慢加急性肝衰竭病人免疫功能障礙的機制研究進展

李奕東，劉甜，姚佳，杜旭芳

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是指各種急性損傷因素作用下，肝功能相對穩(wěn)定的慢性肝病病人迅速惡化的肝衰竭綜合征［1］。常見的急性誘因包括乙醇、藥物、病毒性或細菌感染等。多種因素刺激下先天免疫系統(tǒng)激活引發(fā)炎癥細胞因子級聯(lián)反應，誘發(fā)過度炎癥反應，機體處于全身炎癥反應綜合征（SIRS）狀態(tài)。隨著病情發(fā)展，這種高炎癥狀態(tài)最終破壞了宿主免疫細胞的防御機制導致免疫麻痹，使ACLF病人更容易出現(xiàn)繼發(fā)感染。繼發(fā)感染是ACLF病人出現(xiàn)器官功能衰竭和高死亡率的主要原因［2］。因此，深入了解肝衰竭病人免疫功能障礙的發(fā)生發(fā)展機制，可為ACLF防治提供新的理論基礎和依據(jù)。本研究通過臨床和基礎研究從先天性免疫和獲得性免疫兩個方面闡述ACLF免疫障礙機制、監(jiān)測評估以及免疫增強的藥物治療，旨在更深入地認識ACLF的免疫功能障礙狀態(tài)及其臨床意義。

1 ACLF先天性免疫功能障礙

先天性免疫是感染后第一道防線，對各種入侵的病原微生物反應迅速。單核/巨噬細胞、樹突狀細胞（DC）、自然殺傷細胞（NK細胞）、自然殺傷T細胞（NKT細胞）都是其組成部分［3］。這些細胞殺傷、吞噬病原體，隨著疾病持續(xù)，促炎反應逐漸向抗炎反應傾斜，最終抗炎反應占主導地位，各種免疫細胞被消耗或處于功能耗竭狀態(tài)，其在數(shù)量、功能、表達狀態(tài)等方面均發(fā)生相應改變。

1.1 單核/巨噬細胞 Kuffer細胞是肝臟原居的巨噬細胞，ACLF發(fā)病初，細菌和病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMPs）從腸道中“溢出”，受損的肝細胞持續(xù)釋放損傷相關分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMPs），Kuffer細胞表面受體識別PAMPs和DAMPs而廣泛活化，啟動促炎反應，分泌促炎因子，介導肝損傷［3］。被激活的外周血單核細胞向肝臟組織聚集，同時骨髓來源的循環(huán)單核細胞被激活，產(chǎn)生的細胞因子及趨化因子釋放到體循環(huán)會引發(fā)SIRS。然而，長期暴露于抗原和炎癥信號中，單核/巨噬細胞防御機制被破壞，對抗原刺激反應不充分，抗菌功能受損，逐漸出現(xiàn)類似于膿毒癥的免疫麻痹現(xiàn)象［3］。

近年來，關于ACLF中單核/巨噬細胞免疫功能障礙的研究逐步增多。外周血單核細胞、Kuffer細胞、模式識別受體及其補體系統(tǒng)在數(shù)量上缺失，通過調節(jié)核因子κB，外周血中單核細胞表面人類白細胞DR位點抗原（human leukocyte antigen DR，HLADR）表達減少，先天免疫功能下降。然而，骨髓來源的單核抑制細胞數(shù)量不降反增［1］。反復Toll樣受體（TLR）-2和TLR-4刺激下，循環(huán)中具有免疫抑制作用的髓源單核抑制細胞（CD14+HLA-DR-Myeloid-derived suppressor cells， CD14+HLA-DR-M-MDSCs）數(shù)量增加［4］，其可抑制T細胞的增殖，損害先天性和適應性免疫，運用TLR-3激動劑可使M-MDSCs擴增并恢復先天免疫功能。

除了各種先天免疫細胞數(shù)量上的改變外，Kuffer細胞表型及分泌功能發(fā)生轉變，主要表現(xiàn)為具有抗炎特性的M2表型，釋放一些抗炎因子，如：白細胞介素（IL）-4、IL-10、IL-13、轉化生長因子β（TGF-β），發(fā)揮免疫抑制作用，IL-10的升高提示肝衰竭預后不良［5］。

此外，單核/巨噬細胞表面受體表達的改變，對獲得性免疫細胞的啟動及效應產(chǎn)生抑制作用。免疫抑制狀態(tài)下的單核/巨噬細胞表達CD163清道夫受體，抑制T細胞活化增殖，可溶性CD163具有類細胞因子功能，直接抑制輔助性T淋巴細胞，表現(xiàn)抗炎特性，表達水平越高預示預后越差［6］。另外，分泌性白細胞蛋白酶抑制劑介導外周血單核細胞膜上Mer受體酪氨酸激酶（Mer receptor tyrosine kinase，MERTK）表達增加，也是單核/巨噬細胞功能受損的一種重要機制，應用MERTK抑制劑可恢復促炎因子的產(chǎn)生，并可能恢復病人的先天免疫應答［7］，成為晚期ACLF病人免疫抑制狀態(tài)的潛在治療靶點，有待臨床進一步研究。

單核/巨噬細胞在轉錄代謝水平上也會受到影響。ACLF中分離的CD14+CD16-循環(huán)單核細胞的轉錄分析顯示，一系列免疫抑制參數(shù)上調，如：糖酵解途徑中的谷氨酰胺合成代謝（glutamine anabolism，GLUL），抗菌和抗原遞呈機制受損，單核細胞的吞噬反應和代謝過程均變得遲鈍。通過抑制GLUL，M2型單核/巨噬細胞可轉變?yōu)镸1表型，發(fā)揮促炎作用，抵抗機體免疫抑制［8］。因此，使用谷氨酰胺合成酶抑制劑對細胞進行代謝重組，可以部分恢復單核/巨噬細胞吞噬和促炎能力，改善病人免疫抑制狀態(tài)，為這些病人的靶向治療提供了新的選擇。

針對ACLF免疫抑制的治療，補充人體血清白蛋白也起到重要作用，低蛋白血癥病人機體免疫麻痹狀態(tài)嚴重，感染風險增高，提高人血白蛋白濃度可改善血漿前列腺素（prostaglandin，PG）E2介導的免疫抑制［9］。因此，免疫障礙下的ACLF病人可考慮應用。

1.2 DC DCs是主要的抗原呈遞細胞，主要存在于肝臟組織中，分為髓樣DC和漿性DC兩種。隨著疾病持續(xù)，循環(huán)中DCs大量凋亡致數(shù)量減少，其細胞表面程序性細胞死亡蛋白-1配體表達增加，同時產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IL-12的能力受損［10］，DC的這種功能損傷可能介導宿主特異性T細胞免疫應答抑制。上述研究主要以循環(huán)DCs為主要研究對象，對肝臟DCs的組成及功能研究較少。然而，有人發(fā)現(xiàn)乙肝相關ACLF病人肝臟組織中，髓樣DC和漿性DC大量積累并被激活，分泌IL-10、TGF-β水平上升，同時伴隨調節(jié)性T細胞（Treg細胞）數(shù)增多，起到局灶免疫抑制作用［11］。粒細胞刺激因子通過動員DC和T淋巴細胞進入肝臟， 減輕γ干擾素誘導的肝損傷，以此恢復ACLF病人的免疫功能障礙。

1.3 NK/NKT細胞 NK/NKT細胞是一種具有免疫調節(jié)特性和細胞毒性的免疫細胞，與自身免疫性疾病、肝炎和纖維化等多種肝病的肝損害有關［12］。其中NKT是一種特殊的T細胞亞群，細胞表面同時具有T細胞受體（TCR）和NK細胞受體。NK/NKT二者在ACLF的發(fā)病機制中也起著關鍵作用。Liu等［13］針對ACLF、慢性乙型肝炎（CHB）及健康者外周血NK細胞數(shù)量進行相關研究，發(fā)現(xiàn)ACLF（16.64±12.32）和CHB（19.16±9.65）病人外周血NK細胞數(shù)量百分比較健康個體（21.35±8.81）降低。有人還發(fā)現(xiàn)相比健康對照組，肝衰竭病人脾臟（4.32%比5.72%，1.68×105比6.01×105）和骨髓中（0.74%比2.27%，7.40×104比5.68×104）的NK細胞比例和數(shù)量也明顯減少［14］。另一方面，ACLF病人中，具有細胞毒性CD56dimCD16brightNK細胞減少，而CD56dimCD16-、CD56brightCD16-NK細胞增加，NK細胞毒亞群的變化也會導致細胞毒性功能的降低，殺傷作用減弱［13］。NK/NKT在分泌功能上也受到了影響，體內(nèi)高水平的抑炎因子IL-10抑制NK/NKT細胞分泌γ干擾素和TNF-α的產(chǎn)生［13，15］。同時NK細胞上表達多種激活性和抑制性受體，具體表現(xiàn)為NKG2D分子、NK細胞蛋白（NKp）30、NKp44、NKp46激活受體升高，CD158a抑制受體增加，而CD158b抑制受體減少［13］。而NKT細胞表面高表達T細胞免疫球蛋白黏蛋白3（TIM3）免疫抑制受體［16］。以上描述證明NK/NKT細胞受體的異常表達與ACLF病人先天免疫反應受損存在關聯(lián)。不僅如此，抑制NK細胞中鉀離子通道相關基因的表達，封鎖鈉離子和鉀離子通道抑制T細胞激活，削弱NK細胞活化［12，17］?？傊?，NK/NKT細胞數(shù)量的減少、細胞毒亞群、表面受體的改變以及相關細胞因子產(chǎn)生減少、相關基因改變可能都會導致細胞毒功能下降，削弱機體對感染的免疫反應，誘導免疫麻痹，導致病情進一步惡化［13］。

2 獲得性免疫

肝衰竭的發(fā)病過程中免疫介導的肝損傷起主要作用，而T淋巴細胞在清除病毒和壞死肝細胞中起到重要作用。免疫應答異常和免疫失衡是ACLF的重要發(fā)病機制之一。隨著ACLF進展，獲得性免疫功能受損，T細胞功能障礙，T細胞逐漸耗盡，進入一種“衰竭”狀態(tài)，具體表現(xiàn)為外周血T細胞數(shù)量減少、細胞活性降低、增殖分泌功能障礙、T淋巴細胞反應性降低或無反應性［18］。

2.1 CD8+T淋巴細胞 在數(shù)量上，ACLF病人中外周血CD8+T淋巴細胞呈進行性下降，尤其是活化的外周血CD8+T淋巴細胞數(shù)量明顯降低［19］。此外，Wang等［20］針對外周血T淋巴細胞百分比與終末期肝病模型（model for end-stage liver disease， MELD）評分之間關系進行了疾病嚴重程度及預后分析，研究顯示ACLF病人外周血T淋巴細胞比例明顯低于健康對照組，提示病人機體此時處于免疫衰竭狀態(tài)。同時MELD評分與外周血T淋巴細胞百分比存在明顯負性相關，治療前狀態(tài)下，淋巴細胞百分比越低，MELD評分越高。經(jīng)4周綜合治療后，T淋巴細胞數(shù)量減少趨勢較慢，疾病進展緩慢，預后較好。因此，針對外周血T淋巴細胞的免疫治療也可能為解除ACLF免疫抑制提供可能性。

CD8+T淋巴細胞表面標志物表達改變也是肝衰竭免疫抑制狀態(tài)的一種特征性表現(xiàn)。ACLF病人中，活性降低的CD8+T淋巴細胞其表面激活標志物（CD69、CD38和穿孔素）表達下降［21］。而在ACLF病人免疫抑制狀態(tài)下，CD8+T細胞上的共刺激［如CD40L，誘導性共刺激分子（ICOS），OX40，CD69，CD38，CD95，糖皮質類固醇誘導的腫瘤壞死因子受體（GITR），TIM-1］和抑制性免疫檢查點（如PD1，KLRG1，PDPN，PROCR，TIM3，CTLA4，TIGIT）均表達上調［1］。除此之外，NKG2A也是表達于NK細胞和CD8+T淋巴細胞的抑制性受體，在維持這些免疫細胞的功能和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的免疫負調節(jié)作用，ACLF病人中，CD8+T細胞上NKG2A表達上調，同時NK細胞上激活性受體NKG2D表達下調， 兩種受體之間的失衡可能加速乙型肝炎病毒（HBV）相關ACLF的進展［22］，促進免疫功能障礙。胸腺細胞選擇相關高遷移率群盒蛋白通過上調各種抑制受體的表達，誘導CD8+T細胞衰竭和功能失調表型引起免疫功能麻痹［23］。

在功能上，ACLF病人CD8+T淋巴細胞受刺激后的分泌能力明顯下降，表現(xiàn)為無法有效產(chǎn)生IL-2，IL-6，IL-8和γ干擾素和TNF-α等促炎性細胞因子［5］。除此之外，其抑炎因子產(chǎn)生增多，如IL-35，IL-10［3］。其中IL-10是一種信號轉導及轉錄活化因子3（STAT-3）誘導細胞因子，可減弱T細胞活化，阻斷IL-10產(chǎn)生可以預防并逆轉T細胞耗竭［5］。近兩年新發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子IL-35，既可抑制抗原非特異性細胞毒性CD8+T細胞的活性，又可抑制細胞因子介導的靶細胞死亡。IL-35刺激下，ACLF病人外周血CD8+T細胞呈現(xiàn)出耗竭表型，表現(xiàn)為程序性死亡受體-1（programmed cell death protein 1，PD-1）、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白-4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）、淋巴細胞活化基因-3上調，穿孔素、顆粒酶B、Fas配體下調，抑制細胞毒性和腫瘤壞死因子-γ的產(chǎn)生。因此，IL-35可能是改善ACLF免疫抑制治療靶點之一［24］，有待進一步研究。

另外，除了細胞因子參與CD8+T細胞耗竭調控外，其他可溶性介質也參與其中。前列腺素E受體2（prostaglandin E receptor 2，EP2）是一種免疫平衡調節(jié)分子。有學者發(fā)現(xiàn)，PGE2具有免疫抑制作用，ACLF病人CD8+T細胞表面EP2表達降低，PGE2水平顯著升高［9］，使機體處于免疫低反應狀態(tài)，與繼發(fā)感染易感性相關［25］。不僅如此，EP2也在先天免疫反應中發(fā)揮抑制作用，EP2選擇性激動劑可減少外周血單個核細胞中促炎細胞因子產(chǎn)生。因此，PGE2及EP2的改變可抑制ACLF病人先天性和適應性免疫細胞對LPS或大腸桿菌的過度炎癥反應［9］。輸注白蛋白治療后，將人血白蛋白水平升高至30 g/L以上，通過結合和滅活PGE2逆轉了免疫功能障礙［26］。EP2可能成為治療ACLF免疫抑制的新潛在靶標。

以上，從細胞計數(shù)、分泌功能、表面標志物表達情況及血清中其他可溶性介質含量等方面綜述了免疫失調過程中CD8+T淋巴細胞免疫狀態(tài)，提示CD8+T淋巴細胞參與了ACLF的免疫抑制過程。

2.2 CD4+T淋巴細胞（調節(jié)性T淋巴細胞、輔助性T淋巴細胞） Treg和輔助性T淋巴細胞17（helper T cell 17，Th17）具有共同的起源，都來源于初始T細胞。IL-6可以決定初始T淋巴細胞分化途徑的方向，當IL-6不存在時分化趨向具有免疫抑制作用的Treg子集；在IL-6存在的情況下分化趨向介導炎性反應的Th17子集，兩種細胞作用相反，在分化過程中存在一定的競爭關系并處于動態(tài)平衡中［27］。肝衰竭進展晚期，Th17細胞數(shù)量降低，促炎細胞因子減少，促炎功能減弱，同時發(fā)揮免疫抑制作用的Treg細胞數(shù)量上升明顯［27］。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制劑作為負調控因子可抑制IL-6/STAT3信號通路［28］，在ACLF過程中表達上調，促進CD4+CD2 5+Treg的增殖，抑制Th17的增長，這說明了Th17細胞與CD4+CD25+Treg細胞之間存在免疫失衡，二者動態(tài)變化共同介導肝衰竭免疫麻痹［29］。通過恢復Th17/Treg免疫平衡，可以阻止本病的進展［27］。

除了數(shù)量上的變化，Treg細胞還可通過表面標志物改變以及分泌功能障礙來發(fā)揮免疫抑制作用。細胞高表達CTLA-4和PD-1，通過傳遞抑制信號而抑制效應T細胞的活化［30］，還可抑制DC活化以及影響細胞因子分泌，如IL-10產(chǎn)生增多。表達不同的表面分子的Treg細胞亞群，其作用也不盡相同。研究發(fā)現(xiàn)，CTLA-4、HLA-DR、CD45RO、Ki-67等表面標志物在CD39+FoxP3+Treg細胞的表達明顯高于CD39-FoxP3+Treg，表達CD39+的Treg細胞抑制細胞增殖功能明顯增強，且能明顯抑制外周血單個核細胞γ干擾素的分泌，介導肝衰竭免疫麻痹［29］。

2.3 黏膜相關恒定T 細胞（MAIT） MAIT是對細菌產(chǎn)生免疫應答的豐富T細胞亞群，其特征是含有不變TCR鏈，表現(xiàn)為天然殺傷細胞標志物CD161的高表達。在肝功能衰竭的中晚期，可能由于長期的慢性進程，循環(huán)中MAIT細胞逐漸衰竭，數(shù)量減少，機體免疫反應功能失調，進入免疫抑制狀態(tài)。病毒持續(xù)存在，病情加重，機會性感染的風險增加都是可能造成的嚴重后果。經(jīng)治療后，肝衰竭改善狀態(tài)下，循環(huán)MAIT細胞的數(shù)量可部分恢復，表明循環(huán)MAIT細胞是預測HBV相關肝衰竭預后的主要標志物，死亡病人的MAIT細胞較存活病人明顯減少，且MAIT細胞的數(shù)量越高，病人存活率越高。因此，恢復MAIT細胞數(shù)量可能成為治療肝衰竭免疫抑制的良好手段［31］。

3 總結

總之，晚期ACLF病人體內(nèi)存在嚴重的免疫問題，代償性抗炎反應缺陷，固有和適應性免疫衰竭和失調，隨之而來的功能性免疫癱瘓，多種免疫細胞在數(shù)量、增殖活性以及分泌能力上都受到了影響。然而，嚴重的免疫紊亂在ACLF獨特的發(fā)病機制中起著關鍵作用，可導致器官衰竭、更高的感染風險和ACLF進一步進展。因此，防止這些免疫紊亂的發(fā)展是ACLF新的治療策略。