4 ℃丙酮液固定劑對腎穿刺活檢組織免疫熒光染色的效果觀察

王偉力

腎臟疾病的治療方案與臨床精準診斷和分型有關(guān)，而臨床表現(xiàn)和實驗室檢查常無法做出明確診斷，需要依靠病理檢查作為“金標準”進行最終判定[1]。腎穿刺直接免疫熒光染色是腎臟疾病病理檢查的基本手段之一[2]。固定劑的選擇對免疫熒光染色效果會造成較大的影響[3]，若固定劑選擇不適宜，則會導致組織破壞及邊緣結(jié)構(gòu)不清晰，對免疫熒光染色產(chǎn)生很大影響，如假陽性率高及定位不準確，嚴重影響送檢標本的臨床病理診斷[4]。因此，充分固定和固定劑的選擇至關(guān)重要。為了更好地了解固定劑的選擇對直接免疫熒光染色效果的影響，本文比較和分析了三種不同固定劑對診斷為IgA腎病的腎臟穿刺組織的直接免疫熒光染色質(zhì)量，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2022 年1—12 月湖州市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科送檢以及外院送檢的112 例腎臟穿刺活檢組織標本，分別采用4%中性甲醛液固定劑（實驗組1）、丙酮液固定劑（實驗組2）及4 ℃丙酮液固定劑（實驗組3）固定，三種不同固定劑對同一腎穿刺組織進行固定處理并比較染色效果。其中將58例后期診斷為IgA 腎病的熒光染色效果納入統(tǒng)計。本研究經(jīng)湖州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學科研與臨床試驗倫理委員會審批通過。

1.2 方法 將新鮮腎穿刺標本置于玻片上，在顯微鏡下準確觀察，確定標本是否含有腎小球，將有腎小球的標本用0.9%氯化鈉注射液浸濕的紗布盛裝。免疫熒光直接法染色：將新鮮的腎穿刺組織置于凍頭，放入冷凍機，待標本冷凍后，將標本以4m 的厚度切取35 ～40 張，用免疫載玻片貼附后進行免疫熒光直接法染色。首先將冷凍切片各9 張放入實驗組1、實驗組2 和實驗組3 中，在暗室固定20 min，分別放入PBS 浸潤洗滌3 次，每次3 min，在切片背面用黑色記號筆圍繞組織劃圈，便于鏡檢時快速找到組織位置；擦除組織周圍的PBS 緩沖液，分別滴加兔抗人熒光素抗體IgA、C3（稀釋比均為1∶25）；將切片置于濕盒內(nèi)，置于25 ℃溫箱中避光孵育60 min；用PBS 浸潤洗滌3 次，每次5 min，甩干除去多余PBS緩沖液，用緩沖甘油封片，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照[5]。

1.3 免疫熒光標記評價標準 切片置于熒光顯微鏡下，由腎臟病理診斷醫(yī)師觀察腎小球IgA和C3 熒光附著部位及亮度（IgA 和C3 為IgA 腎病病理診斷的關(guān)鍵標志）。IgA 和C3 陽性部位應表達于腎小球系膜區(qū)和毛細血管壁，呈團塊狀或顆粒狀亮點沉積。強度為6 級：未見為（—），高倍鏡下隱約可見為（±），高倍鏡下可見為（＋），高倍鏡下清晰可見為（2 ＋），高倍鏡下耀眼為（3 ＋），高倍鏡下刺眼為（4 ＋）[6]。本研究將免疫熒光顯色強度（—）、（±）、（＋）歸為低表達組，將免疫熒光顯色強度（2 ＋）、（3 ＋）、（4 ＋）歸為高表達組，兩組進行比較。

1.4 統(tǒng)計方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料采用2檢驗，P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

在熒光顯微鏡下觀察，兩種抗原標記物在3 組實驗中的表達差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05），見表1。4 ℃丙酮液固定染色效果最好，IgA、C3 呈團塊狀沉積于腎小球系膜區(qū)，強度為（3 ＋），無背景著色；常溫丙酮固定液染色效果較好，IgA、C3 沉積于腎小球系膜區(qū)，強度為（＋～2 ＋），無背景著色；4%中性甲醛固定液的組織效果較差，IgA、C3 在腎小球的沉積結(jié)果為（±～＋），見圖1 ～2。

圖1 IgA 在腎小球的沉積情況（免疫熒光染色，×400）

圖2 C3 在腎小球的沉積情況（免疫熒光染色，×400）

表1 兩種抗原標記物在3 組中的表達情況（ =58） 例（%）

3 討論

臨床上腎小球腎炎根據(jù)腎組織病變范圍及腎小球病變情況分類繁多，其病因及發(fā)病機制復雜。目前，腎臟病理檢查結(jié)果已成為腎臟疾病診斷的權(quán)威標準，是制定腎臟疾病治療方案和評估預后的重要依據(jù)[7]，而腎穿刺標本免疫熒光制片質(zhì)量直接影響腎臟病理醫(yī)師診斷結(jié)果的準確性。

新鮮腎臟穿刺活檢組織冷凍切片后進行免疫熒光染色，其特異性強、敏感性高、操作步驟簡單、定位準確及強度易于判斷，通過熒光染色可判斷有無免疫復合物沉積、沉積形態(tài)、部位及強度等[8]。免疫熒光染色的腎穿標本固定是為了保持組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，防止變形或破裂，且有利于保存細胞的抗原，提高免疫熒光檢測的效率[9]。如果固定劑選擇不適宜，就會導致組織破壞及結(jié)構(gòu)不清晰，對隨后的熒光染色產(chǎn)生極大影響，可導致假陽性率高及定位不準確，甚至導致誤診，延誤患者病情，因此免疫熒光染色標本的固定應選擇并優(yōu)化適宜的固定劑[10]。目前很多醫(yī)院的腎穿刺活檢行免疫熒光檢查所使用的固定劑首選以常溫丙酮液為主[11]。本科室開始也采用常溫丙酮液，發(fā)現(xiàn)有些標本容易出現(xiàn)假陰性，與臨床診斷不符，故努力探索最佳固定方法，從而提高腎穿刺活檢免疫熒光檢查的準確性。

本研究對112 例腎臟穿刺活檢組織標本的3 種固定劑固定效果進行比較，將58 例后期診斷為IgA腎病的熒光染色效果納入統(tǒng)計。筆者經(jīng)過反復實驗后發(fā)現(xiàn)，4%的中性甲醛液為非沉淀性固定液，容易產(chǎn)生甲醛色素，使蛋白質(zhì)苯環(huán)結(jié)構(gòu)上的抗原決定簇改變，進而降低抗原敏感性[11]，并且其缺乏脫水能力，導致沉淀物不易聚集成團，組織浸于4%的中性甲醛液中容易造成細胞腫脹、胞核不清及結(jié)構(gòu)模糊等[12]。而常溫丙酮液雖然與4 ℃丙酮液均具有保存酶的作用，二者的主要作用都可促進蛋白質(zhì)和糖沉淀，對組織滲透力強，一般應用于組織化學的酶固定。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)4 ℃丙酮液固定后的腎穿刺組織免疫熒光染色效果相對較佳，其機制是由于丙酮液在4 ℃預冷的狀態(tài)下，固定液對組織的酶滲透性更強，可以更好地固定酶，提酶效果更好，更有利于保存抗原的免疫活性，進而更有利于免疫熒光顯色，提高陽性檢測率。

綜上所述，采用4 ℃丙酮液固定的冰凍切片，對于腎病活檢組織直接免疫熒光染色診斷準確率較高，在腎臟疾病的病理學檢查中具有較高的推廣和使用價值。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突