SHIP2、EGFL7 表達與肺癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系

陳慧芬，謝艷萍，梁亦賢，朱文娟

肺癌發(fā)病率及死亡率均居于惡性腫瘤前列[1]，其早期癥狀不明顯，待患者出現(xiàn)咳嗽、胸痛及氣短等癥狀而就診時，大多已進入中晚期，盡管目前肺癌的治療已取得顯著進步，但預(yù)后仍較差，尤其是腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，嚴重影響患者的生存時間及生存質(zhì)量[2-3]。因此，探尋可用于評估肺癌預(yù)后的生物標(biāo)志物，已成為科研工作者的研究熱點。有研究證實，含SH2 結(jié)構(gòu)域的Ⅱ型肌醇5’-磷酸酶（SHIP2）蛋白參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程[4]。類表皮生長因子域7（EGFL7）屬于血管內(nèi)皮表達基因，呈明顯特異性，該基因與惡性腦膜瘤發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[5]。但目前臨床上關(guān)于SHIP2、EGFL7 表達與肺癌預(yù)后關(guān)聯(lián)性的研究尚不多見，本研究通過回顧性收集肺癌患者的病歷資料，以探討組織SHIP2、EGFL7 表達與肺癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集2019 年1—12 月湖州市第一人民醫(yī)院收治的76 例肺癌患者的臨床及隨訪資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《肺癌臨床診療指南（2018 版）》[6]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理學(xué)確診；（2）年齡≥18 歲；（3）無認知障礙及精神類疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有嚴重感染、全身免疫系統(tǒng)疾病及其他惡性腫瘤；（2）妊娠期或哺乳期女性；（3）臨床資料缺失。本研究經(jīng)湖州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研與臨床試驗倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 使用免疫組織化學(xué)SP（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶）法檢測SHIP2、EGFL7 蛋白表達。收集入組患者經(jīng)手術(shù)切除的癌組織及癌旁組織標(biāo)本，癌旁組織為超過肺癌組織邊緣5 cm的無癌組織。SHIP2 蛋白表達：將切下組織予以石蠟包埋，4m 厚連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化及蘇木精染色處理。先使用3%H2O2溶液清除內(nèi)源性過氧化物，予以檸檬酸修復(fù)液在高溫高壓狀態(tài)下進行抗原修復(fù)，待冷卻后使用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3 次，每次漂洗時間為3 min，隨后加入一抗兔抗人SHIP2 單克隆抗體，在4 ℃環(huán)境中孵育過夜。待使用PBS漂洗后，使用3，3’二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，封片。陰性對照組使用PBS 代替一抗進行處理。EGFL7 蛋白表達：以石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，3%過氧化氫孵育處理后，使用磷酸鹽緩沖液（PBS）進行洗滌以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；使用微波進行抗原修復(fù)，并分別加入正常羊血清和過氧化物酶溶液，待孵育后將一抗（兔抗人EGFL7 多克隆抗體）加入在4 ℃環(huán)境中進行孵育過夜，再加入生物素標(biāo)記二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素鏈霉菌抗生物素溶液，最后使用DAB 染色，蘇木素復(fù)染，脫水及封片處理。陰性對照組使用PBS 代替一抗進行處理。最后在顯微鏡下觀察。

1.2.2 結(jié)果判定 免疫結(jié)果判定由病理科兩位高年資醫(yī)師獨立完成。以細胞膜或細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色染色，判定為SHIP2、EGFL7 蛋白表達陽性。每個切片隨機選擇5 個視野，由病理醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下進行觀察。根據(jù)二次積分法進行計分，將細胞染色強度與陽性細胞所占比例乘積作為評分，其中陽性細胞染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)如下：若未見染色則計為0分，淺黃色計為1 分，淺棕色計為2 分，深棕色計為3 分；陽性細胞所占比例評分具體如下：若＜5%則計為0分，5%～25%計為1 分，26%～50%計為2 分，51%～75%計為3 分，若＞75%則計為4 分。將上述兩項分數(shù)的乘積作為總評分，若總評分＜3 分，則判定為低表達（陰性）；若總評分≥3分，則判定為高表達（陽性）。

1.3 隨訪 隨訪時間為3 年，包括電話隨訪及門診復(fù)診，收集患者臨床資料，截止時間為2022 年12 月，統(tǒng)計所有入組患者的3 年生存率。

1.4 統(tǒng)計方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗；采用多變量Cox 回歸分析影響肺癌預(yù)后的影響因素。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織及癌旁組織SHIP2、EGFL7 蛋白表達比較 肺癌組織中SHIP2、EGFL7 蛋白高表達率均高于癌旁組織（均P ＜0.05），見表1。

表1 肺癌組織及癌旁組織SHIP2、EGFL7 表達情況比較例（%）

2.2 SHIP2、EGFL7 表達與肺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 SHIP2、EGFL7 高表達與低表達組性別、年齡、腫瘤大小、病理類型及分化程度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05），但兩組TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05），見表2。

表2 SHIP2、EGFL7 表達與肺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系例

2.3 預(yù)后情況 肺癌患者3 年生存率為46.05%（35/76），其中SHIP2 高表達組3 年生存率為32.65%（16/49），低表達組為70.37%（19/27），SHIP2 高、低表達組3 年生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（=9.968，P＜0.05）；EGFL7 高表達組3 年生存率為36.17 %（17/47），低表達組為62.07%（18/29），EGFL7 高、低表達組3 年生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（=4.842，P＜0.05），見圖1 ～2。

圖1 SHIP2 表達組生存曲線

圖2 EGFL7 表達組生存曲線

2.4 多因素Cox 回歸分析TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、SHIP2 及EGFL7 高表達均為影響肺癌患者預(yù)后的獨立危險因素（均P ＜0.05），見表3。

表3 多因素Cox 回歸分析

3 討論

國內(nèi)外對肺癌致病因素及發(fā)病機制已有大量研究，但其發(fā)病機制較為復(fù)雜，且受多種因素影響，導(dǎo)致臨床上對肺癌的診斷及預(yù)后評估的準(zhǔn)確性仍存在不足。因此，為進一步明確診斷，使患者盡早得到有效治療，降低復(fù)發(fā)率及死亡率，有必要繼續(xù)探索可用于明確早期肺癌診斷的標(biāo)志物及預(yù)后的影響因子。本研究結(jié)果顯示肺癌組織中SHIP2、EGFL7 蛋白高表達率均高于癌旁組織（均P ＜0.05），這說明SHIP2、EGFL7 蛋白高表達與肺癌的發(fā)生有關(guān)。賴世平等[7]研究后發(fā)現(xiàn)在卵巢癌組織中SHIP2 蛋白高表達所占比例顯著高于癌旁組織；張芳等[8]認為EGFL7蛋白在常見淚腺上皮性腫瘤組織中呈高表達狀態(tài)，且與血管生成及腫瘤細胞增殖活性呈明顯相關(guān)性。有研究指出，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（P13K/Akt）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腫瘤細胞增殖、分化密切相關(guān)，該通道在腫瘤細胞惡性增殖和轉(zhuǎn)移及新血管生成過程中具有重要作用[9]；SHIP2 通過負向調(diào)節(jié)P13K/Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可達到抑制腫瘤細胞增殖的目的[10]。EGFL7 具有內(nèi)分泌功能，EGFL7 蛋白介導(dǎo)機體胚胎血管發(fā)育及內(nèi)皮細胞遷移過程，而血管生成是影響惡性腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移的重要因素，在宮頸癌[11]、直腸癌[12]等惡性腫瘤組織中EGFL7 蛋白呈高表達。因此，EGFL7 可能通過參與血管生成而介導(dǎo)腫瘤發(fā)生、進展過程。

本研究結(jié)果顯示肺癌組織中SHIP2、EGFL7 高表達與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P ＜0.05），這提示SHIP2、EGFL7 高表達可能參與肺癌發(fā)生、發(fā)展過程。劉固等[13]提出EGFL7 蛋白參與結(jié)直腸癌（CRC）發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移等，EGFL7 高表達與TNM分期無關(guān)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈明顯相關(guān)性，并認為EGFL7 表達可作為CRC術(shù)后預(yù)后情況的預(yù)測因子。SHIP2、EGFL7 高表達組3 年生存率低于低表達組（P ＜0.05），這表明SHIP2、EGFL7 高表達與肺癌預(yù)后有關(guān)，且高表達通常提示預(yù)后不良。另外，本研究通過多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、SHIP2 及EGFL7 高表達均為影響肺癌患者預(yù)后的獨立危險因素（均P ＜0.05）。這進一步說明SHIP2、EGFL7 高表達不僅與肺癌發(fā)生及預(yù)后明顯相關(guān)，還可作為評估肺癌預(yù)后的預(yù)測因子[14]。有研究顯示，SHIP2 表達與非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移和血管侵襲密切相關(guān)。Feleke 等[15]在報道中提出EGFL7在骨肉瘤（OS）和骨巨細胞瘤（GCTB）中呈高表達，可作為OS 和GCTB 細胞靶向治療和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。另外，Heissig 等[16]提出EGFL7 表達可能介導(dǎo)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及耐藥性。因此，肺癌患者SHIP2、EGFL7 高表達可引起腫瘤細胞增殖、分化，導(dǎo)致疾病進一步惡化，故監(jiān)測肺癌組織SHIP2、EGFL7 表達水平可評估患者預(yù)后情況。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 陳慧芬：實驗操作、論文撰寫；謝艷萍、梁亦賢、朱文娟：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學(xué)分析、論文修改