外周血BDNF、miR-132 及NfL對遺忘型輕度認(rèn)知障礙患者向阿爾茨海默病轉(zhuǎn)化的風(fēng)險預(yù)測價值

張金娜，顏蓉

阿爾茨海默?。ˋD）相關(guān)癥狀具有隱匿性與進(jìn)展性的特點，約33.7%的老年人在認(rèn)知正常階段，已經(jīng)存在AD 相關(guān)病理改變[1]。因此，早期診斷與干預(yù)對改善預(yù)后具有重要意義。輕度認(rèn)知障礙（MCI）是癡呆前認(rèn)知障礙癥狀存在期，該時期可早于癡呆發(fā)病10 ～20 年[2]，患者通常表現(xiàn)為主觀認(rèn)知功能下降，但客觀認(rèn)知、日常生活及社會功能相對完善。現(xiàn)階段較為成熟的進(jìn)行性神經(jīng)損傷檢測方式為腦脊液生物標(biāo)志物檢測（諸如A 蛋白、Tau 蛋白）與影像學(xué)檢測（PET 或MRI 等），其多具有侵入性，且成本較高。本研究評價外周血腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、mi-RNA132（miR-132）及神經(jīng)絲輕鏈蛋白（NfL）水平對aMCI患者向AD轉(zhuǎn)化的風(fēng)險預(yù)測價值，旨在為早發(fā)現(xiàn)，早診斷，早期系統(tǒng)、正規(guī)及全面干預(yù)提供依據(jù)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 樣本選取

1.1.1 樣本量預(yù)估 本研究中以認(rèn)知損害不同階段，即“aMCI 或AD”作為因變量，以患者人口學(xué)特征、疾病與健康因素、影像學(xué)改變、外周血分子生物學(xué)指標(biāo)和神經(jīng)心理評估共5 個方面16 項指標(biāo)作為自變量，根據(jù)二元Logistic 回歸樣本量EPV 法則的相關(guān)要求[3]，再考慮5%的樣本刪失率，最終得到樣本168 例，可滿足回歸分析統(tǒng)計需求。

1.1.2 樣本采集 選取2018 年6 月至2022 年9 月紹興市第七人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科確診的AD 與aMCI患者共182 例，剔除依從性低及研究資料不全樣本9例，最終得到樣本173 例。其中AD 組患者90 例，包括男38 例，女52 例；年齡56 ～78 歲，中位年齡67.00（62.50，70.50）歲。aMCI 患者83 例，包括男42 例，女41 例；年齡46 ～76 歲，平均64.00（58.00，68.00）歲。本研究經(jīng)紹興市第七人民醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）AD診斷，參考《精神和行為障礙分類》（ICD-10）中AD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；（2）aMCI診斷，采取記憶域心理測評，分別包括聽覺詞語學(xué)習(xí)測驗及延遲檢測（AVLT 與AVLT-R）、邏輯記憶檢測及延遲檢測（LMT 和LMT-R）、Stroop色詞測驗（SCWT）、符號數(shù)字模式測驗、波士頓命名測驗（BNT）等，如患者具備兩項評分均低于年齡矯正均值的1 個標(biāo)準(zhǔn)差（SD），則判斷為aMCI[5]；（3）患者知情同意，主動參與。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有其他類型的癡呆患者；（2）具備語言域和執(zhí)行域認(rèn)知功能減低現(xiàn)象，但記憶域測試評分不符合aMCI 評估標(biāo)準(zhǔn)的MCI 患者；（3）合并顱內(nèi)其他器質(zhì)性病變或重要器官、系統(tǒng)病變患者；（4）存在其他神經(jīng)精神障礙患者；（5）合并影響本研究外周血分子生物學(xué)指標(biāo)水平的病變患者；（6）無法提供完整的研究相關(guān)數(shù)據(jù)或依從性欠佳者；（7）非知情同意者。

1.2 方法

1.2.1 外周血分子生物學(xué)指標(biāo)檢測 采集患者入院第2 天晨起空腹靜脈血3 ml×2 個抗凝管。1 號管4 ℃恒溫靜置后上離心機(jī)（2 000 r/min）離心20 min，取上清液分裝，于—80 ℃低溫保存。2 號管低溫凍存后，于RNA 提取前行充分解凍，取0.25 ml與Trizol 液以1∶3 比例混合震蕩，室溫靜置5 min后，2 000 r/min，4 ℃恒溫離心10 min，靜置后取上清。加入氯仿0.2 ml 后重復(fù)離心10 min，靜置后取水相（約500l）。加入異丙醇500l 后震蕩，室溫靜置30 min 后重復(fù)離心10 min 去上清保留RNA 沉淀，加入75%乙醇重復(fù)離心3 min，靜置3 min 后，上超微量紫外分光光度計（賽默飛）測定總RNA 純度良好。以雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清BDNF、NfL 水平，采用實時熒光PCR 法（RT-PCR）測定miR-132。

1.2.2 RMI腦部形態(tài)學(xué)檢測 采用1.5TMR（I明峰），選擇T1WI、T2WI、FLAIR、DWI 序列（常規(guī)掃描）以及TOF-3D-MRA 掃描。視野（FOV）=240 mm×240 mm；厚度6 mm，層距1 mm，矩陣256×256?；紓?cè)時囑患者取臥位，掃描范圍從爐頂至顱底。橫軸位、矢狀位定位線與大腦下緣連線、大鐮相平行；冠狀位定位線與海馬長軸相垂直。FLAIR 序列垂直于海馬長軸斜進(jìn)行冠狀位掃描（厚度0.5 mm），獲得斜冠狀面海馬圖像后，經(jīng)三維體積分析得到海馬體積。

1.2.3 量表指標(biāo)評估（1）認(rèn)知障礙評估采用蒙特利爾認(rèn)知評估量表（MoCA）[6]，該量表針對記憶、語言、注意力集中、執(zhí)行、抽象思維、視空間結(jié)構(gòu)及計算/定向力7 個方面內(nèi)容進(jìn)行系統(tǒng)評估。（2）抑郁狀態(tài)評估采用PHQ-9 健康問卷[7]，該問卷涵蓋心情、睡眠、疲乏感、飲食、負(fù)性注意與負(fù)性信念及行動等方面，共9 個條目?！? 分提示無或輕度抑郁，10 ～14 分提示中度抑郁，15 ～19 提示中重度抑郁，≥20 分提示重度抑郁[8]。（3）焦慮狀態(tài)評估采用廣泛性焦慮障礙7 項（GAD-7）[9]，該量表同樣基于DSM-IV相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，針對患者焦慮情緒、擔(dān)憂、難以放松、坐立不安、煩躁等7 個方面進(jìn)行評估，≤4 分提示被試無焦慮，5 ～9 分提示輕微焦慮，10 ～13 提示中度焦慮，14～18 提示中重度焦慮，≥19 分則提示重度焦慮可能。（4）失能狀態(tài)評定采用Barthel 指數(shù)進(jìn)行評估，該量表包含吃飯、穿越、洗澡、大小便、裝飾、如廁、修飾、床椅移位、平地行走（45 m）、上下樓梯等共10 個項目。100 分提示被試獨立性良好，75 ～95 分提示輕度依賴，50 ～70 分提示中度依賴，25 ～45 分提示重度依賴，0 ～20 分提示完全依賴[10]。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。正態(tài)計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗或t’檢驗；非正態(tài)計量資料以M（P25，P75）表示，采用Mann-Whitney U 檢驗；計數(shù)資料比較采用檢驗。預(yù)測價值評估采用ROC 曲線分析，求曲線下面積（AUC）；多因素分析采用Logistic 回歸分析。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組評估指標(biāo)比較 兩組年齡、受教育程度、高血壓、糖尿病、海馬體積縮小、MoCA評分、GAD-7 評分、Barthel 指數(shù)以及外周血BDNF、miR-132 和NfL水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05），見表1。

表1 兩組評估指標(biāo)比較

2.2 BDNF、miR-132 和NfL 對aMCI 向AD 轉(zhuǎn)化的風(fēng)險預(yù)測價值 外周血BDNF、miR-132 和NfL 水平對aMCI 向AD 轉(zhuǎn)化風(fēng)險的ROC 曲線下面積分別為0.729、0.652 和0.804，具體靈敏度、特異度、臨界值等指標(biāo)見表2。外周血NfL 水平對aMCI 患者向AD轉(zhuǎn)化的風(fēng)險預(yù)測價值高于miR-132（Z=2.917，P ＜0.05），其他指標(biāo)間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05）。

表2 BDNF、miR-132 和NfL 對aMCI 向AD 轉(zhuǎn)化的風(fēng)險預(yù)測ROC 曲線分析

2.3 影響aMCI 向AD 轉(zhuǎn)化的多因素分析 將組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)作為自變量，認(rèn)知減退程度（aMCI 或AD）作為因變量帶入Logistic 回歸方程。結(jié)果得到，Hosmer-Lemeshow 擬合度（H）檢驗（=5.146，P=0.742），擬合度良好。模型系數(shù)檢驗Omnibus 檢驗，決定系數(shù)（R2）=0.713，P ＜0.05，回歸模型效能良好。年齡、海馬體縮小、MoCA 評分、GAD-7 評分及外周血BDNF、miR-132 和NfL水平是aMCI 向AD 轉(zhuǎn)化的影響因素（均P ＜0.05），見表3。

表3 aMCI 向AD 轉(zhuǎn)化風(fēng)險的多因素Logistic 回歸分析

3 討論

MCI 是一種介于正常衰老與輕度癡呆的中間過度狀態(tài)，由于MCI與AD 患者腦灰質(zhì)與皮質(zhì)的進(jìn)行性萎首先累及腦內(nèi)測顳葉的海馬區(qū)[11]，這部分腦區(qū)與記憶功能相關(guān)；因此，以記憶功能損傷為主要表現(xiàn)的aMCI 患者在MCI 中占較大比重。本研究即針對aMCI 向AD 轉(zhuǎn)化的風(fēng)險評估因子進(jìn)行分析。以往的檢測手段如計算機(jī)斷層掃描（PET）、腦脊液（CSF）檢測等，因檢測成本高且具有侵入性，阻礙了其臨床推廣。隨著對AD 相關(guān)外周血分子生物標(biāo)志物檢測的研究，不僅提高了了疾病的早期診斷能力，還對藥物的實驗研究與臨床推廣起到了推動作用[12]。

本研究選擇的外周血生物標(biāo)志物包括BDNF、miR-132 和NfL 3 種。BDNF 廣泛表達(dá)于大腦皮質(zhì)及海馬等多腦區(qū)，具有神經(jīng)保護(hù)作用，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的發(fā)育、存活、維持和修復(fù)具有重要意義[13]。本研究結(jié)果顯示，AD 患者血清BDNF 水平顯著低于aMCI，進(jìn)一步行ROC 曲線分析顯示，其對aMCI向AD 轉(zhuǎn)化風(fēng)險具有一定的量化預(yù)測評估價值，AUC為0.729，計算求得診斷臨界值為12g/L，該臨界值具有較高的敏感度（87.78%），但特異度相對偏低（50.60%）。多因素分析顯示，BDNF 對aMCI 向AD 轉(zhuǎn)化風(fēng)險的影響為負(fù)性（ =—0.322），OR 值為0.724。當(dāng)aMCI 患者血清BDNF 水平低于診斷臨界值時，應(yīng)重點關(guān)注。

miR-132 作為微小RVA 家族成員之一，與炎性反應(yīng)，血管生長以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸生長、分化、形態(tài)維持及凋亡等均具有密切關(guān)系[14]。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-132 預(yù)評估診斷價值偏低（AUC=0.652）；多因素分析顯示，miR-132 對aMCI向AD 轉(zhuǎn)化風(fēng)險的值達(dá)到—4.574，OR 值達(dá)到了0.010。因此，其對轉(zhuǎn)化風(fēng)險的評估需同時考慮其他因素的影響，并在多因素條件下進(jìn)行分析。

神經(jīng)軸索損傷和喪失是諸多慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要病理特征，NfL作為神經(jīng)絲的一個亞單位，對神經(jīng)元細(xì)胞損傷和死亡具高度特異性，與神經(jīng)細(xì)胞塑形以及髓鞘軸突再生密切相關(guān)[15]，是神經(jīng)細(xì)胞骨架的重要成分。本研究結(jié)果顯示，血清NfL 水平對aMCI 向AD 轉(zhuǎn)化風(fēng)險具有較好的預(yù)評估價值（AUC=0.804），診斷臨界值為77.5 ng/L，但其靈敏度僅為50%，但特異度達(dá)到96.39%，可針對其較高的特異度對預(yù)評估樣本中的假陽性樣本進(jìn)行鑒別。多因素分析結(jié)果顯示，其對轉(zhuǎn)化風(fēng)險的值為0.185，OR值為1.203。

總之，外周血BDNF、miR-132 和NfL 作為良好的生物學(xué)指標(biāo)，對提示疾病進(jìn)展，阻止或延緩aMCI患者潛在的病理進(jìn)程，改善癥狀，保護(hù)殘存的腦功能提供早期風(fēng)險評估依據(jù)。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 張金娜：設(shè)計實驗、實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、文章撰寫；顏蓉：獲取研究經(jīng)費、行政、技術(shù)或材料支持、指導(dǎo)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱。