細(xì)胞外囊泡與非編碼RNA在肝缺血再灌注損傷中作用的研究進(jìn)展

雷嘉豪，繆炳文，繆輝來(lái)

1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 肝膽胰外科，廣東 湛江 524003；2.廣東醫(yī)科大學(xué) 肝損傷診斷與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524001

肝缺血再灌注損傷（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）是肝臟手術(shù)、創(chuàng)傷、失血性休克和移植的常見(jiàn)并發(fā)癥。除了影響肝臟外，HIRI還通過(guò)氧化和炎癥途徑導(dǎo)致遠(yuǎn)端器官損傷[1]。造成HIRI的因素很多，包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞的凋亡等[2]。目前，臨床防治HIRI效果仍不理想，極大影響患者的生活質(zhì)量，加重患者和醫(yī)療系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)，甚至危及患者生命[3]。因此，深入了解HIRI發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制對(duì)HIRI的早期診斷和治療具有重要意義。

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是一種由細(xì)胞釋放到細(xì)胞外基質(zhì)的膜性小囊泡，廣泛存在于各種體液中，如血液、尿液以及肝硬化腹水中。EVs含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等重要物質(zhì)，可通過(guò)受體-配體結(jié)合激活信號(hào)通路或內(nèi)吞、吞噬或膜融合的方式將這些物質(zhì)傳遞到受體或靶細(xì)胞，調(diào)節(jié)受體細(xì)胞表型，在細(xì)胞間的通信中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，但通過(guò)多種途徑參與基因的轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后的修飾過(guò)程，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為[5]。越來(lái)越多證據(jù)表明，一些ncRNA包括微小RNA（microRNA，miRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在調(diào)節(jié)HIRI中起著重要作用。EVs作為細(xì)胞間通訊的載體，可運(yùn)輸ncRNA進(jìn)入受體細(xì)胞，影響自噬、細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等病理生理過(guò)程，從而對(duì)HIRI產(chǎn)生影響。本文對(duì)EVs、ncRNA以及EVs-ncRNA對(duì)HIRI調(diào)節(jié)作用進(jìn)行總結(jié)，并展望EVs攜帶的ncRNA在臨床應(yīng)用中對(duì)HIRI具有早期診斷和治療的潛力。

1 EVs在HIRI中的作用

研究表明，細(xì)胞可以分泌多種不同類型的EVs，且每類EVs都具有獨(dú)特的生物發(fā)生機(jī)制，存在特征性蛋白質(zhì)和核酸。根據(jù)生物起源，EVs可分為3類：外泌體（exosomes）、微囊泡（microvesicles，MVs）和凋亡小體（apoptotic bodies）[6]。外泌體最大徑30～100 nm，開(kāi)始于胞內(nèi)小體進(jìn)一步向內(nèi)膜突起形成的管腔內(nèi)囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），ILVs進(jìn)一步成熟為多囊泡體（multivesicular body，MVB），分泌型MVB與細(xì)胞質(zhì)膜融合，釋放出外泌體[7]。MVs最大徑100～1 000 nm，是由細(xì)胞質(zhì)膜向外出芽，與細(xì)胞膜融合后直接脫落形成。凋亡小體最大徑2～5 μm，伴隨細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生[8]。

大量研究發(fā)現(xiàn)EVs可以通過(guò)增強(qiáng)自噬、抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，減少肝細(xì)胞凋亡來(lái)減輕HIRI。Yang等[9]發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞分泌的外泌體通過(guò)增強(qiáng)自噬可有效減輕肝細(xì)胞凋亡，減輕HIRI。Yao等[10]在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的EVs中發(fā)現(xiàn)了一種位于線粒體中的抗氧化酶-錳超氧化物歧化酶（Mn superoxide dismutase，Mn SOD），Mn SOD可以抑制氧化應(yīng)激和中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并在體內(nèi)外抑制肝細(xì)胞凋亡，因此，通過(guò)EVs傳遞，可以保護(hù)肝組織免受IRI的影響。Haga等[11]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）來(lái)源的EVs增加了肝臟中NACHT，LRR and PYD結(jié)構(gòu)域蛋白12和趨化因子配體1的mRNA表達(dá)并減少了IRI期間炎癥細(xì)胞因子（如IL-6）的mRNA表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)減輕肝臟損傷，從而改善HIRI。Nong等[12]研究表明人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可以通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、減少炎癥因子的釋放、減輕氧化應(yīng)激，進(jìn)而降低肝損傷程度和減少肝細(xì)胞壞死和凋亡，改善HIRI。以上研究說(shuō)明EVs可通過(guò)多種途徑來(lái)減輕HIRI，在HIRI修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用。

2 ncRNA在HIRI中的作用

ncRNA可以根據(jù)其大小分為不同的類別，包括miRNA、lncRNA、環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）、tRNA衍生的小RNA（tRNA derived small RNA，tsRNA）和piRNA等[13]。非編碼核酸序列（不編碼蛋白質(zhì)）約占人類基因組的98%[14]。近年來(lái)，大量的研究證明lncRNA和miRNA的表達(dá)水平對(duì)HIRI的發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵作用[15]。

2.1 miRNA在HIRI中的作用

miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為21～25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈RNA分子，通過(guò)與靶標(biāo)mRNA的3’端非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）特異性結(jié)合，從而引起靶標(biāo)信使RNA（mRNA）分子的降解或翻譯抑制，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控[16]。已有研究證實(shí)miRNA異常表達(dá)與HIRI密切相關(guān)。

自噬主要起到促進(jìn)細(xì)胞存活的作用，以應(yīng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺乏和缺氧，然而，受損細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的自噬可反過(guò)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[17]。其中有的miRNA通過(guò)抑制自噬來(lái)減輕HIRI。Li等[17]發(fā)現(xiàn)miR-30b過(guò)表達(dá)可降低自噬相關(guān)基因12（autophagy-related gene 12，Atg12）的表達(dá)，使Atg12-Atg5 結(jié)合蛋白水平下降，從而抑制自噬來(lái)提高IR誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的存活率以減輕HIRI。有的miRNA則是通過(guò)上調(diào)自噬來(lái)加重HIRI。Li等[18]發(fā)現(xiàn) miR-17通過(guò)抑制Stat3的表達(dá)上調(diào)自噬來(lái)加重HIRI。miRNA還可以通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激、減少細(xì)胞凋亡來(lái)減輕HIRI。Ji等[19]發(fā)現(xiàn)七氟烷通過(guò)下調(diào)miR-218-5p的表達(dá)水平，促進(jìn)GAB2 蛋白表達(dá)，隨后激活PI3K/AKT通路。這最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的減少，從而減輕HIRI。Wang等[20]發(fā)現(xiàn)異氟醚通過(guò)抑制包含3B的Ⅲ型纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)域表達(dá)，上調(diào)了miR-9-3p，減輕了大鼠炎癥、氧化應(yīng)激、肝組織細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)HIRI。Zheng等[21]發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p可能通過(guò)下調(diào)肝細(xì)胞核因子4α來(lái)抑制JNK/P38信號(hào)通路，降低凋亡蛋白的表達(dá)，從而有效減輕肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)肝臟免受I/R損傷。Luo等[22]發(fā)現(xiàn)miR-194 的過(guò)表達(dá)降低了PHLDA1，而PHLDA1的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過(guò)激活TNF受體相關(guān)因子6（TRAF6）。TRAF6 是肝臟IRI中多種炎癥信號(hào)的匯合，加重了肝臟IRI的應(yīng)激和炎癥，通過(guò)miR-194來(lái)抑制PHLDA1可改善肝IRI中炎癥水平，減輕肝IRI。還有些miRNA會(huì)加重炎癥，促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)加重HIRI。Huang等[23]發(fā)現(xiàn)miR-450b-5p通過(guò)抑制α B-晶體蛋白（B-crystallin，CRYAB），而CRYAB通過(guò)阻止抑制性κB激酶（inhibitory κB kinase，IKK）的激活，減少NF-κB誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，CRYAB減少導(dǎo)致HIRI加重。Pan等[24]發(fā)現(xiàn)miR-191 過(guò)表達(dá)會(huì)抑制ZO-1 相關(guān)Y-box因子（ZONAB）促進(jìn)G0/G1細(xì)胞周期阻滯并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而加重HIRI。Li等[25]發(fā)現(xiàn)在肝缺血再灌注狀態(tài)下miR-142-3p表達(dá)下調(diào)表達(dá)水平降低，miR-142-3p靶向MARCKS以調(diào)節(jié)其表達(dá)，MARCKS激活p38/JNK信號(hào)，上調(diào)NF-κB表達(dá)以加速炎癥，抑制PI3K/AKT信號(hào)以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，加重HIRI。因此得出結(jié)論：miRNA可通過(guò)不同作用機(jī)制調(diào)節(jié)HIRI，其中有的減輕HIRI，有的會(huì)加重HIRI。

2.2 lncRNA在HIRI中的作用

lncRNA是200 多個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，占所有ncRNA的80%～90%[26]。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)lncRNA廣泛參與人體的各種生理和病理過(guò)程。大多數(shù)lncRNA位于細(xì)胞核內(nèi)，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)或mRNA降解。位于細(xì)胞質(zhì)中的剩余l(xiāng)ncRNA主要參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，充當(dāng)miRNA“海綿”負(fù)調(diào)節(jié)miRNA，或充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA（ceRNA）在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)[27]。研究表明lncRNA已被確定為多種生物過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其異常表達(dá)與多種疾病的生理和病理生理有關(guān)，包括肝損傷[28]。

Tang等[29]研究發(fā)現(xiàn)miR-20b-5p通過(guò)靶向自噬相關(guān)基因7（autophagy-related gene 7，ATG7）并抑制肝細(xì)胞自噬。lnc HOTAIR作為可以作為miR-20b-5p的競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA減弱其對(duì)ATG7 的抑制作用，從而增強(qiáng)自噬，加重HIRI。Wang等[28]研究表明lnc-NEAT1增加了缺血再灌注中肝細(xì)胞中炎性因子的水平，包括IL-1β、IL-6和TNF-α，加重炎癥并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖，加重HIRI。Ying等[30]發(fā)現(xiàn)lncRNA Gm4419 通過(guò)調(diào)節(jié)miR-455/SOX6 通路，誘導(dǎo)HIRI中的細(xì)胞凋亡，加重HIRI。Dai等[31]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA AK054386在肝IR體內(nèi)模型和體外模型中作為miR-199的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA導(dǎo)致IRI小鼠和細(xì)胞模型中持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）和細(xì)胞凋亡，加重HIRI。Zhang等[32]發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1通過(guò)調(diào)節(jié)HMGB1-TLR4通路抑制凋亡和炎癥，減輕HIRI。以上研究表明lncRNA既可通過(guò)增強(qiáng)自噬、加重炎癥、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及抑制細(xì)胞增殖加重HIRI，也可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和炎癥來(lái)減輕HIRI。

3 EVs-ncRNA在HIRI中的作用

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，EVs中包含的ncRNA已被確認(rèn)，包括miRNA、circRNA，以及l(fā)ncRNA等。EVs的脂質(zhì)雙分子層可以保護(hù)ncRNA在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中免受核糖核酸酶降解，保證其生物學(xué)活性[33]。一旦EVs-ncRNA脫離降解途徑并被傳遞給受體細(xì)胞，它們就可以引發(fā)相應(yīng)的功能反應(yīng)。

鐵死亡是一種鐵依賴性的，區(qū)別于細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死、細(xì)胞自噬的新型的細(xì)胞程序性死亡方式。Li等[34]發(fā)現(xiàn)血紅素加氧酶-1 修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體通過(guò)miR-29a-3p靶向脂肪肝細(xì)胞中鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白2（iron response element-binding protein 2，Ireb2），下調(diào)Ireb2的表達(dá)，通過(guò)抑制鐵死亡從而減輕大鼠HIRI。Xie等[35]研究表明來(lái)自人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體通過(guò)miR-1246靶向IL-6加速了抗炎調(diào)節(jié)性T（regulatory T，Treg）細(xì)胞的分化并抑制了促炎性T輔助因子17（T helper 17，Th17）細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞平衡從而改善HIRI。此外還發(fā)現(xiàn)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-1246通過(guò)靶向糖原合成酶激酶3β激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，激活的Wnt信號(hào)有助于β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞核內(nèi)積累從而產(chǎn)生抗炎、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激的能力，以此來(lái)緩解HIRI[36]。Liu等[37]研究表明肝細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-122-5p通過(guò)下調(diào)PPARδ和激活NF-κB通路使Kupffer細(xì)胞極化，從而介導(dǎo)HIRI。抑制miR-122-5p對(duì)HIRI具有保護(hù)作用。以上說(shuō)明EVs可以通過(guò)傳遞ncRNA來(lái)介導(dǎo)HIRI。

綜上所述，多種干細(xì)胞來(lái)源的EVs、ncRNA在調(diào)節(jié)HIRI上都起著至關(guān)重要的作用，而EVs作為ncRNA的載體，可以通過(guò)EVs傳遞ncRNA來(lái)發(fā)揮作用，這為臨床上早期診斷和治療HIRI提供了新的思路。

4 展望

本綜述較為全面的概述了EVs、ncRNA以及EVs來(lái)源的ncRNA在調(diào)節(jié)HIRI中的作用，其中包括調(diào)節(jié)HIRI中自噬、炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡等病理反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，EVs來(lái)源的保護(hù)性非編碼RNA具有治療潛力，尤其是從干細(xì)胞中釋放出來(lái)的ncRNA，可用于治療HIRI。在HIRI中，EVs來(lái)源的ncRNA是一種十分具有吸引力的新型治療方法，具有改善HIRI的潛力，值得進(jìn)一步研究。同時(shí)EVs來(lái)源的ncRNA也可作為HIRI的生物標(biāo)志物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)HIRI的早期診斷。盡管這種技術(shù)有很好的應(yīng)用前景，但關(guān)于EVs-ncRNAs還有許多問(wèn)題尚未解決，存在許多挑戰(zhàn)。比如EVs-ncRNAs介導(dǎo)的多種生物效應(yīng)背后的原因尚不完全清楚，需要進(jìn)一步研究。circRNA作為ncRNA的一種，它在HIRI中的作用尚不明確，有待進(jìn)一步研究。并且，基于EVs的療法在轉(zhuǎn)化為人類醫(yī)學(xué)之前還需要更多的臨床前研究，以及EVs的臨床應(yīng)用面臨著生產(chǎn)、分離、純化、儲(chǔ)存以及將如何將EVs精準(zhǔn)遞送到靶細(xì)胞等問(wèn)題。隨著研究的深入和方法學(xué)創(chuàng)新，這些問(wèn)題將會(huì)逐步得到解決。