取自于上海市水產(chǎn)研究所奉賢科研基地于2017年獲得的長江刀鱭核心選育群體(F3)。

隨機選取3尾2齡刀鱭置于冰上,放置1～2 min待其輕微麻醉后,進行活體解剖。將肝組織迅速解剖分離出來,用無菌DEPC水沖洗后,置于液氮中迅速冷卻,然后置于-80 ℃超低溫冰箱保存,用于長江刀鱭FABP1基因的cDNA全長克隆研究。

隨機選取100尾同批次同池塘飼養(yǎng)的2齡長江刀鱭,用游標卡尺和電子天平測得其平均體長為(21.89±4.51) cm,平均體高為(3.40±0.74) cm,平均體質(zhì)量為(39.83±22.73) g。剪取部分魚的尾鰭置于盛有95%乙醇的1.5 mL離心管中,分別編號后,置于-20 ℃冰柜中保存,用于長江刀鱭FABP1基因的基因組DNA擴增、SNP位點篩選及其基因多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析。

隨機選取大規(guī)格雌性刀鱭(99.18±12.81)g、小規(guī)格雌性刀鱭(16.10±0.26)g、大規(guī)格雄性刀鱭(59.75±3.19)g和小規(guī)格雄性刀鱭(18.90±0.44)g各3尾,置于冰上,放置1～2 min,至其輕微麻醉后進行活體解剖。將肝臟剖離出來,用無菌DEPC水沖洗后,置于液氮中迅速冷卻,然后置于-80 ℃超低溫冰箱保存,用于開展長江刀鱭FABP1基因在大/小規(guī)格長江刀鱭的相對表達量研究。

1.2 總RNA和基因組DNA的提取

長江刀鱭肝臟組織總RNA的提取均參照Trizol Reagent Kit(RNA Extraction Kit,Invitrogen)試劑盒說明書進行?？俁NA溶解于DEPC水后,利用NanoVue Plus紫外可見分光光度計測定其濃度和純度,并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量,EB(溴化乙錠)染色凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。將質(zhì)量較好的RNA(28S和18S條帶清晰,且28S與18S的灰度比約為2∶1、無拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)、點樣孔附近無殘留,表明RNA無降解,質(zhì)量可靠)置于-80 ℃超低溫冰箱保存,備用。

長江刀鱭鰭條組織基因組DNA的提取參照天根生化科技(北京)有限公司的海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(DP324-03)說明書進行。DNA樣本提取完成后,利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoVue Plus紫外可見分光光度計檢測樣本DNA的質(zhì)量和濃度;經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測,顯示無拖尾降解現(xiàn)象、條帶清晰,且OD260 nm/OD280 nm的值在1.8～2.0的DNA樣品,稀釋至50 ng/μL后,保存于-20 ℃冰柜中,備用。

1.3 長江刀鱭FABP1基因cDNA全長克隆

(1)cDNA第一鏈的合成:長江刀鱭肝臟所提取的總RNA經(jīng)測定質(zhì)量和濃度后,按照PrimeScriptTMReal-time PCR Kit試劑盒(Takara公司,北京)的說明書進行反轉(zhuǎn)錄反應,獲得用于長江刀鱭cDNA序列拼接所需的cDNA模板,利用NanoVue Plus紫外可見分光光度計檢測反轉(zhuǎn)錄好的cDNA模板濃度,用RNase free水將終濃度統(tǒng)一調(diào)整為200 ng/μL后,置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)5’-RACE和3’-RACE cDNA模板的合成:參照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Takara公司,北京)說明書的方法,獲得長江刀鱭肝臟組織的3’-末端和5’-末端的cDNA模板,然后利用NanoVue Plus紫外可見分光光度計檢測反轉(zhuǎn)錄好的cDNA模板濃度,最后用Tricine-EDTA 緩沖液將該模板的濃度稀釋至500 ng/μL,置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)長江刀鱭FABP1基因cDNA全長的克隆?；诒菊n題組刀鱭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),獲得CeFABP1的部分cDNA序列,并利用Primer Premier 5.0軟件分別設計基因特異性引物(CeFABP1-QC)(見表1),對CeFABP1的部分cDNA序列拼接質(zhì)量進行驗證?；跍y序驗證后的序列,設計特異性RACE引物(5’GSP-1～2和3’GSP-1～2),以反轉(zhuǎn)錄合成的長江刀鱭肝臟5’-cDNA或3’-cDNA為模板,利用SAMRT-RACE技術(shù)獲得CeFABP1的cDNA序列全長。反應體系為25 μL,包括12.5 μL 2×TaqPCR Mix,2 μL 5’ RACE-Ready或3’ RACE-Ready cDNA,2.5 μL UPM(通用引物),0.5 μL 5’或3’基因特異性引物(5’GSP-1～2和3’GSP-1～2),用ddH2O補充總體積至25 μL。PCR反應條件為:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,72 ℃延伸3 min,5個循環(huán);94 ℃變性30 s,70 ℃延伸30 s,72 ℃再延伸3 min,5個循環(huán);94 ℃變性30 s,在引物最適的退火溫度退火30 s,72 ℃延伸3 min,30個循環(huán)后,72 ℃再延伸10 min,4 ℃+∞。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,將目的條帶割膠純化,并進行T-A克隆測序,測序菌液經(jīng)菌落PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證后,交由生工生物工程(上海)股份有限公司測序(測序所用引物為23-Mer和24-Mer)。

表1 用于長江刀鱭FABP1基因擴增所用引物序列

(4)以大規(guī)格/小規(guī)格雌、雄長江刀鱭肝臟組織cDNA模板,利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測長江刀鱭FABP1基因的表達差異情況。基于長江刀鱭FABP1基因的cDNA序列設計qRT-PCR引物(見表1),利用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的Talent熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)在StepOne Plus實時熒光定量PCR儀(ABI,美國)上進行qRT-PCR反應。反應體系和反應條件參照該試劑盒說明書進行,每個樣品做3次技術(shù)重復,以長江刀鱭β-actin為內(nèi)參基因,利用2-ΔΔCt法計算長江刀鱭FABP1基因mRNA的相對表達量。

1.4 CeFABP1的生物信息學分析

利用VecScreen在線軟件篩除CeFABP1基因克隆測序序列中的載體序列,并經(jīng)SMART-RACE技術(shù)克隆并拼接CeFABP1基因的cDNA全長。利用NCBI ORF-Finder、SMART、Predict-protein、SWISS-MODEL和ExPasy-ProtParam等在線軟件預測該基因的開放式閱讀框,預測信號肽和結(jié)構(gòu)域,分析該基因蛋白組成、結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì);用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 CeFABP1基因組DNA擴增和多態(tài)SNP位點篩選

基于CeFABP1基因的cDNA序列,利用Primer Premier 5.0軟件設計基因特異性PCR擴增引物(見表1)。其中,CeFABP1-FL是參照大西洋鯡FABP1基因內(nèi)含子和外顯子的相對位置設計而成,用于擴增CeFABP1基因的第1內(nèi)含子、第2內(nèi)含子和第3內(nèi)含子序列;CeFABP1-SC則以CeFABP1基因組DNA序列為基礎(chǔ)設計而成,然后以具有極端生長表型的不同刀鱭,即體質(zhì)量最大的10尾魚[(89.53±14.51) g]和體質(zhì)量最小的10尾魚[(18.75±1.62) g]的DNA樣本為模板,利用直接測序法篩選CeFABP1基因組DNA上的多態(tài)性位點。

1.6 CeFABP1基因多態(tài)性與生長性狀的相關(guān)性

基于初步的多態(tài)性SNP位點篩選結(jié)果,鑒于長江刀鱭FABP1基因組DNA上的SNP位點間隔均較小,不易用其他方法進行分型,因此采用直接測序法(引物CeFABP1-SC)對100尾長江刀鱭進行基因分型?；诨蚍中徒Y(jié)果,利用GenAIEx 6.5軟件[17]計算長江刀鱭養(yǎng)殖群體的有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,Ne)、觀測雜合度(observed heterozygosity,Ho)和期望雜合度(expected heterozygosity,Ne)等遺傳參數(shù),并對14個SNP位點進行哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)檢驗;利用PIC-CALC軟件計算實驗群體中每個SNP位點的多態(tài)信息含量(polymorphic information content,PIC);利用SPSS 20.0軟件中的一般線性模型(general linear model,GLM)分析不同SNP位點的不同基因型及其與刀鱭生長性狀(體質(zhì)量、體高和體長)的關(guān)聯(lián)程度。

2 結(jié)果

2.1 CeFABP1基因序列特征和生物信息學分析

CeFABP1 cDNA全長525 bp,開放式閱讀框由384個核苷酸所編碼的127個氨基酸組成,以ATG作為起始密碼子,TGA作為終止密碼子;5’-非編碼區(qū)和3’-非編碼區(qū)長度分別為99 bp和42 bp,在3’-非編碼區(qū)域具有明顯的多聚腺苷酸加尾信號(AATAAA)(見圖1)。長江刀鱭FABP1基因組DNA由1 285個核苷酸組成(見圖2),包括4個外顯子和3個內(nèi)含子。

CeFABP1蛋白的原子組成為C617H1011N161O195S5,蛋白分子量為13.965 kD,理論等電點為6.12。CeFABP1蛋白的氨基酸組成見表2。結(jié)果顯示,氨基酸殘基中負電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為16個,正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為15個,其中色氨酸(Trp)缺失,數(shù)量為0;賴氨酸(Lys)數(shù)量最多(13個),占氨基酸總數(shù)的10.24%?；诘鞍踪|(zhì)穩(wěn)定性劃分標準,若不穩(wěn)定系數(shù)≤40即為穩(wěn)定性蛋白。CeFABP1氨基酸不穩(wěn)定指數(shù)為32.10,表明該蛋白為穩(wěn)定蛋白。

表2 長江刀鱭FABP1基因編碼蛋白的氨基酸組成

CeFABP1蛋白二級結(jié)構(gòu)預測為混合型,由19個氨基酸(占氨基酸總數(shù)的14.96%)構(gòu)成α-螺旋(alpha-helices),58個氨基酸(占氨基酸總數(shù)的45.67%)構(gòu)成無規(guī)則卷曲(random coil),50個氨基酸(占氨基酸總數(shù)的39.37%)構(gòu)成伸展鏈(extend stand)(見圖3)。利用SWISS-MODEL軟件對CeFABP1蛋白三級結(jié)構(gòu)進行預測,結(jié)果顯示,CeFABP1蛋白三維結(jié)構(gòu)主要由10個β折疊和2個α-螺旋組成(見圖4)。

注:藍色代表α-螺旋,紅色e代表伸展鏈,橘黃色c代表無規(guī)則卷曲。

圖4 長江刀鱭FABP1蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測

基于CeFABP1氨基酸序列構(gòu)建進化樹,結(jié)果顯示,CeFABP1首先與大西洋鯡聚為一支,再與美洲西鯡聚為一支,最后與其他魚類聚為一支。這一結(jié)果與傳統(tǒng)的分類關(guān)系相一致(見圖5)。

圖5 長江刀鱭FABP1基因編碼區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 長江刀鱭FABP1基因在肝臟組織的表達量分析

鑒于長江刀鱭雌、雄個體的表型差異相對較大,本研究大/小規(guī)格的雌、雄長江刀鱭為實驗材料,以小規(guī)格長江刀鱭為對照組,大規(guī)格長江刀鱭為試驗組,基于肝臟組織,開展長江刀鱭FABP1基因的相對表達量研究。結(jié)果顯示,在雌性長江刀鱭中,大規(guī)格長江刀鱭的FABP1基因mRNA的表達量是小規(guī)格長江刀鱭的0.55倍;在雄性長江刀鱭中,大規(guī)格長江刀鱭的FABP1基因mRNA的表達量是小規(guī)格長江刀鱭的0.80倍(見圖6),表明長江刀鱭FABP1基因?qū)τ陂L江刀鱭雌、雄群體的生長表型均具有負向調(diào)控作用。

圖6 長江刀鱭FABP1基因在大/小規(guī)格雌、雄個體肝臟的表達量變化

2.3 長江刀鱭FABP1基因多態(tài)性與生長性狀的相關(guān)性及遺傳分析

基因多態(tài)性檢測結(jié)果顯示,CeFABP1基因組DNA上總共檢測到14個SNP位點(見圖2中有下劃線且加粗的字體),其中在第1內(nèi)含子上檢測到1個SNP突變位點(g.250A>G);在第2內(nèi)含子上檢測到11個SNP位點(g.544A>T、g.564C>T、g.577A>T>C、g.595A>C、g.637G>T、g.654A>G、g.659G>T、g.670C>G、g.840A>G、g.908C>T和g.108 6A>G);在第3外顯子和內(nèi)含子上分別檢測到1個SNP位點(g.110 4A>G和g.111 8C>G)。

CeFABP1基因上14個突變位點共組成43種基因型,分別將基因型與刀鱭的生長性狀(體質(zhì)量、體長和體高)關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果見表3。從表3中可以看出,14個位點不同基因型個體間的體質(zhì)量、體高和體長性狀均沒有顯著差異(P>0.05)。14個突變位點的基因型頻率和基因頻率(見表4)的分析結(jié)果顯示,不同SNP位點具有不同的基因型頻率和等位基因頻率,其中還有1個具有較高多態(tài)性的三等位基因突變位點(g.577A>T>C)。

表3 長江刀鱭FABP1基因的14個突變位點及其與生長性狀的相關(guān)性分析

表4 14個突變位點在刀鱭養(yǎng)殖群體中的基因型和等位基因頻率

CeFABP1基因上的14個突變位點在刀鱭養(yǎng)殖群體中的遺傳多樣性參數(shù)見表5。有效等位基因數(shù)(Ne)為1.523～2.767,觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)分別為0.410～0.760和0.343～0.639,多態(tài)信息含量(PIC)為0.284～0.565,其中13個SNP位點均屬于中度多態(tài)(0.250.5)。哈迪-溫伯格平衡(HWE)檢測結(jié)果顯示,3個SNP位點(g.577A>T>C、g.654A>G和g.1 104A>G)均顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(P<0.05),11個SNP位點(g.250A>G、g.544A>T、g.564C>T、g.595A>C、g.637G>T、g.659G>T、g.670C>G、g.840A>G、g.908C>T、g.1 086A>G和g.1 118C>G)符合哈迪-溫伯格平衡(P>0.05)。

表5 長江刀鱭FABP1基因上14個突變位點的遺傳參數(shù)分析

3 討論

脂肪酸結(jié)合蛋白通過結(jié)合細胞內(nèi)游離的脂肪酸和其他疏水性配體,將其輸送到過氧化物酶體、線粒體和細胞核等細胞器,調(diào)控動物機體內(nèi)脂肪酸的氧化和甘油三酯及磷脂合成等脂質(zhì)代謝過程[6],在能量貯存、信號轉(zhuǎn)導、生物膜的合成、過氧化物酶體的氧化、酶活力的調(diào)節(jié)、機體免疫反應及細胞的增殖和分化等生理生化過程中發(fā)揮重要的生物學功能[6]。研究表明,淡水硬骨魚類具有豐富的Δ12及Δ15等脂肪酸去飽和酶,能夠?qū)営退岷蛠喡樗徂D(zhuǎn)化為二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等多不飽和脂肪酸,并儲存在肌肉等組織中[6,18],使魚類成為人類多不飽和酸脂肪酸攝入的重要食物來源[6]。因此,對魚類脂肪酸代謝相關(guān)基因的研究尤為重要。人類的FABP1基因主要表達在肝臟,且與脂肪肝、肝硬化及肝癌的發(fā)生密切相關(guān),因而被作為肝損傷早期的高敏感檢測指標[19]。禽畜類的FABP1基因與生產(chǎn)性能密切相關(guān),往往被作為生產(chǎn)性能遺傳改良的重要候選基因[4-5,19-20]。目前對魚類FABP1基因的研究較少,僅對FABPs基因家族部分成員開展了基因克隆、基因表達和表達模式及其基因多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪沉積和生長性狀相關(guān)性研究[7,10,21-23],對長江刀鱭相關(guān)方面的研究更是鮮見。因此,對長江刀鱭脂肪酸結(jié)合蛋白及其基因開展進一步的研究,對于闡明長江刀鱭脂肪酸結(jié)合蛋白的生物學功能及其在良種選育中的應用具有重要意義。

本研究首次對長江刀鱭FABP1基因開展了SNP位點的篩選及其基因遺傳多態(tài)性與生長性狀的相關(guān)性研究,結(jié)果顯示,在長江刀鱭的FABP1基因上成功鑒定到14個SNP突變位點,其中13個位點發(fā)生在內(nèi)含子上,表明該基因較為保守;而僅在第3外顯子檢測到1個突變位點(g.1 104A>G)。該位點的突變屬于非同義突變,已經(jīng)造成了氨基酸序列的改變,將原來的蘇氨酸(Thr)替換為丙氨酸(Ala),這對于該基因的mRNA穩(wěn)定性、翻譯效率及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能會產(chǎn)生一定程度的影響,但是對于生長表型暫未產(chǎn)生顯著的影響(3種基因型個體的生長性狀沒有顯著差異)。與之相同的是,人類FABP1基因第3外顯子的1個突變位點(T94A,rs2241883)亦由原來的蘇氨酸(Thr)被替換為丙氨酸(Ala),后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn),這個突變位點與人類臨床血脂異常、動脈硬化性腦梗死和非酒精性脂肪肝均顯著相關(guān)[24-25]。正常情況下,蘇氨酸(Thr)在哺乳動物中高度保守,不易發(fā)生突變,但在長江刀鱭中,該位點的突變對于長江刀鱭的其他生理功能是否有影響有待進一步研究。

在動物的人工養(yǎng)殖繁育過程中,人工選擇的壓力會導致SNP在動物單個基因或者整個基因組的分布出現(xiàn)差異,特別是位于編碼區(qū)的SNP變異往往能夠引起氨基酸結(jié)構(gòu)的改變,進而改變所編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或活性,而內(nèi)含子SNP發(fā)生突變的概率經(jīng)常是外顯子的4.3倍[26],部分基因的內(nèi)含子序列含有增強元件或其他順式作用元件,能夠調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄或者剪切,增加mRNA在細胞核內(nèi)的穩(wěn)定性,從而影響基因的表達效應,因此,發(fā)生于內(nèi)含子的SNP亦不容忽視;而使用頻率不同的密碼子亦能夠?qū)е耺RNA翻譯效率和速度的差異,引起動物細胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平的差異,最終導致動物的生長性能差異。近期有研究表明,發(fā)生在內(nèi)含子內(nèi)的突變能夠?qū)е滤a(chǎn)動物的生產(chǎn)性狀發(fā)生顯著差異[7],如斑點叉尾魚回(Ictaluruspunctatus)MSTN基因第2內(nèi)含子上的1個突變位點與其體質(zhì)量、體長性狀顯著相關(guān)(P<0.05)[27];長江刀鱭(C.ectenes)MSTN基因第1內(nèi)含子上的1個突變位點與其體長、體高和體質(zhì)量性狀顯著相關(guān)(P<0.05)[28];在紅鰭東方鲀FABP7基因第3內(nèi)含子上檢測到1個與其體質(zhì)量、體長、體全長、尾柄長和體高等多數(shù)性狀均顯著相關(guān)的SNP位點[7]。本研究中,在長江刀鱭FABP1基因內(nèi)含子上檢測到的13個突變位點,與長江刀鱭的體長、體高和體質(zhì)量均沒有顯著的相關(guān)性,是否與長江刀鱭的脂肪酸含量有關(guān)有待后續(xù)進一步的深入研究。此外,在本研究中,突變位點g.1 104A>G僅檢測到AA和AG基因型,并未檢測到GG基因型個體。一方面可能由于樣本量較少,有待今后擴大樣本量進行檢測驗證;另一方面,該位點純合GG基因型可能是致死基因型,會導致該基因型個體缺失。正常情況下,SNP突變以二等位基因為主,三等位和四等位基因非常少,幾乎可以忽略不計,而在本研究中,位點g.577A>T>C則是發(fā)生概率極小的三等位基因SNP(tri-allelic SNP),頻率最低的C等位基因頻率為22.5%,該位點的基因遺傳多態(tài)性顯著高于其他突變位點。

觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)是群體遺傳變異程度的重要參考指標,對于長江刀鱭養(yǎng)殖群體的種質(zhì)資源評估具有重要作用。在本研究中,14個SNP位點對于長江刀鱭養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性評估的結(jié)果顯示,觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.410～0.760、0.343～0.639和0.284～0.565,表明長江刀鱭養(yǎng)殖群體仍然具有豐富的遺傳變異和較好的種質(zhì)開發(fā)潛力?；贐otstein等[29]提出的多態(tài)信息含量(PIC)的判斷標準,當PIC<0.25、0.250.5時,分別代表該位點具有低度、中度、高度多態(tài)性。在本研究中,14個SNP位點中有13個位點屬于中度多態(tài)(0.250.5),表明這些位點能夠有效應用于長江刀鱭養(yǎng)殖群體的種質(zhì)資源評估。哈迪-溫伯格平衡(HWE)檢測結(jié)果顯示,有3個SNP位點顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(P<0.05),表明這些位點可能已經(jīng)受到不同程度的人工選擇壓力的影響。

本研究利用基因克隆和PCR擴增技術(shù)獲得了長江刀鱭FABP1基因的cDNA全長序列和DNA序列,并利用直接測序法對長江刀鱭FABP1基因開展了多態(tài)性SNP位點的篩選、分型及其與生長性狀相關(guān)性的研究,成功鑒定到了14個多態(tài)性SNP位點,這些位點雖然與生長性狀的相關(guān)性不顯著,但是卻能夠有效應用于長江刀鱭養(yǎng)殖群體的種質(zhì)資源評估。