穿心蓮內(nèi)酯對(duì)糖尿病足大鼠血管生成的影響及機(jī)制Δ

張麗曉 ，戴守方 ，李 蕾 ，王瑞鋒 ，楊麗麗 ，邱金霞 ，尹永波 （1.邢臺(tái)市人民醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科，河北 邢臺(tái) 05000；.邢臺(tái)市人民醫(yī)院放射科，河北 邢臺(tái) 05000；.邢臺(tái)市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 邢臺(tái) 05000；.邢臺(tái)市人民醫(yī)院耳鼻喉科，河北 邢臺(tái) 05000）

糖尿病足與糖尿病神經(jīng)病變、外周血管疾病有關(guān)，是1 型和2 型糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，發(fā)病率有逐年增加的趨勢(shì)；其特征是血管生成受損，如果治療不當(dāng)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致患者截肢或引發(fā)膿毒血癥，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和生命健康[1—3]。促進(jìn)血管生成及創(chuàng)面愈合是治療糖尿病足的有效方法之一[4]。因此，研究糖尿病足的發(fā)病機(jī)制對(duì)于探索新的治療藥物具有重要意義。穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide，Andro）具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，Andro 可通過降低糖尿病小鼠空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、甘油三酯、腎/體重比、血尿素氮、血清肌酐、24 h 尿蛋白，抑制氧化應(yīng)激產(chǎn)物活性氧產(chǎn)生和增加促炎細(xì)胞因子，從而改善小鼠的糖尿病腎病[6]。Liang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Andro 通過減輕氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡能延緩糖尿病心肌病的進(jìn)展。Hippo通路及其效應(yīng)物Yes 相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）在調(diào)節(jié)器官生長(zhǎng)、組織修復(fù)和再生方面起著重要作用[8]。Hippo通路的活化使YAP 失活，從而抑制細(xì)胞存活、增殖和血管生成，該通路和YAP是血管生成和傷口愈合的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[9—10]，但尚不清楚Andro 能否通過調(diào)控Hippo-YAP 信號(hào)通路影響糖尿病足血管生成。因此，本研究主要探究Andro 對(duì)糖尿病足大鼠血管生成的影響以及其機(jī)制，以期為糖尿病足的治療提供新的參考依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

ACCU-CHEK Performa 型卓越快速血糖儀購自美國(guó)羅氏生物科技公司；3100型全自動(dòng)生化分析儀購自日本日立有限公司；H1-16K 型冷凍高速離心機(jī)購自湖南可成儀器設(shè)備有限公司；DM500型光學(xué)顯微鏡購自德國(guó)Leica儀器有限公司；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀購自美國(guó)BD公司。

1.2 主要藥品與試劑

Andro標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，貨號(hào)B20207）、維替泊芬（Hippo-YAP 信號(hào)通路特異性抑制劑，純度為97%，貨號(hào)S80258）均購自上海源葉生物科技有限公司；鏈脲佐菌素（貨號(hào)S0130）購自上海寶曼生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒（貨號(hào)YT8951）購自北京伊塔生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（貨號(hào)G1120-100）購自北京索萊寶科技有限公司；空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）ELISA 試劑盒（貨號(hào)FY-A014648）購自上海富雨生物科技有限公司；兔源缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxiainducible factor 1α，HIF-1α）單克隆抗體（貨號(hào)ab179483）、兔源血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）單克隆抗體（貨號(hào)ab32152）、兔源哺乳動(dòng)物Ste20樣激酶1（mammalian sterile20-like kinase 1，MST1）單克隆抗體（貨號(hào)ab245190）、兔源磷酸化MST1（p-MST1）單克隆抗體（貨號(hào)ab51134）、兔源大腫瘤抑制基因1（large tumor suppressor gene1，LATS1）單克隆抗體（貨號(hào)ab243656）、兔源磷酸化LATS1（p-LATS1）單克隆抗體（貨號(hào)ab111334）、兔源磷酸化YAP（p-YAP）單克隆抗體（貨號(hào)ab76252）、兔源YAP單克隆抗體（貨號(hào)ab81183）、兔源三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體（貨號(hào)ab9485）均購自美國(guó)Abcam 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G二抗（貨號(hào)XY0650）購自上海信裕生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠，5～7 周齡，雌雄各半，體重180～200 g，購自武漢云克隆動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK（鄂）2018-0021。設(shè)置飼養(yǎng)溫度為22 ℃，濕度為55%～60%，12 h光暗循環(huán)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

2 方法

2.1 動(dòng)物建模、分組和給藥

將90 只大鼠隨機(jī)分成Control 組（12 只）和建模組（78 只），各組大鼠雌雄各半。Control 組用普通飼料喂養(yǎng)。建模組參考相關(guān)文獻(xiàn)[11]，采用小劑量鏈脲佐菌素聯(lián)合高脂高糖飲食復(fù)制2型糖尿病大鼠模型，高脂高糖飲食喂養(yǎng)4周后，按35 mg/kg一次性腹腔注射0.3%鏈脲佐菌素（Control 組按10 mL/kg 注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液），注射后3、7、10 d 取尾靜脈血測(cè)量大鼠FBG，連續(xù)3 次測(cè)得FBG≥16.7 mmol/L，則為糖尿病模型造模成功。在此基礎(chǔ)上，采用燙傷法建立糖尿病足大鼠模型[12]：將糖尿病模型大鼠用普通飼料喂養(yǎng)4周后，按30 mg/kg 腹腔注射3%戊巴比妥鈉，用恒溫恒壓電熱燙傷儀在壓力為0.5 kg、溫度為80 ℃、作用時(shí)間為4 s的設(shè)置下，在大鼠右后肢足背造成燙傷，深至皮下，觀察燙傷處皮膚出現(xiàn)蒼白、腫脹、破潰等癥狀；Control組同法進(jìn)行燙傷處理。將建模成功的大鼠（共60 只）隨機(jī)分為Model 組，Andro 低、中、高劑量組和抑制劑組，每組12只。Andro 低、中、高劑量組分別灌胃1、10、20 mg/kg 的Andro溶液[7]和腹腔注射等體積的生理鹽水，抑制劑組灌胃20 mg/kg 的Andro 溶液和腹腔注射100 mg/kg 的維替泊芬[13]，每日1次，連續(xù)給藥2周；Control組、Model組灌胃和腹腔注射等體積的生理鹽水。

2.2 大鼠創(chuàng)面愈合情況的檢測(cè)

在造模及給藥期間對(duì)大鼠創(chuàng)面邊緣進(jìn)行測(cè)量并拍照，采用Image Pro Plush 6.0 圖像分析系統(tǒng)對(duì)創(chuàng)面面積進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率（%）＝（原始創(chuàng)面面積－未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

2.3 大鼠FBG及FINS含量的測(cè)定

藥物處理結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12 h，剪尾取血，用卓越快速血糖儀測(cè)定大鼠的FBG。腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，腹主動(dòng)脈取血，離心后得到血清，于－20 ℃保存。嚴(yán)格按照FINS ELISA試劑盒說明書測(cè)量大鼠的FINS含量。

2.4 大鼠創(chuàng)面組織損傷及毛細(xì)血管數(shù)的檢測(cè)

藥物處理結(jié)束后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，分離大鼠創(chuàng)面組織及創(chuàng)面周邊肉芽組織，部分創(chuàng)面及創(chuàng)面周邊肉芽組織在4%多聚甲醛中過夜固定，經(jīng)蔗糖梯度脫水、石蠟包埋后切片（3 μm）。切片經(jīng)二甲苯、乙醇脫蠟和水化，以HE染色，然后在顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照，錄入MPIAS-400 彩色病理圖文分析系統(tǒng)，觀察毛細(xì)血管數(shù)。

2.5 大鼠外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)

藥物處理結(jié)束后，大鼠腹主動(dòng)脈取血，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）數(shù)量，具體操作參考文獻(xiàn)[14]。結(jié)果以EPCs數(shù)量占外周血單核細(xì)胞數(shù)量的百分比表示。

2.6 大鼠血清生化指標(biāo)的檢測(cè)

取“2.3”項(xiàng)下血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C）的含量。

2.7 大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF 及Hippo-YAP 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用Western blot 法進(jìn)行檢測(cè)。提取6 只大鼠創(chuàng)面組織總蛋白，對(duì)蛋白進(jìn)行定量后變性處理。取變性后的蛋白適量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，在室溫條件下封閉2 h；加入HIF-1α、VEGF、MST1、p-MST1、LATS1、p-LATS1、p-YAP、YAP、GAPDH 一抗（p-MST1 的稀釋比例為1∶2 000，其余一抗稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗（稀釋比例為1∶2 000），37 °C孵育90 min；洗膜后顯影，以Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。以HIF-1α、VEGF 蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶的灰度值比值表示上述蛋白的表達(dá)水平，以p-MST1 與MST1、p-LATS1與LATS1、p-YAP 與YAP 蛋白條帶的灰度值比值表示MST1、LATS1、YAP蛋白的磷酸化水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 Andro對(duì)大鼠創(chuàng)面愈合情況的影響

Control組，Model組，Andro低、中、高劑量組及抑制劑組大鼠創(chuàng)面愈合率分別為（42.75±2.31）%、（19.65±1.24）% 、（23.68±1.37）% 、（27.83±1.51）% 、（34.26±2.04）%、（21.59±1.26）%。與Control 組比較，Model 組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著降低（P＜0.05）；與Model 組比較，Andro 低、中、高劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與Andro 高劑量組比較，抑制劑組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著降低（P＜0.05）。

3.2 Andro對(duì)大鼠FBG及FINS含量的影響

與Control 組比較，Model 組大鼠FBG、FINS 含量均顯著升高（P＜0.05）；與Model 組比較，Andro 低、中、高劑量組大鼠FBG、FINS含量均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與Andro 高劑量組比較，抑制劑組大鼠FBG、FINS含量均顯著升高（P＜0.05），結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠FBG 及FINS 含量的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12）

表1 各組大鼠FBG 及FINS 含量的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12）

a：與Control組比較，P＜0.05；b：與Model組比較，P＜0.05；c：與Andro低劑量組比較，P＜0.05；d：與Andro中劑量組比較，P＜0.05；e：與Andro高劑量組比較，P＜0.05。

FINS/（mU/L）15.37±1.12 37.52±2.65a 32.10±2.14b 25.45±1.48bc 18.64±1.21bcd 30.25±2.08e分組Control組Model組Andro低劑量組Andro中劑量組Andro高劑量組抑制劑組FBG/（mmol/L）4.67±0.64 19.38±1.36a 16.52±1.21b 12.37±1.04bc 6.87±0.79bcd 17.65±1.34e

3.3 Andro對(duì)大鼠創(chuàng)面組織損傷及毛細(xì)血管數(shù)的影響

Control 組大鼠創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列有序，毛細(xì)血管數(shù)較多；與Control 組比較，Model 組大鼠創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)不完整，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與Model 組比較，Andro 低、中、高劑量組大鼠創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)稍顯完整，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，毛細(xì)血管數(shù)顯著增加，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與Andro 高劑量組比較，抑制劑組大鼠創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加，毛細(xì)血管數(shù)顯著減少（P＜0.05），結(jié)果見圖1和表2。

圖1 各組大鼠創(chuàng)面組織HE染色圖

表2 各組大鼠毛細(xì)血管數(shù)、EPCs比例的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝12）

表2 各組大鼠毛細(xì)血管數(shù)、EPCs比例的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝12）

a：與Control組比較，P＜0.05；b：與Model組比較，P＜0.05；c：與Andro低劑量組比較，P＜0.05；d：與Andro中劑量組比較，P＜0.05；e：與Andro高劑量組比較，P＜0.05。

EPCs比例/%3.57±0.28 2.12±0.14a 2.78±0.17b 3.62±0.21bc 4.35±0.33bcd 2.63±0.12e分組Control組Model組Andro低劑量組Andro中劑量組Andro高劑量組抑制劑組毛細(xì)血管數(shù)/根20.14±1.57 5.13±0.46a 8.79±1.02b 13.48±1.12bc 17.94±1.25bcd 10.43±1.10e

3.4 Andro對(duì)大鼠外周血EPCs數(shù)量的影響

與Control 組比較，Model 組大鼠EPCs 比例顯著降低（P＜0.05）；與Model 組比較，Andro 低、中、高劑量組大鼠EPCs 比例均顯著升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與Andro高劑量組比較，抑制劑組大鼠EPCs比例顯著降低（P＜0.05），結(jié)果見圖2和表2。

圖2 各組大鼠外周血EPCs數(shù)量檢測(cè)的流式細(xì)胞圖

3.5 Andro 對(duì)大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C 含量的影響

與Control 組比較，Model 組大鼠TC、TG、LDL-C 含量均顯著升高（P＜0.05），HDL-C 含量均顯著降低（P＜0.05）；與Model組比較，Andro低、中、高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C 含量均顯著降低，HDL-C 含量均顯著升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與Andro 高劑量組比較，抑制劑組大鼠TC、TG、LDL-C含量均顯著增加，HDL-C含量顯著降低（P＜0.05），結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝12，mmol/L）

表3 各組大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝12，mmol/L）

a：與Control組比較，P＜0.05；b：與Model組比較，P＜0.05；c：與Andro低劑量組比較，P＜0.05；d：與Andro中劑量組比較，P＜0.05；e：與Andro高劑量組比較，P＜0.05。

分組Control組Model組Andro低劑量組Andro中劑量組Andro高劑量組抑制劑組TC 1.05±0.32 6.37±0.51a 5.03±0.43b 3.95±0.41bc 1.73±0.38bcd 4.17±0.36e TG 0.71±0.16 1.76±0.24a 1.42±0.26b 1.04±0.17bc 0.74±0.15bcd 1.15±0.18e HDL-C 1.43±0.10 0.41±0.04a 0.67±0.05b 0.88±0.06bc 1.13±0.08bcd 0.73±0.07e LDL-C 0.18±0.02 0.87±0.12a 0.64±0.07b 0.41±0.04bc 0.20±0.03bcd 0.53±0.05e

3.6 Andro 對(duì)大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF 及Hippo-YAP信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與Control 組比較，Model 組大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平，MST1、LATS1、YAP 蛋白的磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）；與Model組比較，Andro低、中、高劑量組大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平，MST1、LATS1、YAP 蛋白的磷酸化水平均顯著升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與Andro 高劑量組比較，抑制劑組大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平，MST1、LATS1、YAP 蛋白的磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖3和表4。

圖3 各組大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF 及Hippo-YAP信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

表4 各組大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF 及Hippo-YAP信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較（±s，n＝6）

表4 各組大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF 及Hippo-YAP信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較（±s，n＝6）

a：與Control組比較，P＜0.05；b：與Model組比較，P＜0.05；c：與Andro低劑量組比較，P＜0.05；d：與Andro中劑量組比較，P＜0.05；e：與Andro高劑量組比較，P＜0.05。

分組Control組Model組Andro低劑量組Andro中劑量組Andro高劑量組抑制劑組HIF-1α/GAPDH 0.98±0.11 0.11±0.02a 0.29±0.03b 0.57±0.06bc 0.88±0.09bcd 0.24±0.03e VEGF/GAPDH 1.23±0.14 0.19±0.03a 0.52±0.05b 0.84±0.07bc 1.12±0.10bcd 0.37±0.04e p-MST1/MST1 0.89±0.07 0.10±0.01a 0.27±0.02b 0.58±0.06bc 0.84±0.08bcd 0.23±0.02e p-LATS1/LATS1 0.95±0.09 0.07±0.01a 0.28±0.03b 0.59±0.08bc 0.92±0.10bcd 0.27±0.04e p-YAP/YAP 0.92±0.07 0.15±0.02a 0.26±0.04b 0.58±0.05bc 0.87±0.09bcd 0.31±0.03e

4 討論

糖尿病足是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，也是糖尿病患者住院的最常見原因之一。糖尿病足發(fā)生的常見危險(xiǎn)因素包括血糖控制不良、周圍神經(jīng)病變、外周血管疾病和免疫抑制等，具有傷口極易感染、較難愈合、反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)[15]。糖尿病足患者傷口愈合延遲的關(guān)鍵因素是局部新生毛細(xì)血管生成和外周血流的減少。因此，促進(jìn)血管新生及創(chuàng)面愈合、改善并恢復(fù)足部血流是治療糖尿病足的關(guān)鍵。大量研究表明，二甲雙胍可通過減少炎癥、氧化應(yīng)激、減輕局部胰島素抵抗和促進(jìn)血管生成等促進(jìn)創(chuàng)面愈合，但也有研究表明二甲雙胍能通過抑制角質(zhì)細(xì)胞增殖延長(zhǎng)創(chuàng)面愈合時(shí)間[16]。此外，尚未有研究表明二甲雙胍可以通過調(diào)節(jié)Hippo-YAP 信號(hào)通路促進(jìn)糖尿病足大鼠血管生成，因此本研究未用二甲雙胍作為陽性對(duì)照藥物進(jìn)行研究。

Andro是從草本植物穿心蓮中分離出來的一種二萜類化合物，具有廣泛的藥理活性[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Andro 能夠通過抑制氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，改善糖尿病腎病、糖尿病心肌病[6—7]。此外有研究發(fā)現(xiàn)，Andro 具有一定的糖代謝調(diào)節(jié)能力，與沒食子酸聯(lián)用可顯著降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的血糖[17—18]。本研究發(fā)現(xiàn)，Andro 能有效降低糖尿病足大鼠FBG、FINS、TC、TG、LDL-C 含量，顯著增加HDL-C 含量，表明Andro 具有降低糖尿病足大鼠血糖、血脂的作用。由此推測(cè)，Andro可能對(duì)糖尿病足創(chuàng)面愈合有一定的積極作用。

HIF-1α/VEGF 軸功能受損是糖尿病相關(guān)血管生成障礙的主要機(jī)制。HIF-1是一種由翻譯后調(diào)控的α-亞基和組成型表達(dá)的β-亞基組成的異源二聚體，被廣泛認(rèn)為是氧穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子。在缺氧組織條件下，HIF-1α的羥基化作用減弱，導(dǎo)致HIF-1α蛋白不穩(wěn)定，并啟動(dòng)多個(gè)對(duì)血管生成至關(guān)重要的基因表達(dá)，最明顯的是VEGF[19]。糖尿病患者HIF-1α 的功能活性降低，這種變化導(dǎo)致VEGF 不能上調(diào)以應(yīng)對(duì)軟組織缺血，使血管生成和傷口愈合受損。研究已經(jīng)證明，上調(diào)HIF-1α/VEGF軸可有效促進(jìn)糖尿病足大鼠血管生成及傷口愈合[19]。EPCs 既能分化為內(nèi)皮細(xì)胞，又能分泌生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和血管活性物質(zhì)，促進(jìn)血管生成，維持血管穩(wěn)態(tài)[20]。EPCs 的數(shù)量和功能異常是判斷糖尿病血管病變嚴(yán)重程度的一種可靠指標(biāo)，也是導(dǎo)致患者傷口不愈合的關(guān)鍵因素[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病足大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平，創(chuàng)面愈合率，毛細(xì)血管數(shù)和外周血中EPCs比例均明顯降低，而給予Andro后則顯著提高了糖尿病足大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平，創(chuàng)面愈合率，毛細(xì)血管數(shù)和外周血中EPCs 比例，提示Andro具有促進(jìn)糖尿病足大鼠血管生成及傷口愈合的作用。

Hippo-YAP 信號(hào)通路包含MST1/2、調(diào)節(jié)蛋白和LATS1/2。YAP 和帶有PDZ 結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄輔激活因子是Hippo 通路的主要下游效應(yīng)物。MST1/2 磷酸化并激活LATS1/2，LATS1/2 在Ser-127 或Ser-381 位點(diǎn)磷酸化YAP，導(dǎo)致其細(xì)胞質(zhì)保留和降解，并隨后抑制其靶基因轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞胞外陷阱可抑制Hippo-YAP 信號(hào)通路，使YAP 與轉(zhuǎn)錄因子Smad2 結(jié)合，并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，從而促進(jìn)內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終阻礙糖尿病足小鼠血管生成并延遲傷口愈合[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，Andro 可提高糖尿病足大鼠創(chuàng)面組織中MST1、LATS1、YAP蛋白的磷酸化水平，提示Andro可能通過激活Hippo-YAP信號(hào)通路，從而起到促進(jìn)糖尿病足大鼠血管生成及創(chuàng)面愈合的作用；使用Hippo-YAP信號(hào)通路抑制劑維替泊芬后，減少了Hippo-YAP信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，減弱了Andro對(duì)血管生成及創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用，再次說明了Andro 可能通過激活Hippo-YAP 信號(hào)通路，促進(jìn)糖尿病足大鼠血管生成及創(chuàng)面愈合。

綜上所述，Andro 具有降低糖尿病足大鼠血糖、血脂，促進(jìn)糖尿病足大鼠血管生成及創(chuàng)面愈合的作用，其作用機(jī)制可能與激活Hippo-YAP 信號(hào)通路有關(guān)。然而本研究尚存在不足之處，僅驗(yàn)證了Andro 對(duì)Hippo-YAP信號(hào)通路的作用，未對(duì)其他靶點(diǎn)、途徑進(jìn)行驗(yàn)證，后續(xù)研究將會(huì)進(jìn)一步明確Andro在糖尿病足中的作用機(jī)制。