川芎嗪對(duì)阿爾茨海默病小鼠神經(jīng)的保護(hù)作用

肖寒露 何超芹 周百桂 章娟娟

[摘要]?目的?探討川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）對(duì)阿爾茨海默?。ˋlzheimers?disease，AD）小鼠海馬神經(jīng)組織的保護(hù)作用。方法?以C57BL/6小鼠作為對(duì)照組，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為模型組、TMP低、中、高劑量組灌胃20、40、60mg/kg?TMP，1次/d，連續(xù)30d。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶和空間探索能力，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)小鼠海馬神經(jīng)組織超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase，SOD）活性、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione?peroxidase，GSH-Px）活性、丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量、腫瘤壞死因子-α（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-10、β-淀粉樣蛋白（β-amyloid?protein，Aβ）1-40、Aβ1-42、β-淀粉樣前體蛋白（β-amyloid?precursor?protein，β-APP）含量。結(jié)果?與對(duì)照組比較，模型組內(nèi)平均逃避潛伏期延長(zhǎng)，平臺(tái)停留時(shí)間、跨平臺(tái)次數(shù)、SOD活性、GSH-Px活性降低（P<0.05），MDA含量、TNF-α、IL-1β、IL-10、Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP含量上升（P<0.05）。與模型組比較，TMP低、中、高劑量組小鼠平均逃避潛伏期縮短，平臺(tái)停留時(shí)間、跨平臺(tái)次數(shù)、SOD活性、GSH-Px活性上升（P<0.05），MDA含量、TNF-α、IL-1β、IL-10、Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP含量降低（P<0.05）。結(jié)論?TMP能改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，減輕海馬神經(jīng)組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減少Aβ含量。

[關(guān)鍵詞]?川芎嗪；阿爾茨海默?。谎趸瘧?yīng)激；炎癥反應(yīng)；Aβ水平

[中圖分類號(hào)]?R749.16??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.24.022

Tetramethylpyrazine?protects?neural?in?mouse?model?of?Alzheimers?disease

XIAO?Hanlu1，?HE?Chaoqin1，?ZHOU?Baigui2，?ZHANG?Juanjuan1

1.Department?of?Pharmacy，?Zhejiang?Jinhua?Guangfu?Tumor?Hospital，?Jinhua?321000，?Zhejiang，?China;?2.Department?of?Neurology，?Zhejiang?Jinhua?Guangfu?Tumor?Hospital，?Jinhua?321000，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?protective?effect?of?tetramethylpyrazine?（TMP）?on?hippocampal?neural?tissue?in?Alzheimers?disease?（AD）?mice.?Methods?The?C57BL/6?mice?were?used?as?the?control?group，?the?APP/PS1?double?transgenic?mice?were?used?as?the?model?group，?and?the?TMP?low，?medium?and?high?dose?groups?were?given?intragastric?administration?of?20，?40，?and?60mg/kg?of?TMP，?once?a?day?for?30?consecutive?days.?Morris?water?maze?test?was?used?to?detect?the?learning?and?memory?and?space?exploration?ability?of?mice.?Enzyme-linked?immunosorbent?assay?was?used?to?detect?superoxide?dismutase?（SOD）?activity，?glutathione?peroxidase?（GSH-Px）?activity，?malonaldehyde?（MDA）?content，?tumor?necrosis?factor-α?（TNF-α），?interleukin?（IL-）-1β，?IL-10，?β-amyloid?protein?（Aβ）1-40，?Aβ1-42，?β-amyloid?precursor?protein?（β-APP）?content?in?mouse?hippocampal?nerve?tissue.?Results?Compared?with?the?control?group，?the?escape?latency?of?the?mice?in?the?model?group?was?prolonged，?and?the?platform?residence?time，?the?times?of?cross-platforms，?SOD?activity，?and?GSH-Px?activity?were?reduced?（P<0.05），?MDA?content，?TNF-α，?IL-1β，?IL-10，?Aβ1-40，?Aβ1-42，?β-APP?content?were?increased?（P<0.05）.?Compared?with?the?model?group，?the?escape?latency?of?mice?in?the?low，?medium，?and?high?dose?groups?of?TMP?was?shortened，?and?the?platform?residence?time，?cross-platform?times，?SOD?activity，?and?GSH-Px?activity?were?increased?（P<0.05），?MDA?content，?TNF-α，?IL-1β，?IL-10，?Aβ1-40，?Aβ1-42，?β-APP?content?increased?（P<0.05）.?Conclusion?TMP?can?improve?the?learning?and?memory?ability?of?AD?mice，?reduce?the?oxidative?stress?and?inflammation?of?hippocampal?nerve?tissue，?and?reduce?the?content?of?Aβ.

[Key?words]?Tetramethylpyrazine;?Alzheimers?disease;?Oxidative?stress;?Inflammatory?response;?Aβ?level

阿爾茨海默?。ˋlzheimers?disease，AD）是一種起病隱匿的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，臨床癥狀主要為認(rèn)知障礙、執(zhí)行能力障礙、失語(yǔ)等[1]。AD的主要病理特征包括細(xì)胞外間隙β-淀粉樣蛋白（β-amyloid?protein，Aβ）沉積形成的老年斑、異常磷酸化的Tau蛋白聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元突觸丟失和線粒體損傷[2]。因此AD可通過改善認(rèn)知功能、清除氧化自由基、提高活性氧表達(dá)、抑制炎癥因子分泌、減少Aβ形成及沉積等多種途徑防治AD的發(fā)展[3]。β淀粉樣蛋白毒性學(xué)說對(duì)AD的發(fā)病、發(fā)展起到重要作用，也是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[4]。

川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）是一種鈣拮抗劑，從中藥材川芎中提取的主要活性物質(zhì)之一，具有抗氧化、抗炎、降血栓、抗凋亡、抗纖維化和抗腫瘤等作用，且在神經(jīng)退行性疾病AD、帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化和多發(fā)性硬化及心腦血管疾病中起重要作用[5]。已有研究證明，TMP對(duì)AD具有良好的治療作用，能夠減輕AD小鼠神經(jīng)元凋亡、氧化損傷和炎癥損傷，減少AD功能障礙[6]。但TMP對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的研究機(jī)制尚不清楚。本研究以APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對(duì)象，探討TMP對(duì)AD模型小鼠海馬神經(jīng)組織保護(hù)和Aβ水平作用及其相關(guān)機(jī)制，旨在為AD的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1??材料與方法

1.1??材料

1.1.1??主要試劑??TMP（濃度≥98%，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20057041，生產(chǎn)單位：江蘇永健醫(yī)藥，規(guī)格：2ml∶40mg）；超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione?peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；腫瘤壞死因子-α（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）檢測(cè)試劑盒、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-10檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Aβ1-40、Aβ1-42、β-淀粉樣前體蛋白（beta-amyloid?precursor?protein，β-APP）檢測(cè)試劑盒（上海一研生物科技有限公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic?acid，BCA）試劑盒、顯色劑（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.2??實(shí)驗(yàn)動(dòng)物??5月齡SPF級(jí)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠40只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2014-0004。同月齡C57BL/6小鼠10只（北京華阜康生物科技股份有限公司）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室，自由飲水、進(jìn)食，室溫23～26℃，濕度50%～70%。所有小鼠適應(yīng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本研究經(jīng)浙江金華廣福腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：20-085）。

1.2??方法

1.2.1??小鼠的分組及處理??C57BL/6小鼠作為對(duì)照組，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠分為模型組、TMP低、中和高劑量組，分別灌胃20、40、60mg/kg?TMP，對(duì)照組和模型組灌胃0.2ml生理鹽水，1次/d，連續(xù)30d。

1.2.2??Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力??給藥30d后，開始進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)5d完成，從第1天開始訓(xùn)練小鼠，訓(xùn)練時(shí)將小鼠頭部面向池壁放入水內(nèi)，記錄小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間即為逃避潛伏期，90s內(nèi)小鼠未找到平臺(tái)，可直接將小鼠引至平臺(tái)。第5天定位實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將平臺(tái)撤出，在標(biāo)記的特定位置將小鼠放入水中，觀察小鼠90s內(nèi)在原平臺(tái)停留時(shí)間、跨平臺(tái)次數(shù)。

1.2.3??ELISA檢測(cè)海馬神經(jīng)組織SOD活性、GSH-Px活性、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-10、Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP含量??將海馬神經(jīng)組織剪碎，加入磷酸鹽緩沖液，4℃?12000轉(zhuǎn)/min離心5min收集上清液，按照酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒說明書步驟進(jìn)行，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)處的光密度值，并依據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MDA含量、TNF-α、IL-1β、IL-10、Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP。

1.3??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS?20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及分析，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2??結(jié)果

2.1??TMP對(duì)AD小鼠逃避潛伏期的影響

與對(duì)照組比較，模型組平均逃避潛伏期延長(zhǎng)（P<0.05）；與模型組比較，TMP低、中和高劑量組平均逃避潛伏期均縮短（P<0.05），5組小鼠運(yùn)動(dòng)距離、平均速度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖1。

2.2??TMP對(duì)AD小鼠空間探索能力的影響

與對(duì)照組比較，模型組平臺(tái)停留時(shí)間、跨平臺(tái)次數(shù)降低（P<0.05）；與模型組比較，TMP低、中和高劑量組平臺(tái)停留時(shí)間、跨平臺(tái)次數(shù)均增加（P<0.05），見圖2。

2.3??TMP對(duì)AD小鼠海馬神經(jīng)組織氧化應(yīng)激的影響

與對(duì)照組比較，模型組海馬神經(jīng)組織中SOD活性、GSH-Px活性顯著降低（P<0.05），MDA含量增加（P<0.05）；與模型組比較，TMP低、中和高劑量組海馬神經(jīng)組織中SOD活性、GSH-Px活性均顯著增加（P<0.05），MDA含量均降低（P<0.05），見圖3。

2.4??TMP對(duì)AD小鼠海馬神經(jīng)組織炎癥反應(yīng)的影響

與對(duì)照組比較，模型組海馬神經(jīng)組織TNF-α、IL-1β、IL-10含量增加（P<0.05）；與模型組比較，TMP低、中和高劑量組海馬神經(jīng)組織TNF-α、IL-1β、IL-10含量均降低（P<0.05），見圖4。

2.5??TMP對(duì)AD小鼠海馬神經(jīng)組織中Aβ含量的影響

與對(duì)照組比較，模型組海馬神經(jīng)組織Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP含量增加（P<0.05）；與模型組比較，TMP低、中和高劑量組海馬神經(jīng)組織Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP含量均降低（P<0.05），見圖5。

3??討論

AD是一種廣泛、進(jìn)行性、不可逆及破壞性的神經(jīng)退行性疾病，是導(dǎo)致癡呆的主要原因，血管疾病、吸煙、高血壓、糖尿病、高胰島素血癥和神經(jīng)炎癥被證實(shí)會(huì)增加患臨床AD的風(fēng)險(xiǎn)[1]。AD的病因尚不明確，主要有氧化應(yīng)激學(xué)說、Aβ毒性學(xué)說、神經(jīng)凋亡學(xué)說及基因突變學(xué)說，其中Aβ毒性學(xué)說是主流學(xué)說[7]。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)廣泛用于學(xué)習(xí)記憶、老年癡呆、神經(jīng)生物學(xué)、動(dòng)物心理學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，可用來(lái)研究動(dòng)物的空間記憶和學(xué)習(xí)能力，在驗(yàn)證神經(jīng)認(rèn)知障礙的嚙齒動(dòng)物模型中發(fā)揮重要作用[8]。氧化應(yīng)激是神經(jīng)退行性疾病包括AD的主要病理過程，AD患者氧化應(yīng)激相關(guān)的活性氧過量產(chǎn)生導(dǎo)致膜損傷、細(xì)胞骨架改變和細(xì)胞死亡，對(duì)大腦中的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)造成不利影響，影響認(rèn)知和大腦功能[9]。MDA是ROS造成生物膜脂質(zhì)氧化過程中產(chǎn)生的，是氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物，能夠反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化強(qiáng)度和速率，可以間接反應(yīng)氧化損傷程度；SOD、GSH-Px是清除自由基抗氧化物的關(guān)鍵酶，能夠保護(hù)機(jī)體氧化自由基免受損傷，因此SOD和GSH-Px活性可反映清除自由基能力，作為檢測(cè)氧化應(yīng)激的生物學(xué)指標(biāo)[10]。炎癥反應(yīng)是人體的一種防御機(jī)制，是抵抗損傷和感染的重要生理和病理過程，在各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括AD中炎癥反應(yīng)起重要作用。在AD人類和動(dòng)物腦組織周圍炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-10過度釋放，引起神經(jīng)組織炎癥浸潤(rùn)，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥損傷[11]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠平均逃避潛伏期延長(zhǎng)，而小鼠平臺(tái)停留時(shí)間、跨平臺(tái)次數(shù)降低，神經(jīng)組織內(nèi)SOD活性、GSH-Px活性降低，促進(jìn)MDA含量，炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-10含量分泌增加，提示AD模型構(gòu)建成功。

中醫(yī)藥在預(yù)防和治療AD方面，具有毒性低、易于穿越血–腦脊液屏障和多種協(xié)同作用等優(yōu)點(diǎn)。中藥川芎含有多種活性，臨床多用于治療心腦血管、腎臟等疾病，TMP是天然藥物川芎生物堿類化合物?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，其具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)自噬、心血管保護(hù)和神經(jīng)保護(hù)等作用[12]。TMP對(duì)神經(jīng)疾病有很好的保護(hù)作用。Michel等[13]研究發(fā)現(xiàn)TMP可減輕魚藤酮誘導(dǎo)的PD大鼠神經(jīng)生物學(xué)和行為缺陷且具有抗凋亡、抗炎和抗氧化作用。Lu等[14]研究發(fā)現(xiàn)TMP對(duì)甲基苯基四氫吡啶誘導(dǎo)的PD大鼠多巴胺能神經(jīng)元有神經(jīng)保護(hù)作用。TMP與AD發(fā)病機(jī)制有關(guān)，可以通過增強(qiáng)線粒體生物合成、保護(hù)興奮性毒性、阻斷鈣通道和防止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡，減少AD發(fā)生。Weng等[6]研究發(fā)現(xiàn)TMP可通過抑制Cullin?4B表達(dá)和生長(zhǎng)抑素受體4泛素化降解，減輕神經(jīng)元凋亡和損傷，提高AD小鼠的認(rèn)知能力；Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)TMP治療可顯著減弱同型半胱氨酸誘導(dǎo)的Tau過度磷酸化和Aβ積累，對(duì)AD大鼠的神經(jīng)病變有保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，TMP能改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，減輕海馬神經(jīng)組織氧化應(yīng)激和炎癥，與文獻(xiàn)研究結(jié)果相似，為TMP在AD治療提供新的途徑[5-13]。

Aβ毒性學(xué)說認(rèn)為是由于人腦皮質(zhì)和邊緣區(qū)域中Aβ斑塊的細(xì)胞外聚集和由過度磷酸化的τ蛋白構(gòu)成的細(xì)胞內(nèi)NFT，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，激活小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，誘導(dǎo)神經(jīng)元鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，降低細(xì)胞膜流動(dòng)性，引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生退行性病變[16]。而Aβ聚集的發(fā)生是由于APP被β-分泌酶和γ-分泌酶的差異切割，導(dǎo)致細(xì)胞外Aβ1-40和Aβ1-42的釋放產(chǎn)生不溶性Aβ原纖維，纖維聚集成斑塊導(dǎo)致激酶激活，從而引起微管相關(guān)蛋白過度磷酸化，最終聚合成不溶性NFT[17]。斑塊和纏結(jié)致使周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞募集，誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞活化和局部炎癥，并發(fā)展為神經(jīng)毒性。Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷是多維度、多機(jī)制的，在AD腦組織內(nèi)，Aβ大量累積，易發(fā)生纖維化，產(chǎn)生大量的ROS，破壞神經(jīng)細(xì)胞元內(nèi)部環(huán)境，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，造成神經(jīng)元調(diào)亡，導(dǎo)致突觸受損，出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙和認(rèn)知缺陷[18]。TMP作為潛在的抗氧化劑可抑制自身誘導(dǎo)的Aβ聚集，Weng等[6]發(fā)現(xiàn)TMP在減輕AD認(rèn)知障礙的同時(shí)降低Aβ水平和Tau磷酸化；劉長(zhǎng)安等[19]研究發(fā)現(xiàn)TMP能有效抑制AD大鼠神經(jīng)元ROS生成，抑制炎癥因子釋放，改善炎癥，降低Aβ的神經(jīng)毒性，對(duì)AD大鼠起神經(jīng)保護(hù)作用；Zhang等[20]發(fā)現(xiàn)TMP類似物T-006通過抑制AD病轉(zhuǎn)基因小鼠中Tau表達(dá)和磷酸化來(lái)緩解認(rèn)知缺陷。本研究結(jié)果顯示，模型組內(nèi)Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP過量累積，經(jīng)過TMP灌胃APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP含量降低，說明TMP能減少AD模型小鼠海馬內(nèi)Aβ生成，與上述文獻(xiàn)結(jié)果類似。

綜上所述，TMP能改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，減少神經(jīng)組織氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和Aβ生成，起到保護(hù)神經(jīng)的作用。

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（收稿日期：2022–08–31）

（修回日期：2023–07–28）