非洲豬瘟病毒無(wú)標(biāo)簽p35蛋白的制備及間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立

吳植　盧會(huì)鵬　王安平　謝軍　曹世諾　徐艷　朱善元

摘要：為了進(jìn)一步提高非洲豬瘟病毒（ASFV）間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）抗體檢測(cè)方法的特異性，本研究構(gòu)建了類彈性蛋白（ELP）標(biāo)簽與ASFV p35融合表達(dá)載體，利用相變循環(huán)分離純化融合蛋白后，用煙草蝕紋病毒蛋白酶（TEVP）切除ELP標(biāo)簽，制備獲得無(wú)標(biāo)簽p35蛋白，以此為包被抗原，通過(guò)一系列的條件摸索和優(yōu)化，建立ASFV間接ELISA抗體檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，ELP-p35融合蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量大小約為80 000；制備獲得的無(wú)標(biāo)簽p35蛋白能夠被非洲豬瘟陽(yáng)性血清所識(shí)別；抗原包被最佳質(zhì)量濃度為2.00 μg/ml，待檢血清最佳稀釋比例為1∶200，二抗最佳稀釋比例為1∶10 000，陰性和陽(yáng)性判定閾值OD₄₅₀為0.171；與口蹄疫病毒（FMDV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）和偽狂犬病毒（PRV）等陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好；批內(nèi)、批間試驗(yàn)結(jié)果顯示變異系數(shù)都小于5.000%，重復(fù)性好；可檢測(cè)400倍稀釋的血清，敏感性較高；與商品化檢測(cè)試劑盒（ING）檢測(cè)結(jié)果的符合率高達(dá)100%。結(jié)果表明，用本研究制備的ASFV無(wú)標(biāo)簽p35蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA方法可用于ASFV抗體的檢測(cè)，為該病的進(jìn)一步精準(zhǔn)檢測(cè)提供了技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟；類彈性蛋白；無(wú)標(biāo)簽p35蛋白；間接ELISA方法

中圖分類號(hào)：S852.65+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2023）05-1209-08

Preparation of tag-free p35 of African swine fever virus and development of an indirect enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） antibody detection methodWU Zhi，LU Hui-peng，WANG An-ping，XIE Jun，CAO Shi-nuo，XU Yan，ZHU Shan-yuan

（Jiangsu Agri-Animal Husbandry Vocational College/Jiangsu Key Laboratory for High-Tech Research and Development of Veterinary Biopharmaceuticals/Engineering Technology Research Center for Modern Animal Science and Novel Veterinary Pharmaceutic Development， Taizhou 225300， China）

Abstract：To further improve the specificity of indirect enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） method for detection of African swine fever virus （ASFV） antibody， fusion expression vector containing elastin-like polypeptide （ELP） tag and ASFV p35 was constructed. After separating and purifying the fusion protein by inverse transition cycling， the tag-free p35 protein was obtained by cutting off the ELP tag by tobacco etch virus protease （TEVP）. Using the purified recombinant protein as coating-antigen， the study aimed to establish an indirect ELISA method for detecting ASFV antibody through a series of condition exploration and purification. The results showed that， the relative molecular mass of ELP-p35 fusion protein was 80 000， and the obtained tag-free p35 protein could be recognized by positive serum of ASFV. It was found that the optimum antigen coating mass concentration was 2.00 μg/ml， the optimum dilution rate for sera to be tested was 1∶200， the optimum dilution rate for HRP-IgG was 1∶10 000， and the cut-off value of OD₄₅₀was 0.171. The method showed no cross-reaction with positive sera of foot-and-mouth disease virus （FMDV）， porcine circovirus type 2 （PCV2）， porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）， classical swine fever virus （CSFV） and pseudorabies virus （PRV）， which showed high specificity. Coefficients of variation of the intra- and inter-assay were both <5.000% and showed good repeatability. Besides， the method could detect serum diluted 400 times， which showed high sensitivity. Compared with commercialized detection kits （ING）， the coincidence rate of testing results of tag-free p35-ELISA method was 100%. The results indicated that the established indirect ELISA method by using tag-free p35 protein as coating antigen of ASFV can be applied in detection of ASFV-specific antibodies， which can provide technological tool for accurate detection of ASFV.

Key words：African swine fever;elastin-like polypeptide;tag-free p35 protein;indirect ELISA

江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2023年第39卷第5期吳植等：非洲豬瘟病毒無(wú)標(biāo)簽p35蛋白的制備及間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染可引起家豬和野豬高熱和全身性出血，是一種高度接觸性傳染病，各種年齡家豬均易感，病死率可達(dá)100%[1]。非洲豬瘟病毒最早于1921年在肯尼亞發(fā)現(xiàn)，隨后蔓延至西歐、拉美等國(guó)家和地區(qū)[2]。2018年8月首次傳入中國(guó)，并迅速擴(kuò)散于國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)，給生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。

ASFV呈20面體對(duì)稱，其基因組為雙股DNA分子，全長(zhǎng)170～194 kb，編碼150～200個(gè)蛋白質(zhì)，大部分為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，目前仍有一半以上的蛋白質(zhì)功能尚不清楚[5-7]。除結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)外，病毒具有完整的酶系統(tǒng)[8]、編碼免疫逃逸相關(guān)的蛋白質(zhì)[9]、能夠吸附紅細(xì)胞 [10-11]、侵害單核-巨噬細(xì)胞[12]等特點(diǎn)，以上病原學(xué)特點(diǎn)和感染特性給非洲豬瘟（ASF）的疫苗研制帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)，至今尚無(wú)有效的疫苗問(wèn)世。ASF的防控以病原檢測(cè)和撲殺為主。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的傳播和流行，ASFV在中國(guó)發(fā)生了不同形式的變異，出現(xiàn)了自然弱毒株與強(qiáng)毒株同時(shí)存在的新情況，致使感染豬出現(xiàn)超長(zhǎng)潛伏期感染，給非洲豬瘟的精準(zhǔn)剔除或“拔牙”增加了困難。因此監(jiān)測(cè) ASFV感染抗體成為早期發(fā)現(xiàn) ASF 的重要手段之一。研究結(jié)果表明，由ASFV CP530R基因編碼的pp62蛋白具有較高的免疫原性[13]，感染豬后會(huì)產(chǎn)生較高水平的pp62抗體，通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)pp62抗體能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)感染豬的情況。多聚蛋白pp62在病毒顆粒成熟過(guò)程中，被S273R蛋白酶水解切割為p15和p35 2個(gè)主要蛋白質(zhì)[14]，p35的釋放是病毒顆粒成熟的重要標(biāo)志[15]。

類彈性蛋白多肽（Elastin-like polypeptide，ELP）是一種五肽聚合物，具有對(duì)溫度敏感、可逆相變特性，可作為純化標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)外源蛋白質(zhì)的純化[16]。本研究將p35蛋白與ELP融合表達(dá)，利用可逆相變特性獲得純化蛋白質(zhì)。為了減少假陽(yáng)性，用煙草蝕紋病毒蛋白酶（TEVP）切除ELP，獲得無(wú)標(biāo)簽可溶性p35蛋白，建立間接ELISA檢測(cè)方法，為ASFV病毒抗體精準(zhǔn)檢測(cè)提供了有效的技術(shù)手段。

1材料與方法

1.1材料

感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）與 PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，DNA質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自安諾倫（北京）生物科技有限公司，連接酶、限制性內(nèi)切酶和 DNA Marker均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白質(zhì)凝膠配制試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清購(gòu)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌（毒）種保藏中心，商品化抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自西班牙英吉納公司。原核表達(dá)載體pET-ELP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.2引物設(shè)計(jì)

參照pUC-pp62序列，設(shè)計(jì)上下游引物，上游引物序列（F）為：5′-AAGAAGGAGATATAGGTGAGCTCCGAAAACCTGTACTTCCAGGGTAACGACCCCCCCGTGCCCAA-3′，下游引物序列（R）為： 5′- GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAACCTTCTCCTCGGGGAT-3′。斜體處分別是Sac Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)序列，加粗處為T(mén)EVP酶切位點(diǎn)序列，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.3pELP-p35融合表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

以p35重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收p35基因片段。PCR擴(kuò)增體系為30 μl：p35重組質(zhì)粒1 μl，上下游引物各1 μl，2×PrimeSTAR Max Premix 15 μl，ddH₂O 12 μl。PCR反應(yīng)程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min。用Sac Ⅰ和Xho Ⅰ分別雙酶切pET-ELP與p35基因片段，4 ℃過(guò)夜連接回收產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化，提取陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.4ELP-p35融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與可逆相變循環(huán)（ITC）純化將pELP-p35轉(zhuǎn)化BL21（DE3），在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板（含50 μg/ml卡那霉素）上37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單克隆接種于5 ml LB培養(yǎng)基（50 μg/ml卡那霉素）中，37 ℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)活化；將重組菌液按體積比1∶100接種于200 ml 2×YT培養(yǎng)基（50 μg/ml卡那霉素）中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.6～0.8時(shí)，加入0.2 mmol/L 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），20 ℃ 180 r/min過(guò)夜誘導(dǎo)，同時(shí)設(shè)置對(duì)照；誘導(dǎo)結(jié)束后用超聲波破碎儀將菌液破碎10 min，直至液體清亮；將破碎后的菌液于4 ℃、8 000 r/min離心8 min，分別收集上清液、沉淀，沉淀用等量磷酸鹽緩沖液（PBS）懸浮，各取10 μl進(jìn)行SDS-PAGE電泳。在重組菌破碎離心的上清液中加入6 mol/L NaCl溶液，在22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃孵育10 min，12 000 g離心10 min，分別取沉淀制樣，進(jìn)行SDS-PAGE分析，根據(jù)蛋白質(zhì)條帶大小確定ITC最佳溫度；在重組菌上清液中分別加入不同濃度的氯化鈉溶液至終濃度為1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L和3.0 mol/L，28 ℃孵育10 min，28 ℃、12 000 g離心10 min，用300 μl TEVP反應(yīng)液重懸沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析，根據(jù)蛋白質(zhì)條帶含量大小確定可逆相變循環(huán)（ITC）純化的氯化鈉最佳濃度。

1.5無(wú)標(biāo)簽p35蛋白的制備與鑒定

純化ELP-p35融合蛋白的相變循環(huán)參照文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行，將重組菌裂解液與等量6 mol/L NaCl混勻，28 ℃孵育10 min，室溫下12 000 g離心5 min，沉淀用TEVP溶液重懸，4 ℃孵育30 min，4 ℃、12 000 g離心10 min，收集上清液，取上清液10 μl進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。標(biāo)簽ELP切割參考Li等[18]的方法進(jìn)行，蛋白酶用量為100 μg/ml，30 ℃孵育36 h；4 ℃、16 000 g離心10 min；與等量6 mol/L NaCl混合，28 ℃孵育10 min；室溫下14 000 g離心5 min，離心后的上清液用PBS（pH 7.2）透析2次，每次2 h，4 ℃、14 000 g離心10 min，收集上清液即為純化無(wú)標(biāo)簽重組p35蛋白。將切割回收的蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，封閉后加入體積比1∶200稀釋的ASFV抗體陽(yáng)性血清孵育2 h，用含有吐溫20（Tween-20）的Tris鹽緩沖液（TBST）洗滌4次，加入羊抗豬IgG二抗反應(yīng)45 min，TBST洗膜4次后，滴加超敏發(fā)光液并置于化學(xué)發(fā)光儀內(nèi)曝光。

1.6間接ELISA方法的建立

1.6.1抗原最適質(zhì)量濃度與血清最佳稀釋度的確定采用棋盤(pán)滴定方法，將不同質(zhì)量濃度（8.0 μg/ml、4.0 μg/ml、2.0 μg/ml、 1.0 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml）的p35包被到酶標(biāo)板中，每孔100 μl，4 ℃過(guò)夜；用 TBST洗滌4次，用5%脫脂牛奶封閉1 h；按照1∶100、1∶200、1∶400、1∶800稀釋倍比加入標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，每孔100 μl，37 ℃? 1 h，洗滌4次，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗豬IgG（1∶10 000），37 ℃孵育30 min后洗滌；加入四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色反應(yīng)10 min；用50 μl稀硫酸終止反應(yīng)，測(cè)定OD₄₅₀；以標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清OD₄₅₀接近1，陽(yáng)性血清OD₄₅₀與陰性血清OD₄₅₀的比值（P/N值）最大的孔蛋白質(zhì)包被質(zhì)量濃度和血清稀釋度作為最適包被質(zhì)量濃度和血清最佳稀釋度。

1.6.2其他反應(yīng)條件的優(yōu)化以優(yōu)化的最佳抗原包被質(zhì)量濃度和血清稀釋度，對(duì)包被液（去離子水、0.05 mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液、pH 7.2 PBS、0.05 mol/L pH 8.5 Tris-HCl緩沖液）、封閉液[5%卵清蛋白（OVA）、5%脫脂牛奶、5%牛血清白蛋白、1%明膠、1%海藻糖]、血清稀釋液（1%脫脂牛奶、3%脫脂牛奶、5%脫脂牛奶）、酶標(biāo)抗體稀釋度（1∶5 000、1∶7 000、1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000、1∶40 000）和底物顯色時(shí)間（5 min、10 min、15 min、20 min）等條件進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，測(cè)定OD₄₅₀，取其平均值。

1.6.3陰性與陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)臨界值的確定以優(yōu)化后的p35-ELISA檢測(cè)條件對(duì)已知143份陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算OD₄₅₀平均值（x—）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），當(dāng)OD₄₅₀大于等于x—＋3SD時(shí)判定為陽(yáng)性；小于x—＋3SD時(shí)判定為陰性。

1.6.4特異性試驗(yàn)按照最優(yōu)的檢測(cè)條件，對(duì)口蹄疫病毒（FMDV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）和偽狂犬病毒（PRV）等抗體陽(yáng)性血清進(jìn)行特異性檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)照，3次重復(fù)，測(cè)定OD₄₅₀，取平均值，判斷是否存在非特異性交叉反應(yīng)，判定特異性。

1.6.5重復(fù)性試驗(yàn)按照最優(yōu)的檢測(cè)條件，用相同批次及不同批次制備的無(wú)標(biāo)簽p53蛋白作為包被抗原檢測(cè)6份血清，其中陽(yáng)性血清5份，陰性血清1份，每個(gè)樣品重復(fù)3孔，測(cè)定OD₄₅₀，取其平均值，計(jì)算批內(nèi)試驗(yàn)和批間試驗(yàn)變異系數(shù)，分析重復(fù)性。

1.6.6敏感性試驗(yàn)在最優(yōu)條件下，將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行倍比稀釋800倍，并設(shè)置陰性對(duì)照，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定評(píng)價(jià)ELISA方法的靈敏度。

1.6.7臨床樣品的檢測(cè)應(yīng)用建立的p35間接ELISA抗體檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的103份臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與INGENASA公司ASFV抗體檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算符合率。

2結(jié)果與分析

2.1ASFV p35基因的擴(kuò)增

從模板擴(kuò)增特異性p35基因片段，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段的大小為915? bp，主要包含CP530R基因序列C端的478～1 383 bp、酶切位點(diǎn)序列、煙草蝕紋病毒蛋白酶（TEVP）酶切位點(diǎn)序列和保護(hù)性堿基等，與預(yù)期大小一致，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2融合表達(dá)載體的鑒定

將p35基因片段定向克隆至pET-ELP，構(gòu)建融合重組表達(dá)質(zhì)粒pET-ELP-p35，經(jīng)過(guò)Sac Ⅰ+Xho Ⅰ雙酶切后，獲得預(yù)期大小的2個(gè)片段，即951 bp和6 912 bp，表明重組質(zhì)粒pET-ELP-p35構(gòu)建正確，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3融合蛋白的表達(dá)與ITC純化

SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果（圖3）顯示，重組菌出現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量為80 000的蛋白質(zhì)條帶，與預(yù)期大小相符，且在上清液中獲得表達(dá)。ELP-p35融合蛋白ITC的最佳孵育溫度為28 ℃（圖4）。ITC純化的最佳NaCl濃度為4 mol/L（圖5）。

2.4無(wú)標(biāo)簽重組p30蛋白純化與免疫印跡鑒定

將煙草蝕紋病毒蛋白酶按一定比例加入純化的ELP-p35融合蛋白溶液中，在水浴鍋中30 ℃孵育切割ELP標(biāo)簽，12 000 r/min 離心10 min去除TEVP，在上清液中加入對(duì)應(yīng)體積的4 mol/L NaCl，28 ℃孵育10 min，12 000 r/min 離心10 min，將上清液透析至PBS（pH 7.2），SDS-PAGE分析結(jié)果（圖6）顯示，經(jīng)純化后獲得可溶性無(wú)標(biāo)簽p35重組蛋白。用非洲豬瘟抗體陽(yáng)性豬血清通過(guò)免疫印跡鑒定（Western Blot）檢測(cè)重組p35蛋白，結(jié)果顯示切割后的p35重組蛋白能被非洲豬瘟抗體特異性識(shí)別（圖7）。

2.5間接ELISA條件的確定

2.5.1重組蛋白質(zhì)包被質(zhì)量濃度和待檢樣品稀釋度的確定通過(guò)方陣滴定試驗(yàn)可知，當(dāng)無(wú)標(biāo)簽p35蛋白包被質(zhì)量濃度為2.00 μg/ml，待檢血清按1∶200稀釋時(shí)，此時(shí)P/N值（1.514/0.091）最大，且此時(shí)陽(yáng)性血清OD₄₅₀>1，所以確定2.00 μg/ml為最適包被質(zhì)量濃度，血清最適稀釋比例為1∶200（表1）。

2.5.2其他條件的優(yōu)化根據(jù)P/N值的大小確定包被液為0.05 mol/L、 pH 9.6碳酸鹽緩沖液，封閉液為5%脫脂牛奶，血清稀釋液為5%脫脂牛奶，二抗稀釋比例為1∶10 000，3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色時(shí)間為10 min。

2.5.3臨界值的確定在最優(yōu)化條件下，對(duì)已知的143份陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置已知的ASFV抗體陽(yáng)性樣品作為對(duì)照，陰性血清樣本OD₄₅₀的平均值（x—）為0.081，標(biāo)準(zhǔn)誤（SD）為0.03，則血清陰性和陽(yáng)性判定閾值OD₄₅₀為0.171，即待測(cè)血清OD₄₅₀＞0.171 為陽(yáng)性，待測(cè)血清OD₄₅₀≤0.171為陰性。

2.5.4批內(nèi)、批間重復(fù)試驗(yàn)批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，變異系數(shù)為0.348%～3.757%；批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，變異系數(shù)為0.320%～2.040%，變異系數(shù)均小于5.000%，表明建立的ELISA方法重復(fù)性良好。

2.5.5敏感性試驗(yàn)在最優(yōu)條件下，對(duì)倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行ELISA抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示，當(dāng)按1∶400稀釋時(shí)OD450＞0.171，說(shuō)明該方法有較好的靈敏度。

2.5.6特異性試驗(yàn)在優(yōu)化條件下，檢測(cè)CSFV、PRRSV、FMDV、PCV2和PRV的陽(yáng)性血清，結(jié)果（表3）顯示，建立的以p35為包被抗原的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明該方法特異性好。

2.5.7臨床樣品的檢測(cè)利用本研究建立的p35間接ELISA抗體檢測(cè)方法與商品化非洲豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒（ING）分別對(duì)103份臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果均為陰性（表4），與商品化試劑盒檢測(cè)結(jié)果相比，兩者的符合率為100%。

3討論

目前，非洲豬瘟仍然是危害中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病，造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前該病防控最主要的困擾是仍未有有效的疫苗，主要依靠檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和撲殺來(lái)綜合防控。當(dāng)前病原學(xué)檢測(cè)大多依靠普通PCR和熒光定量PCR方法，但當(dāng)前中國(guó)非洲豬瘟出現(xiàn)了新的流行特點(diǎn)，主要表現(xiàn)為由急性發(fā)病轉(zhuǎn)變?yōu)榫徛l(fā)病、出現(xiàn)隱性感染或耐過(guò)豬[19]和不定期排毒，這給病原的核酸檢測(cè)帶來(lái)了很大的不確定性。而豬可在感染后7～9 d產(chǎn)生抗體，血清學(xué)抗體檢測(cè)成為可靠的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)手段。研究結(jié)果表明，ASFV pp62蛋白具有強(qiáng)抗原性，在感染豬體內(nèi)相應(yīng)的抗體滴度較高，可作為抗原建立相應(yīng)的血清學(xué)檢測(cè)方法，用于ASFV的抗體檢測(cè)[20]。在病毒顆粒成熟的過(guò)程中，pp62被S273R蛋白酶水解切割為p15、p35，p15和p35蛋白存在于成熟病毒顆粒的內(nèi)膜，因此針對(duì)水解產(chǎn)物p15和p35蛋白開(kāi)展抗體檢測(cè)、監(jiān)測(cè)更能夠反映病毒感染的實(shí)際水平。本研究為了評(píng)估p35蛋白作為ELISA血清學(xué)診斷抗原的可行性，選用p35 作為包被抗原來(lái)建立ELISA檢測(cè)方法。

當(dāng)前研發(fā)的各種亞單位疫苗在中國(guó)大部分豬場(chǎng)被廣泛應(yīng)用，亞單位疫苗在研制過(guò)程中都會(huì)將抗原基因與純化標(biāo)簽融合表達(dá)，這樣豬群經(jīng)過(guò)多次免疫后，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗多聚組氨酸抗體。同時(shí)在ELISA抗體檢測(cè)方法建立的過(guò)程中，往往為了純化目的蛋白的方便，用于檢測(cè)包被的抗原大多數(shù)是與組氨酸的標(biāo)簽融合表達(dá)[21-23]。用這樣的檢測(cè)方法去開(kāi)展臨床豬群血清樣品的檢測(cè)，往往會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果。為了消除影響，本研究選用p35與ELP融合表達(dá)，并在ELP和p35蛋白之間插入了TEVP切割位點(diǎn)，利用ELP相變特性純化融合蛋白后，通過(guò)TEVP切割可獲得無(wú)標(biāo)簽的ASFV抗原。與于學(xué)祥等[24]制備的無(wú)標(biāo)簽ASFV p30蛋白相比，本研究不需要經(jīng)過(guò)包涵體的變復(fù)性和鎳柱親和層析純化等復(fù)雜步驟，利用ELP標(biāo)簽具有溫度敏感的可逆相變特性，通過(guò)升溫、降溫、離心和洗滌等步驟即可獲得抗原蛋白，純化過(guò)程不僅簡(jiǎn)單，而且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，最后得到了純度較高的無(wú)標(biāo)簽p35蛋白，為使用該蛋白質(zhì)作為包被抗原建立ELISA檢測(cè)方法奠定了良好的基礎(chǔ)。

本研究參考ASFV SY18毒株（GenBank：MH713612.1）的p35基因，該毒株是中國(guó)的流行毒株，在此基礎(chǔ)上建立的ELISA抗體檢測(cè)方法更具有針對(duì)性。建立的間接ELISA抗體檢測(cè)方法對(duì)FMDV、PCV2、PRRSV、CSFV和PRV均無(wú)交叉反應(yīng)，可檢測(cè)稀釋400倍的陽(yáng)性血清，組間重復(fù)試驗(yàn)和組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于5.000%，該檢測(cè)方法具有特異性好、敏感性高和重復(fù)性好的特點(diǎn)，且與非洲豬瘟商品化抗體檢測(cè)進(jìn)口試劑盒（ING）檢測(cè)結(jié)果的符合率高達(dá)100%。

本研究成功制備了無(wú)標(biāo)簽p35重組蛋白，并以此建立了ASFV抗體ELISA檢測(cè)方法，為非洲豬瘟的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)提供了更精準(zhǔn)的技術(shù)工具。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）