溶劑萃取-高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法快速提取檢測(cè)干燥恰特草中5種生物堿成分

史洪飛, 徐伯芃, 徐成鑫, 周修齊, 許宏福

(1. 南京警察學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 江蘇 南京 210023; 2. 南寧市公安局特警支隊(duì), 廣西 南寧 530022)

恰特草(Cathaedulis, khat)又名阿拉伯茶、巧茶,是無(wú)患子目、衛(wèi)矛科、巧茶屬常綠開花灌木,主要生長(zhǎng)在非洲東部、阿拉伯半島海拔1 500～2 500 m的地區(qū)[1,2]。埃塞俄比亞、也門等國(guó)家和地區(qū)吸食人數(shù)較多[3,4],國(guó)內(nèi)常出現(xiàn)在海關(guān)走私案件中。長(zhǎng)期服用恰特草會(huì)造成抑郁癥、口腔黏膜黑棘皮病[5],并對(duì)心臟、神經(jīng)等組織器官造成嚴(yán)重?fù)p傷[6]。2013年,國(guó)家食品藥品監(jiān)管總局、公安部、衛(wèi)生計(jì)生委聯(lián)合發(fā)布的《精神藥品品種目錄(2013年版)》中明確規(guī)定,將恰特草及其主要精神活性成分卡西酮(cathinone)列為第一類精神藥品進(jìn)行管制,去甲偽麻黃堿(norpseudoephedrine)列為第二類精神藥品進(jìn)行管制[7],去甲麻黃堿(norephedrine)的精神活性較弱,未列入管制目錄。恰特草的司法鑒定是打擊恰特草走私犯罪的重要一環(huán),新鮮恰特草可從形態(tài)、DNA、理化性質(zhì)三方面進(jìn)行檢驗(yàn),但目前恰特草走私主要采取偽裝成茶葉或粉碎為粉末的方式,且干燥會(huì)使恰特草中的DNA發(fā)生降解,因此難以從形態(tài)和DNA角度認(rèn)定[8]?？ㄎ魍腿ゼ讉温辄S堿的含量是恰特草理化檢驗(yàn)的重要指標(biāo),但由于卡西酮穩(wěn)定性較差,其在運(yùn)輸和干燥過(guò)程中會(huì)不同程度地部分降解為去甲偽麻黃堿和去甲麻黃堿,為理化檢驗(yàn)增加了不確定性。

由于實(shí)驗(yàn)材料獲取困難,國(guó)內(nèi)開展的恰特草理化檢驗(yàn)研究較少,對(duì)于干燥恰特草中是否含有可檢測(cè)含量的卡西酮成分,國(guó)內(nèi)存在爭(zhēng)議。國(guó)外對(duì)于恰特草中卡西酮、去甲偽麻黃堿、去甲麻黃堿的研究則較為全面,研究?jī)?nèi)容包括植物體內(nèi)不同部位[9-14]、不同產(chǎn)地和品種的恰特草間[10,13,15-17]的含量差異情況,生物堿含量隨干燥和儲(chǔ)存過(guò)程的變化情況[11,18-23],在植物和人體內(nèi)的代謝途徑[10,13,24-29]及毒理學(xué)性質(zhì)[30-32],提取檢測(cè)方法等。相關(guān)研究中對(duì)于不同品種恰特草中生物堿成分的含量存在一定爭(zhēng)議:埃塞俄比亞人對(duì)恰特草依照顏色分類,普遍認(rèn)為紅色恰特草藥效更好,卡西酮含量更高,價(jià)格也更高[16],但Krizevski等[10]的研究表明二者卡西酮含量相似,且綠色品種中去甲麻黃堿、去甲偽麻黃堿含量更高,由此推測(cè)恰特草中可能存在其他物質(zhì)直接或間接地增強(qiáng)了紅色品種恰特草的精神活性作用。

目前對(duì)于恰特草中卡西酮、去甲麻黃堿、去甲偽麻黃堿3種主要精神活性成分多采用氣相色譜法[12]、氣相色譜-紅外光譜法[23]、氣相色譜-質(zhì)譜法[9,10,18,21,33,34]、薄層色譜法[13]、毛細(xì)管電泳法[35]、離子交換高效液相色譜法[11]、高效液相色譜法[13,16,23,36,37]、高效液相色譜-核磁共振聯(lián)用法[19,21]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[38,39]進(jìn)行檢測(cè)。高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法的研究較少,其能夠通過(guò)質(zhì)譜裂解規(guī)律和碎片離子精確質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確地對(duì)已知[40]、未知[41,42]化合物成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析和物質(zhì)確證,相對(duì)于高效液相色譜-低分辨質(zhì)譜法,其對(duì)同分異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)類似物有更強(qiáng)的分辨識(shí)別能力[43];同時(shí),高分辨質(zhì)譜法對(duì)前端色譜分離要求較低,擁有更高的檢測(cè)通量[44,45],廣泛應(yīng)用于未知物分析、農(nóng)藥殘留檢測(cè)、代謝組學(xué)等領(lǐng)域?；诖?本研究團(tuán)隊(duì)利用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)恰特草中卡西酮的同系物進(jìn)行篩查,發(fā)現(xiàn)恰特草中存在甲卡西酮(methcathinone)和乙卡西酮(ethcathinone)成分(相關(guān)確證內(nèi)容將另文發(fā)表)。研究表明甲卡西酮和乙卡西酮均擁有較強(qiáng)的精神活性作用[46],目前,甲卡西酮被列入第一類精神藥品,乙卡西酮被列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補(bǔ)目錄》管制。

本文基于溶劑萃取-高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法建立了恰特草中卡西酮、去甲麻黃堿、去甲偽麻黃堿、甲卡西酮、乙卡西酮等5種生物堿成分的提取檢測(cè)方法,為恰特草的理化檢驗(yàn)鑒定及精神活性成分的研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290-6545高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀,配電噴霧雙噴離子源(Dual AJS ESI源)(美國(guó)Agilent公司); ME104E電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司); Lab Dancer渦旋振蕩儀(德國(guó)IKA公司); Pico17微量高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司); Milli-Q純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

恰特草由國(guó)家林業(yè)局森林公安司法鑒定中心提供;卡西酮標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL,純度>99%)購(gòu)自美國(guó)Cerilliant公司;去甲偽麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL,純度>99%)和甲卡西酮、乙卡西酮、去甲麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度為100 μg/mL,純度>99%)購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司。

濃鹽酸、氫氧化鈉、二氯甲烷、氯化鈉(分析純)購(gòu)自南京化學(xué)試劑股份有限公司;甲醇、乙腈(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制:精密移取卡西酮、去甲偽麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05 mL,去甲麻黃堿、甲卡西酮、乙卡西酮標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.50 mL,分別置于5 mL容量瓶中,利用乙腈定容至刻度,混勻,制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置于棕色試劑瓶,-20 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制:精密移取5種生物堿成分的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL,置于同一10 mL容量瓶中,利用乙腈定容至刻度,混勻,制成質(zhì)量濃度為1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,置于棕色試劑瓶,-20 ℃保存。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制:利用0.1%甲酸水溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋成質(zhì)量濃度為1、5、10、25、50、75、100、150、200 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

表 1 5種生物堿的保留時(shí)間、母離子精確質(zhì)量數(shù)、子離子精確質(zhì)量數(shù)、碎裂電壓、碰撞能

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1樣品前處理?xiàng)l件

精確稱取100 mg粉碎后的干燥恰特草于2 mL聚丙烯離心管中,加入1 mL 0.05 mol/L的鹽酸水溶液,渦旋3 min,以10 000 r/min離心3 min;取上清液600 μL于2 mL離心管中,加入1 mL二氯甲烷,渦旋1 min,以10 000 r/min離心3 min;取上清液300 μL于2 mL微量離心管中,加入80 μL 1 mol/L的氫氧化鈉水溶液,渦旋1 min,加入1 mL乙腈,渦旋振蕩2 min,加入400 mg NaCl固體,渦旋1 min,以10 000 r/min離心3 min;取上清液,用0.1%甲酸水溶液稀釋5倍、100倍、1 000倍,分別對(duì)5種目標(biāo)組分進(jìn)行定量分析。

1.3.2色譜條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl(100 mm×3.0 mm, 1.8 μm);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:A為0.1%甲酸水溶液,B為乙腈;進(jìn)樣量為5 μL;流速:0.3 mL/min;梯度洗脫程序:0～3.0 min, 5%B; 3.0～7.0 min, 5%B～40%B; 7.0～8.0 min, 40%B～60%B; 8.0～10.0 min, 60%B; 10.0～10.5 min, 60%B～5%B; 10.5～12.0 min, 5%B。

1.3.3質(zhì)譜條件

離子源:Dual AJS ESI源;掃描方式:正離子全掃描;毛細(xì)管電壓:4 000 V;鞘氣溫度:350 ℃;鞘氣流速:11 mL/min;干燥氣溫度:320 ℃;干燥氣流速:8 mL/min;單極質(zhì)譜全掃描模式(MS),一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z100～1 000,采集速率為5 spectra/s。目標(biāo)離子采集模式(Target MS/MS),一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z100～1 000,采集速率為1 spectra/s,二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z50～600,采集速率為2 spectra/s。數(shù)據(jù)采集時(shí)采用參比離子(C5H4N4,嘌呤,其準(zhǔn)分子離子精確質(zhì)量數(shù)為121.050 9)和(C18H18O6, HP-0921,其準(zhǔn)分子離子精確質(zhì)量數(shù)為922.009 8)進(jìn)行實(shí)時(shí)質(zhì)量校準(zhǔn)。5種生物堿的保留時(shí)間、母離子精確質(zhì)量數(shù)、子離子精確質(zhì)量數(shù)、碎裂電壓、碰撞能等見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品稀釋溶劑的優(yōu)化

采用乙腈、不同比例的乙腈-0.1%甲酸水溶液(8∶1、7∶2、6∶3、5∶4、4∶5、3∶6、2∶7、1∶8, v/v)、0.1%甲酸水溶液為稀釋溶劑,將乙腈為溶劑的100 μL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋為1 mL 100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)樣分析。當(dāng)使用乙腈、乙腈-0.1%甲酸水溶液(8∶1、7∶2、6∶3、5∶4、4∶5、3∶6, v/v)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)中間液時(shí),5種生物堿成分均存在溶劑效應(yīng)(出現(xiàn)峰展寬、峰分叉現(xiàn)象),采用乙腈-0.1%甲酸水溶液(2∶7、1∶8, v/v)、0.1%甲酸水溶液為稀釋溶劑時(shí),無(wú)明顯溶劑效應(yīng)產(chǎn)生,因此選擇0.1%甲酸水溶液為標(biāo)準(zhǔn)樣品和實(shí)驗(yàn)樣品的稀釋溶劑。

2.2 色譜柱的優(yōu)化

本文對(duì)比了3種色譜柱Eclipse Plus Phenyl-Hexyl (100 mm×3.0 mm, 1.8 μm)、Eclipse Plus C18(100 mm×3.0 mm, 1.8 μm)、SB-C18(50 mm×3.0 mm, 1.8 μm)對(duì)5種生物堿(質(zhì)量濃度均為100 μg/L)的分離效果,結(jié)果見圖1。SB-C18色譜柱的固定相采用不封端型鍵合方式,硅膠表面裸漏的硅羥基對(duì)堿性化合物會(huì)產(chǎn)生額外的吸附作用,造成色譜峰展寬、拖尾,不利于定性定量檢測(cè);Eclipse Plus C18和Eclipse Plus Phenyl-Hexyl色譜柱的固定相采用封端型的鍵合方式,色譜峰峰形良好;Eclipse Plus C18色譜柱的C18鍵合基團(tuán)對(duì)5種生物堿成分的保留選擇性小,無(wú)法將卡西酮和去甲偽麻黃堿完全分離;苯基鍵合色譜柱Eclipse Plus Phenyl-Hexyl通過(guò)π-π相互作用可以實(shí)現(xiàn)5種生物堿成分的基線分離,因此選擇Eclipse Plus Phenyl-Hexyl色譜柱(100 mm×3.0 mm, 1.8 μm)進(jìn)一步優(yōu)化提取檢測(cè)條件。

圖 1 采用3種色譜柱時(shí)5種生物堿成分的提取離子色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms (EIC) of the five alkaloids using the three columns Peak identifications: 1. norephedrine; 2. norpseudoephedrine; 3. cathinone; 4. methcathinone; 5. ethcathinone.

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

毛細(xì)管出口區(qū)域的碎裂電壓對(duì)目標(biāo)化合物準(zhǔn)分子離子的響應(yīng)有較強(qiáng)影響,過(guò)高或過(guò)低均不利于方法靈敏度的提升。過(guò)高時(shí)5種生物堿成分易發(fā)生源內(nèi)裂解,中性丟失一分子H2O,過(guò)低時(shí)化合物準(zhǔn)分子離子的離子傳輸效率降低。本研究在MS采集模式下,考察了碎裂電壓在110～170 V范圍內(nèi)5種生物堿成分準(zhǔn)分子離子峰的響應(yīng)情況,確定去甲偽麻黃堿和去甲麻黃堿的最佳碎裂電壓為130 V,卡西酮和甲卡西酮為140 V,乙卡西酮為160 V,結(jié)果見圖2。

圖 2 5種生物堿成分在不同碎裂電壓下的提取離子色譜峰面積Fig. 2 Extracted ion chromatographic peak areas of the five alkaloids at different fragmentor

在Target MS/MS采集模式下調(diào)整碰撞能,選取響應(yīng)最強(qiáng)的子離子作為定量離子,選取響應(yīng)次強(qiáng)的離子作為定性離子。優(yōu)化碰撞能,使定量離子的響應(yīng)達(dá)到最強(qiáng),確定去甲麻黃堿、去加偽麻黃堿、甲卡西酮和乙卡西酮的最佳碰撞能為10 eV,卡西酮為26 eV。

2.4 樣品提取條件的優(yōu)化

本文以測(cè)定的恰特草中5種生物堿含量為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),優(yōu)化了提取溶劑和提取方法,并通過(guò)加標(biāo)回收試驗(yàn),評(píng)估了提取液的基質(zhì)效應(yīng)。

2.4.1樣品提取溶劑和提取方法的優(yōu)化

圖 3 11種提取溶劑和2種提取方法提取的恰特草中5種生物堿成分的測(cè)定值Fig. 3 Measured values of the five alkaloids in khat with 11 extraction solvents and two extraction methods

首先考察了7種溶劑(水、甲醇、乙腈、1%甲酸乙腈、0.10 mol/L的鹽酸水溶液、乙腈-水(1∶1, v/v)、甲醇-水(1∶1, v/v))的提取效果。取100 mg干燥恰特草樣品,加入1 mL提取溶劑振蕩,上清液用0.1%甲酸水溶液稀釋,參照1.3節(jié)的色譜-質(zhì)譜條件檢測(cè)。結(jié)果顯示,0.10 moL/L的鹽酸水溶液和乙腈-水(1∶1, v/v)提取效果較好,見圖3。為進(jìn)一步考察不同濃度鹽酸水溶液及不同比例乙腈-水的提取效果,選取0.05 mol/L和0.15 mol/L的鹽酸水溶液、乙腈-水(2∶1、1∶2, v/v)4種提取溶劑,參照上述方法提取檢測(cè)。結(jié)果顯示,0.05 mol/L的鹽酸水溶液提取效果最佳,見圖3。

考察了使用0.05 mol/L的鹽酸水溶液分別采用振蕩提取3 min和30 ℃超聲提取15 min兩種提取方法,二者提取效果無(wú)顯著差異,結(jié)果見圖3,因此提取方法選擇用時(shí)短、簡(jiǎn)單快捷的振蕩提取法。

2.4.2提取液原液的基質(zhì)影響考察

取6份干燥恰特草樣品,每份100 mg,其中3份樣品的加標(biāo)水平為去甲麻黃堿20 mg/kg、去甲偽麻黃堿300 mg/kg、卡西酮200 mg/kg、甲卡西酮0.8 mg/kg、乙卡西酮0.4 mg/kg,用1 mL 0.05 mol/L的鹽酸水溶液對(duì)3份恰特草加標(biāo)樣品及3份未加標(biāo)樣品進(jìn)行提取。取300 μL上清液,加入700 μL乙腈,混勻,用0.1%甲酸水溶液稀釋5倍、10倍、100倍、500倍,參照1.3節(jié)的色譜-質(zhì)譜條件分別檢測(cè)甲卡西酮、乙卡西酮、去甲麻黃堿、卡西酮和去甲偽麻黃堿。

圖 4 凈化前恰特草樣品中卡西酮二級(jí)質(zhì)譜分析特征離子對(duì) (150.0913/117.0573)的提取離子色譜圖及碰撞能為25 eV下卡西酮和兩種卡西酮類似物的二級(jí)質(zhì)譜圖 Fig. 4 Extracted ion chromatogram of characteristic ion pair (150.0913/117.0573) of cathinone and secondary mass spectra of cathinone and two cathinone analogues with collision energy 25 eV in khat sample before purify 1. cathinone; 2,3. other configuration.

加標(biāo)回收率通過(guò)如下公式計(jì)算:加標(biāo)回收率=(加標(biāo)樣品生物堿測(cè)定值-未加標(biāo)樣品生物堿測(cè)定值)/標(biāo)準(zhǔn)添加量×100%。由于稀釋倍數(shù)不同,5種化合物加標(biāo)回收率受基質(zhì)效應(yīng)的影響存在差異,5種生物堿的加標(biāo)回收率為120.6%～146.8%。同時(shí)提取液中有2種其他卡西酮類似物存在,其二級(jí)質(zhì)譜碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)和相對(duì)豐度與卡西酮相同,但色譜保留時(shí)間存在較大差異,結(jié)果見圖4。

綜上,為去除雜質(zhì)成分,減少對(duì)色譜柱和離子源的污染,降低基質(zhì)效應(yīng),提升定量分析的準(zhǔn)確性,消除卡西酮類似物對(duì)恰特草中卡西酮成分定性定量分析的干擾,需建立并優(yōu)化提取液的凈化方法。

2.5 樣品凈化條件的優(yōu)化

5種生物堿成分均為水溶性生物堿[46],在酸性條件下為離子狀態(tài),易溶于水,不溶于非極性有機(jī)溶劑,在堿性條件下為分子狀態(tài),易溶于極性有機(jī)溶劑。實(shí)驗(yàn)利用生物堿的溶解特性通過(guò)溶劑萃取法實(shí)現(xiàn)恰特草提取液的凈化。

2.5.1NaOH溶液添加量的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中用1 mL二氯甲烷凈化提取液,去除色素、甾醇和其他極性較弱的小分子化合物;加入1 mol/L NaOH溶液,調(diào)節(jié)pH值,使5種生物堿成分轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿訝顟B(tài),并使提取液中的大分子蛋白質(zhì)發(fā)生變性,生成絮狀沉淀。本文考察了不同體積(0、30、40、50、60、70、80、90、100 μL)的1 mol/L NaOH溶液對(duì)測(cè)定恰特草中5種生物堿含量的影響,結(jié)果顯示,NaOH溶液的最佳添加量為80 μL,見圖5。凈化完成后用乙腈萃取提取液,加入固體NaCl使乙腈和水分層,取上清液,利用0.1%甲酸水溶液稀釋,參照1.3節(jié)中的色譜-質(zhì)譜條件檢測(cè),結(jié)果顯示,該方法消除了卡西酮類似物對(duì)恰特草中卡西酮成分定性定量分析的干擾,見圖6。

圖 5 不同體積1 mol/L NaOH溶液凈化后恰特草中5種生物堿成分的測(cè)定值Fig. 5 Measured values of the five alkaloids in khat under different volumes of 1 mol/L NaOH solution

圖 6 凈化后的恰特草樣品中5種生物堿的提取離子色譜圖Fig. 6 Extracted ion chromatograms of the five alkaloids in the purified khat sample Characteristic ion pairs: a. 152.1070/134.0964 for norephedrine and norpseudoephedrine, 150.0913/117.0573 for cathinone; b. 164.107/146.0964 for methcathinone, 178.1226/160.1121 for ethcathinone. Peak identifications: 1. norephedrine; 2. norpseudoephedrine; 3. cathinone; 4. methcathinone; 5. ethcathinone.

2.5.2凈化對(duì)生物堿回收率及樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響

凈化后恰特草中5種生物堿成分的測(cè)定值低于凈化前,為評(píng)價(jià)凈化效果,明確測(cè)定值降低的原因,實(shí)驗(yàn)探究了凈化過(guò)程對(duì)生物堿回收率及樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響。

凈化過(guò)程對(duì)生物堿回收率的影響:用0.05 mol/L的鹽酸水溶液配制3份1 mL質(zhì)量濃度為600 μg/L的5種生物堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。參照1.3節(jié)中條件提取檢測(cè),5種生物堿回收率為98.1%～104.3%。

凈化過(guò)程對(duì)樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響:制備6份恰特草加標(biāo)樣品和6份未加標(biāo)樣品,取3份恰特草加標(biāo)樣品和3份未加標(biāo)樣品參照1.3節(jié)中的方法提取檢測(cè),5種生物堿成分的加標(biāo)回收率為92.8%～108.6%。另取3份恰特草加標(biāo)樣品和3份未加標(biāo)樣品,除不采用二氯甲烷凈化外,參照1.3節(jié)中的條件提取檢測(cè),5種生物堿成分的加標(biāo)回收率為115.4%～129.6%。

結(jié)果顯示,凈化過(guò)程對(duì)5種生物堿的回收率無(wú)顯著影響。使用NaOH溶液除去大分子蛋白質(zhì),樣品仍存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng),使用二氯甲烷能有效去除部分色素、甾醇和其他極性較弱的小分子化合物,與NaOH溶液同時(shí)使用,能有效減弱樣品的基質(zhì)效應(yīng)。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1線性范圍、檢出限及定量限

將1、5、10、20、25、50、75、100、150、200 μg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液參照1.3節(jié)的色譜-質(zhì)譜條件檢測(cè),以定量離子色譜峰面積為縱軸(y),化合物的質(zhì)量濃度為橫軸(x),利用Agilent MassHunter Quantitative Analysis B.07.01 (for Q-TOF)軟件繪制工作曲線,依據(jù)恰特草中5種生物堿的含量,選取合適的線性范圍,計(jì)算相關(guān)系數(shù)(r2),5種生物堿的相關(guān)系數(shù)均≥0.997 6。

利用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00軟件以peak to peak的方式計(jì)算信噪比,以目標(biāo)化合物的信噪比等于3(S/N=3)確定該化合物的檢出限,以S/N=10確定該化合物的定量限。檢出限為0.08～0.75 μg/L,定量限為0.25～2.50 μg/L,滿足恰特草的檢驗(yàn)鑒定要求。5種生物堿成分的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限見表2。

表 2 5種生物堿成分的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

表 3 兩份恰特草樣品中5種生物堿成分的加標(biāo)回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.6.2加標(biāo)回收率與方法精密度

在方法實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)不同恰特草中生物堿成分的含量存在差異。因此另取A、B兩份生物堿含量差異較大的干燥恰特草樣品評(píng)價(jià)加標(biāo)回收率和方法精密度。

取12份A組干燥恰特草樣品,每份100 mg,其中6份加標(biāo)水平為去甲麻黃堿20.0 mg/kg、去甲偽麻黃堿300.0 mg/kg、卡西酮200.0 mg/kg、甲卡西酮0.8 mg/kg、乙卡西酮0.4 mg/kg;取12份B組干燥恰特草樣品,每份100 mg,其中6份加標(biāo)水平為去甲麻黃堿20.0 mg/kg、去甲偽麻黃堿500.0 mg/kg、卡西酮30.0 mg/kg、甲卡西酮0.2 mg/kg、乙卡西酮0.2 mg/kg。參照1.3節(jié)中的條件提取檢測(cè)。參照公式(1)計(jì)算恰特草中生物堿的含量,由于前處理過(guò)程中1 mL提取液中僅有300 μL提取液用于進(jìn)一步凈化檢測(cè),因此公式中需對(duì)恰特草質(zhì)量乘以系數(shù)0.3,計(jì)算加標(biāo)回收率,結(jié)果見表3。5種生物堿成分的添加回收率為90.7%～105.2%,該方法擁有良好的提取效果,且凈化過(guò)程能有效減弱樣品基質(zhì)效應(yīng),滿足恰特草中生物堿成分的提取檢測(cè)要求。

(1)

式中:ω為生物堿含量(mg/kg);V為提取溶液體積(L);D為上清液稀釋倍數(shù);C為利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的稀釋液中生物堿成分的質(zhì)量濃度(μg/L);M為干燥恰特草質(zhì)量(g)。

儀器精密度實(shí)驗(yàn):對(duì)同一瓶提取液6次連續(xù)進(jìn)樣,計(jì)算測(cè)定結(jié)果的平均值及RSD;日內(nèi)方法精密度實(shí)驗(yàn):一天內(nèi)不同時(shí)間對(duì)A、B兩份干燥恰特草各重復(fù)6次實(shí)驗(yàn);日間方法精密度實(shí)驗(yàn):由3名實(shí)驗(yàn)員在6天內(nèi)重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次。實(shí)驗(yàn)儀器精密度為0.5%～2.3%,日內(nèi)方法精密度為1.0%～2.5%,日間方法精密度為1.3%～3.3%,方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性,見表4。

2.7 實(shí)際樣品檢驗(yàn)

為檢驗(yàn)提取檢測(cè)方法和檢測(cè)結(jié)果的可靠性,參照1.3節(jié)中的提取檢測(cè)方法對(duì)國(guó)家林業(yè)局森林公安司法鑒定中心受理的15份干燥恰特草檢材進(jìn)行檢測(cè),15份干燥恰特草檢材均檢出去甲麻黃堿、去甲偽麻黃堿、卡西酮、甲卡西酮、乙卡西酮5種生物堿成分,說(shuō)明該方法適用于干燥恰特草中生物堿成分的檢測(cè)。

表 4 兩份恰特草樣品中5種生物堿的含量及實(shí)驗(yàn)儀器精密度、日內(nèi)方法精密度、日間方法精密度

3 結(jié)論

本研究基于溶劑萃取-高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法建立了干燥恰特草中卡西酮等5種生物堿成分的提取檢測(cè)方法。通過(guò)優(yōu)選提取溶劑種類、優(yōu)化凈化條件和色譜-質(zhì)譜條件,除去了提取液中的雜質(zhì)成分,減少了樣品分析對(duì)離子源和色譜柱的污染,減弱了樣品基質(zhì)效應(yīng),實(shí)現(xiàn)了5種生物堿的同時(shí)檢測(cè)。經(jīng)實(shí)際樣品分析驗(yàn)證,該方法凈化效果好,定量準(zhǔn)確,靈敏度高,重復(fù)性好,能夠滿足恰特草的理化檢驗(yàn)鑒定要求,并確認(rèn)去甲麻黃堿、去甲偽麻黃堿、卡西酮、甲卡西酮和乙卡西酮5種精神活性成分普遍存在于干燥恰特草中,為恰特草的理化檢驗(yàn)鑒定提供參考,并為恰特草中未知精神活性成分的發(fā)現(xiàn)和研究提供指引。