不同酶組合致兔眼玻璃體液化的實驗研究

陳萍萍，駱陽，徐博懷，楊路

玻璃體是眼睛屈光介質(zhì)的一個組成部分，水占玻璃體的98%，大分子物質(zhì)占玻璃體的0.15%，包括透明質(zhì)酸、膠原纖維和可溶性的蛋白質(zhì)[1]。主要結(jié)構(gòu)成分是細纖維網(wǎng)狀支架中的II型膠原纖維和交織于支架間的透明質(zhì)酸粘多糖，其中Ⅱ型膠原纖維是玻璃體中的主要膠原成分，占膠原纖維總量的70%～80%[2]。膠原纖維的支架結(jié)構(gòu)隨著年齡增長而收縮和塌陷，進一步導(dǎo)致玻璃體液化和玻璃體后脫離（PVD）。玻璃體的液化與許多眼病有關(guān)，如黃斑裂孔、視網(wǎng)膜脫離及玻璃體積血等[1]。因此，構(gòu)建玻璃體液化模型，進一步研究玻璃體液化機理，尋求更好的預(yù)防和治療方法具有重要意義。目前已發(fā)現(xiàn)有多種酶可誘發(fā)玻璃體液化，如軟骨素酶（CA）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）、透明質(zhì)酸酶（HA）、纖溶酶（PL）、膠原酶、中性蛋白酶及納豆激酶等[3]。本研究應(yīng)用20 IU HA 聯(lián)合1 IU PL 及0.2 U CA 聯(lián)合10 ng MMP-3 兩種組合酶進行兔眼玻璃體腔內(nèi)注射，對兔眼進行臨床檢查及HE 染色，旨在觀察及比較兩種組合酶誘導(dǎo)玻璃體液化及PVD的快速性、有效性和安全性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物準備 健康成年新西蘭白兔24 只（由寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供），雌雄不拘，月齡為4～5 個月，體質(zhì)量為2.5 ～3.0 kg。將24 只白兔采用完全隨機分組法分成3 組，A 組11 只，B 組11 只，C組2 只作為空白組，A 及B 組均以右眼為實驗眼，左眼為對照眼。實驗前復(fù)方托吡卡胺眼藥水散瞳，做常規(guī)眼科檢查，包括肉眼、裂隙燈顯微鏡（＋90 D 前置鏡）、間接檢眼鏡及眼部B超檢查等，以排除兔眼疾患。本研究經(jīng)寧波大學(xué)實驗動物倫理委員會審批通過。1.2 實驗試劑 HA（北京索萊寶產(chǎn)品）、PL（美國Sigma 產(chǎn)品）、CA（美國Sigma 產(chǎn)品）、MMP-3（美國Sigma 產(chǎn)品），在注射前均用平衡鹽溶液（BSS 液）稀釋，濃度分別為20 IU/0.05 ml、1 IU/0.05 ml、0.2 U/0.05 ml 和10 ng/0.05 ml。

1.3 方法 玻璃體腔注射：注射前1 d 兩組兔眼均用加替沙星眼膏涂眼2 次，全身麻醉后兩組實驗眼于視乳頭前玻璃體后1/3 部位分別注射20 IU HA聯(lián)合1IU PL 及0.2 U CA 聯(lián)合10 ng MMP-3，兩組對照眼相同部位注射BSS 0.1 ml，C 組不做任何處理。術(shù)后加替沙星眼藥膏涂眼，繼續(xù)2 次/d，用3 d。所有操作均為同一組人員完成。

1.4 觀察指標 在注射后1 h 進行第一次觀察，之后每天觀察1 次直至其被處死。在每次觀察之前，用復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳，丙美卡因眼藥水眼表麻醉，而后將兔子固定于兔子固定器內(nèi)，用開瞼器撐開上下眼瞼進行眼部檢查。觀察項目：肉眼、裂隙燈顯微鏡、＋90 D 前置鏡及間接檢眼鏡檢查，主要檢查是否有炎癥反應(yīng)，晶狀體、玻璃體和視網(wǎng)膜的變化。如果在第一次檢查中發(fā)現(xiàn)手術(shù)引起的眼部損傷，則該兔眼不納入實驗。檢查后滴用乳酸左氧氟沙星滴眼液。每天進行眼部B 超檢查，檢查后用加替沙星眼藥膏涂眼。注射后3、7、14 d 采用簡單隨機抽樣法分別從A組及B組中各隨機選擇2 只兔子（4 只眼），并于第14 天從空白組中隨機抽取兔一只（2 只眼）。眼球摘除后，從3 組中隨機抽取的兔子里再任取1 只兔子（2 只眼）進行冰凍切片后HE 染色，用光學(xué)顯微鏡檢查。另一只兔子（2 只眼）放在—80 ℃冰箱內(nèi)存儲。1.5 統(tǒng)計方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料比較采用Fisher精確概率法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。當進行兩組之間比較時，值采用Bonferroni調(diào)整后的水平進行判斷，調(diào)整水平為0.017，為原水平（0.05）與分組數(shù)量（3）的比值，兩兩比較時P ＜0.017 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察 A 組及B 組的前房炎癥反應(yīng)、玻璃體混濁、玻璃體液化、部分性PVD 及完全性PVD 見表1 ～2，裂隙燈（＋90 D 前置鏡）檢查兔眼玻璃體可見濃縮玻璃體后皮質(zhì)，眼部B超檢查兔眼玻璃體，可見玻璃體完全后脫離，見圖1。

圖1 裂隙燈顯微鏡聯(lián)合眼部B 超觀察兔眼結(jié)果

表1 A 組實驗眼臨床觀察結(jié)果只眼

表2 B 組實驗眼臨床觀察結(jié)果只眼

2.2 HE 染色結(jié)果 實驗組和對照組兔眼術(shù)后視網(wǎng)膜形態(tài)和細胞結(jié)構(gòu)在光學(xué)顯微鏡觀察下與正常組相比無明顯異常，視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細胞、雙極細胞、光感受器細胞及視網(wǎng)膜色素上皮細胞均無水腫、破裂和壞死，結(jié)構(gòu)清晰完整，排列整齊，視網(wǎng)膜厚度無明顯改變，見圖2。

圖2 視網(wǎng)膜冰凍切片光學(xué)顯微鏡檢查結(jié)果（HE 染色，×400）

2.3 注射后不同時間PVD形成的眼數(shù) 注射后第3天，3 組PVD 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），在注射后第7 天，3 組PVD 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。A和B組實驗眼PVD差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.017），兩組藥物引起完全性PVD 及部分性PVD 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.017）；A、B 組實驗眼與對照組PVD差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.017）。注藥后第14天，3 組PVD 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；A 組實驗眼與B 組實驗眼PVD 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.017），兩組藥物引起完全性PVD及部分性PVD差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.017）；A、B 組實驗眼與對照組PVD 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.017）。A 組藥物注射后3、7、14 d 形成PVD 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；B 組藥物注射后3、7、14 d 形成PVD 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），且在3 d 與7 d 以及3 d與14 d 形成PVD 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.017）。B 組3 d 與7 d 藥物誘導(dǎo)完全性PVD 及部分性PVD 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.017），見表3。

表3 注射后不同時間實驗組和對照組兔眼PVD 的形成情況只眼

3 討論

藥物的眼內(nèi)注射部位對PVD的形成非常重要。由于玻璃體膠原纖維和透明質(zhì)酸在玻璃體后皮質(zhì)具有高密度，并且玻璃體后皮質(zhì)緊密地黏附于黃斑、視乳頭及血管周圍[4]。因此，本研究將藥物注射到兔眼玻璃體中后1/3 處，很好的誘導(dǎo)出兔眼PVD。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)兩組聯(lián)合酶均能有效誘導(dǎo)玻璃體液化及PVD，HA 可以快速有效地降解存在于玻璃體膠原纖維之間的透明質(zhì)酸聚合物，導(dǎo)致玻璃體凝縮并促使玻璃體支架塌陷，這有利于PL快速擴散到玻璃體視網(wǎng)膜交界處[5-6]。PL 能夠降解在玻璃體視網(wǎng)膜交界面的層粘連蛋白、纖連蛋白及其他分子膠。PL 能激活基質(zhì)金屬蛋白酶, 促使視網(wǎng)膜內(nèi)界膜Ⅳ型膠原降解，從而誘導(dǎo)完全性PVD[7]。雖然PL不能直接降解玻璃體視網(wǎng)膜交界面的IV型膠原，但它可以間接將IV 型膠原纖維暴露，使其被其他酶消化[8-9]，還通過激活膠原酶，釋放彈性蛋白酶，產(chǎn)生纖維連接蛋白降解產(chǎn)物，起到消化IV 型膠原纖維的作用[10-11]。MMP-3 能在玻璃體視網(wǎng)膜交界面特異性水解細胞外基質(zhì)，如纖連蛋白及層粘連蛋白等[12]。CA 能特異性水解硫酸軟骨素蛋白多糖，從而破壞玻璃體凝膠穩(wěn)態(tài)，同時還可降低玻璃體視網(wǎng)膜界面的分子粘連[13]。

雖然兩組聯(lián)合酶在形成PVD 方面總體結(jié)果大致相同，但在注射后7 d形成完全性PVD和部分PVD時，0.2 U CA 聯(lián)合10 ng MMP-3 的效果明顯好于20 IU HA 聯(lián)合1 IU PL。而且，筆者在進一步比較每組聯(lián)合酶的術(shù)后3、7、14 d 形成PVD 時，發(fā)現(xiàn)A 組在注射后7d 時，仍未全部形成PVD；在注射后14d 時，仍有2 只兔眼未形成完全性PVD。而B 組在注射后7d已全部形成PVD；在注射后14 d 全部形成完全性PVD。這說明0.2 U CA 聯(lián)合10 ng MMP-3 組誘導(dǎo)形成玻璃體液化及PVD 的快速性優(yōu)于20 IU HA 聯(lián)合1 IU PL 組。0.2U CA 聯(lián)合10 ng MMP-3 組也有不足之處，如藥物引起眼前房炎癥反應(yīng)較重，不過在注射5 d 后均恢復(fù)正常且未見明顯視網(wǎng)膜異常。

綜上所述，本實驗證實了0.2 U CA 聯(lián)合10 ng MMP-3 及20 IU HA 聯(lián)合1 IU PL 應(yīng)用玻璃體內(nèi)注射均可以誘導(dǎo)玻璃體液化和完全性PVD的發(fā)生，并且對眼組織無明顯毒性作用，兩組聯(lián)合酶誘導(dǎo)形成玻璃體液化及PVD總體結(jié)果基本一致，這說明這兩組聯(lián)合酶均是藥物誘導(dǎo)PVD 的一種較為理想的試劑。但是0.2 U CA 聯(lián)合10 ng MMP-3 誘導(dǎo)玻璃體液化及PVD更具快速性且在第7 天誘導(dǎo)效果更佳。因此，0.2 U CA 聯(lián)合10 ng MMP-3 所致兔眼玻璃體液化效果更為快速、安全及有效。若使用其中一種聯(lián)合酶建立玻璃體液化模型進行研究，需綜合考慮其研究目的，快速形成PVD且不需要前期采取房水研究，建議選用0.2 U CA 聯(lián)合10 ng MMP-3；需要采取房水做進一步研究且無時間限制，考慮到0.2 U CA 聯(lián)合10 ng MMP-3 注射引起前期的前房炎癥反應(yīng)較重，可能會影響房水測定，建議選用20 IU HA聯(lián)合1 IU PL。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 陳萍萍：實驗操作、論文撰寫；駱陽、徐博懷：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學(xué)分析；楊路：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費支持