高效液相色譜法檢測(cè)微擬球藻中磷脂類化合物含量

劉耘琿，周真真，陳 林，張俊杰，叢 威

（1.江蘇海洋大學(xué)，江蘇 連云港 222000；2.中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所，北京 100089；3.中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所，山東 青島 266101）

微擬球藻（Nannochloropsis sp.）是一種高附加值光合藻類微生物，能夠通過(guò)光合作用合成脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、葉綠素和類胡蘿卜素等高價(jià)值產(chǎn)物[1]。該藻種總脂含量可達(dá)干重的30%~50%[2-5]，其中磷脂的含量可達(dá)30%[6]，同時(shí)還富含大量的ω-3 系列的多不飽和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA），具有預(yù)防心血管疾病等功能[7-9]，相比傳統(tǒng)油料作物中提取的磷脂，微擬球藻所提取的磷脂具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此，深入研究微擬球藻中磷脂的組成，對(duì)于后期磷脂產(chǎn)品的開發(fā)和利用具有重要意義。

目前，磷脂檢測(cè)主要采用高效液相色譜法，這種方法具有便捷高效且準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)[10-17]。由于磷脂是一種親水性物質(zhì)，因此使用HILIC 反相分離模式的ZORBAX RX-SIL 色譜柱能夠有效地分離微擬球藻磷脂的各個(gè)組分。微擬球藻磷脂含有長(zhǎng)鏈、高度不飽和的脂肪酸基團(tuán)，并且含有較高的細(xì)胞色素、蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)。采用大豆或雞蛋等傳統(tǒng)的磷脂檢測(cè)方法可能會(huì)影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。因此，針對(duì)微擬球藻磷脂體系，建立高效液相色譜分析方法具有重要意義。

本研究使用ZORBAX RX-SIL 色譜柱和紫外檢測(cè)器對(duì)磷脂組分進(jìn)行分離檢測(cè)，考察了不同的流動(dòng)相對(duì)磷脂的檢測(cè)效果，以期建立高效且準(zhǔn)確的微擬球藻磷脂檢測(cè)方法，對(duì)微藻源磷脂的檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微擬球藻（山東煙臺(tái)海融生物技術(shù)有限公司）；乙腈（色譜純，美國(guó)Sigma 公司）；甲醇（色譜純，美國(guó)Sigma 公司）；磷脂酰肌醇（PI，批號(hào)H2219476，純度大于99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷脂酰乙醇胺（PE，批號(hào)E2113225，純度大于99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷脂酰膽堿（PC，批號(hào)D2101126，純度大于98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；溶血磷脂酰膽堿（LPC，純度大于99%，批次C2212077，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；硅膠固相萃取柱（Waters Sep-PakTM 6cc 500 mg）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200 Ⅱ高效液相色譜儀帶紫外檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）；FA2004 電子分析天平（上海精科儀器有限公司）；NK200-1B 氮吹儀（杭州米歐儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；TGL-16C 冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

分別精密稱取磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品25 mg 置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容至25 mL，此時(shí)配制的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿的濃度均為1 mg/mL。分別取上述4 種標(biāo)準(zhǔn)品1 mL 配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液的配制

精密吸取上述磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋，分別配制濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 微擬球藻磷脂樣品的制備

微擬球藻藻粉經(jīng)膨化后得到微擬球藻膨化顆粒，首先取100 g 膨化后的藻粉，加入300 mL 95%乙醇，放置于磁力攪拌器上，在60 ℃的條件下500 r/min 提取1 h，然后離心樣品收集上清液；再向膨化藻粉沉淀中加入100 mL 95%乙醇，重復(fù)上述提取過(guò)程2 次，合并上清液。最后使用0.22 μm 有機(jī)系過(guò)濾器過(guò)濾，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中去除溶劑，得到微擬球藻油脂。

稱取約50 mg 上述油脂樣品，溶于1 mL 氯仿準(zhǔn)備上樣。取硅膠小柱，先用10 mL 甲醇活化，再加入30 mL 氯仿平衡，然后將油脂樣品上樣。經(jīng)過(guò)25 mL 氯仿、20 mL 丙酮和15 mL 甲醇先后洗脫，分別獲得中性脂、糖脂和磷脂組分，收集磷脂組分，利用氮吹儀除去磷脂組分中的溶劑，并烘干至恒重[18]。最后精密稱取10 mg微擬球藻磷脂，用甲醇溶解并定容至10 mL 容量瓶中，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，置于冰箱-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 儀器參考條件

色譜柱為ZORBAX RX-SIL 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm；流動(dòng)相為甲醇、甲醇-乙腈溶液（50∶50，V∶V）和甲醇-水溶液（87∶13，V∶V），等度洗脫；流速為1 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取4 種磷脂混合標(biāo)品重復(fù)進(jìn)樣3 次，分別測(cè)得峰面積并計(jì)算RSD 值，檢測(cè)儀器的精密度。

1.3.6 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取已制備好的已知濃度的微擬球藻磷脂樣品溶液，向其中加入已知質(zhì)量的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品，制成低、中、高3 種濃度加標(biāo)回收樣品，分別進(jìn)樣平行測(cè)定3 次，計(jì)算磷脂的加標(biāo)回收率。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

采用色譜處理軟件，根據(jù)色譜圖中樣品的保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間比對(duì)進(jìn)行定性分析，根據(jù)各磷脂的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的磷脂進(jìn)行定量分析。用Microsoft Excel 2016、Origin 9.8 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

考察甲醇、甲醇-乙腈溶液、甲醇-水溶液作為流動(dòng)相對(duì)微擬球藻磷脂樣品中4 種目標(biāo)物質(zhì)的影響。由圖1可知，當(dāng)采用甲醇-乙腈溶液（50∶50，V∶V）作為流動(dòng)相時(shí)，2~3 min 處的峰無(wú)法較好地分離，且目標(biāo)物的保留時(shí)間加長(zhǎng)，峰形較差；當(dāng)采用甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，2~3 min處的峰無(wú)法較好地分離，并且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，需要15 min；當(dāng)采用甲醇-水溶液（90∶10，V∶V）作為流動(dòng)相時(shí)，基線平穩(wěn)，目標(biāo)峰形較好，且檢測(cè)時(shí)間縮短至8 min 以內(nèi)。因此，選用甲醇-水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖1 微擬球藻磷脂樣品在不同流動(dòng)相下的液相色譜圖

2.1.2 流動(dòng)相比例的選擇

考察流動(dòng)相為甲醇-水溶液時(shí)水的比例分別為5%、10%、13%、15%、20%時(shí)對(duì)微擬球藻磷脂樣品中4種目標(biāo)物質(zhì)的影響，結(jié)果如圖2 所示。隨著水的比例增加，樣品中目標(biāo)物的保留時(shí)間縮短。當(dāng)水的比例較低時(shí)，2 min 處的PI 無(wú)法有效分離；當(dāng)水的比例過(guò)高時(shí)目標(biāo)物的峰會(huì)發(fā)生重疊。因此，選擇水的比例為13%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 微擬球藻磷脂樣品在不同甲醇-水比例下的液相色譜圖

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性關(guān)系、檢出限與定量限

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液進(jìn)樣測(cè)定，以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程見表1，4 種組分在0.1~1 mg/mL 的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.996 8；分析方法的定量限和檢出限由信噪比（S/N）計(jì)算，檢出限定義為S/N=3 時(shí)對(duì)應(yīng)的分析物濃度，定量限定義為S/N=10 時(shí)對(duì)應(yīng)的分析物濃度，分別計(jì)算4 種組分的檢出限和定量限。

表1 各磷脂組分的線性方程、范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.2.2 精密度

精密度結(jié)果見表2，結(jié)果顯示4 種磷脂標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于0.48%，重現(xiàn)性良好。

表2 磷脂標(biāo)準(zhǔn)品精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 回收率

回收率結(jié)果見表3，在不同添加水平下，4 種磷脂標(biāo)準(zhǔn)品的回收率在85%~105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于3.1%，有較好的準(zhǔn)確度。

表3 磷脂標(biāo)準(zhǔn)品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 樣品檢測(cè)

按照1.3 中的方法對(duì)微擬球藻磷脂樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)峰面積代入線性回歸方程中計(jì)算磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿的含量，結(jié)果見表4。計(jì)算結(jié)果為磷脂酰肌醇含量為19.32%，磷脂酰乙醇胺含量為18.74%，磷脂酰膽堿含量為11.86%，溶血磷脂酰膽堿含量為3.24%。

表4 微擬球藻磷脂中PI、PE、PC 和LPC 含量

3 結(jié)論

在研究制定高效液相色譜方法時(shí)，流動(dòng)相的選擇是影響分離效果的關(guān)鍵因素之一[19]。為了分析微擬球藻磷脂類化合物的組成，本研究建立了一種以甲醇-水（87∶13，V∶V）為流動(dòng)相，采用ZORBAX RX-SIL 色譜柱和紫外檢測(cè)器的反相高效液相色譜法。結(jié)果表明，微擬球藻中最主要的4 種磷脂類化合物磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿含量分別為19.32%、18.74%、11.86%和3.24%。經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，該檢測(cè)方法的加標(biāo)回收率在85%~105%之間，靈敏度較高，檢測(cè)時(shí)間較短，分離度較好，且具有良好的穩(wěn)定性，適用于微藻磷脂的測(cè)定。