白花蛇舌草降低胃癌細(xì)胞化療耐藥的機(jī)制

王 輝 ,張純宣 ,田 林 ,蔣新猛 ,柴 杰

1.聊城市傳染病醫(yī)院普外科,聊城 252000;2.山東省腫瘤防治研究所省醫(yī)科院,濟(jì)南 250000

胃癌是臨床常見的消化道癌癥,可并發(fā)幽門梗阻及消化道出血,造成頭暈、嘔吐,癌腫穿孔后會形成胃腸瘺及急性彌漫性腹膜炎[1-2]。根治性切除術(shù)是胃癌的首選治療手段,早中期患者預(yù)后良好,對于進(jìn)展期及晚期患者,以順鉑為主的化療仍是最有效的治療方式,但耐藥會嚴(yán)重影響治療效果[3]。白花蛇舌草是我國常見的1年生草本中草藥,具有抗炎、抗氧化、抗蛇毒及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種生物學(xué)活性,研究發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草可使細(xì)胞增殖周期停滯,抑制人胃癌細(xì)胞增殖,從而發(fā)揮抗腫瘤活性[4]。本研究通過建立人胃癌SGC-7901細(xì)胞順鉑耐藥模型,研究白花蛇舌草對其化療耐藥的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Accuri C6流式細(xì)胞儀(美國BD公司);Infinite M1000酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

1.2 試藥

白花蛇舌草注射液(規(guī)格為2 mL,修正藥業(yè)集團(tuán)長春高新制藥有限公司);順鉑注射液(規(guī)格為20 mg,南京制藥廠有限公司);信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)/神經(jīng)源性基因Notch同源蛋白1(neurogeic gene Notch homo-log 1,Notch 1)軸激活劑Jagged1蛋白(上海戶實(shí)醫(yī)藥科技有限公司);四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]試劑盒、熒光標(biāo)記2-脫氧葡萄糖{2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diaxol-4-yl)amino]-2-deoxyglucose,2-NBDG}檢測試劑盒、乳酸檢測試劑盒,均購自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司;膜連蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)細(xì)胞凋亡試劑盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司];電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)液試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);兔抗人STAT3、Notch1一抗,均購自日本MBL公司。

1.3 細(xì)胞系

人胃癌SGC-7901細(xì)胞系,購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將人胃癌SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基(含胎牛血清、青霉素100 u·mL-1、鏈霉素0.1 mg·mL-1),在37 ℃體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳環(huán)境下培養(yǎng),待其穩(wěn)定傳代,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 建立SGC-7901細(xì)胞順鉑耐藥模型

取對數(shù)期SGC-7901細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基,用質(zhì)量濃度遞增法體外誘導(dǎo),更換不同質(zhì)量濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2 μg·mL-1)順鉑溶液,每天剔除死亡細(xì)胞繼續(xù)傳代,持續(xù)1周,待細(xì)胞可穩(wěn)定存活,表明耐藥性誘導(dǎo)成功。

2.3 MTT法檢測耐藥細(xì)胞的增殖抑制率

取對數(shù)期SGC-7901及SGC-7901耐藥細(xì)胞,置于RPMI1640培養(yǎng)基(分別含順鉑2、4、8、16、32 μg·mL-1)中培養(yǎng)48 h,孔內(nèi)加入5.00 g·L-1MTT溶液20 μL,靜置2 h,棄上清,加入DMSO溶液150 μL,搖床振蕩,用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度值(A),計(jì)算二者的增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=[(1-各質(zhì)量濃度A值/對照孔A值)]×100%,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2.4 細(xì)胞分組及干預(yù)

取對數(shù)期SGC-7901耐藥細(xì)胞,用PBS洗滌,用胰酶消化重懸,以1×106個(gè)·mL-1接種至6孔板,待細(xì)胞融合貼壁,隨機(jī)分為耐藥組、白花蛇舌草組、激活劑組、聯(lián)合組。耐藥組不處理,白花蛇舌草組加入白花蛇舌草注射液(50 μg·mL-1終質(zhì)量濃度),激活劑組加入Jagged1蛋白(500 ng·mL-1),聯(lián)合組加入白花蛇舌草注射液(50 μg·mL-1)與Jagged1蛋白(500 ng·mL-1)[5-6]。干預(yù)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 MTT法檢測順鉑對細(xì)胞的增殖抑制率

取干預(yù)處理后的各組細(xì)胞,同2.3操作,計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=[(1-各質(zhì)量濃度A值/對照孔A值)×100%。繪制標(biāo)準(zhǔn)A曲線,計(jì)算IC50。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

取干預(yù)處理后的各組細(xì)胞,用PBS洗滌,用胰酶消化重懸,以1×106個(gè)·mL-1接種至6孔板,用RPMI1640培養(yǎng)液(含順鉑8 μg·mL-1)培養(yǎng)48 h,用PBS洗滌,冰上離心8 min(3 000 r·min-1,離心半徑為10 cm),binding buffer液標(biāo)記細(xì)胞,再加入AnnexinV-FITC、PI各5 μL,二次染色,遮光保存20 min,用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況,并計(jì)算凋亡率。

2.7 細(xì)胞葡萄糖攝取率的檢測

取干預(yù)處理后的各組細(xì)胞,用PBS洗滌,用胰酶消化重懸,以1×106個(gè)·mL-1接種至24孔板,24 h后加入2-NBDG(100 μmol·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)1 h,用PBS洗滌,用胰酶消化重懸,PI染色,用流式細(xì)胞儀檢測2-NBDG熒光表達(dá)量,計(jì)算相對葡萄糖攝取率。相對葡萄糖攝取率(%)=(各組2-NBDG熒光表達(dá)量/耐藥組2-NBDG熒光表達(dá)量)×100%。

2.8 細(xì)胞乳酸含量的檢測

取干預(yù)處理后的各組細(xì)胞,用PBS洗滌,用胰酶消化重懸,以1×106個(gè)·mL-1接種至24孔板,24 h后加入RIPA裂解細(xì)胞,冰上離心10 min(10 000 r·min-1,離心半徑為12 cm),取上清,用試劑盒檢測乳酸含量。蒸餾水調(diào)零后測定530 nm處的A值。計(jì)算細(xì)胞乳酸含量。細(xì)胞乳酸含量=(各組吸光度值-空白吸光度值)/(對照品A值-空白A值)×對照品質(zhì)量濃度×稀釋比例。計(jì)算各組相對乳酸含量,細(xì)胞相對乳酸含量=各組細(xì)胞乳酸含量/耐藥組細(xì)胞乳酸含量。

2.9 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)量

取干預(yù)處理后的各組細(xì)胞,用RIPA裂解細(xì)胞并移至離心管內(nèi),冰上離心10 min(10 000 r·min-1,離心半徑為12 cm),用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法測定總蛋白并定量。取40 μg待測樣本,混合4倍體積上樣緩沖液,金屬浴變性蛋白,同法離心,取上清,電壓80 V行凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)至PVFD膜,用BSA封閉液封閉2 h,加入兔抗人STAT3、Notch1一抗(1∶500),置于4 ℃冰箱中冷藏過夜,TBST洗膜,加入二抗(1∶2 000),搖床孵育2 h,TBST洗膜,浸入ECL液發(fā)光,暗室顯影,凝膠成像分析儀掃描分析條帶灰度值,計(jì)算細(xì)胞蛋白表達(dá)量。STAT3、Notch1蛋白表達(dá)量=Notch1、STAT3蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH條帶灰度值。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)的分析、處理用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0,以(x±s)表示計(jì)量資料,以單因素方差分析比較多樣本資料,兩兩樣本資料比較用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 順鉑對耐藥細(xì)胞的增殖抑制率及IC50值影響的比較

多質(zhì)量濃度順鉑對SGC-7901、SGC-7901耐藥細(xì)胞的增殖抑制率及IC50值細(xì)胞間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);不同質(zhì)量濃度順鉑對SGC-7901耐藥細(xì)胞的增殖抑制率高于SGC-7901細(xì)胞,IC50值低于SGC-7901細(xì)胞(P<0.05)。見表1。

表1 多質(zhì)量濃度順鉑對耐藥細(xì)胞增殖抑制率的比較(x±s,n=5)

順鉑對SGC-7901細(xì)胞的IC50為(5.98±1.14) μg·mL-1,對SGC-7901耐藥細(xì)胞的IC50為(13.44±2.61) μg·mL-1,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.2 順鉑對細(xì)胞的增殖抑制率及IC50值影響的比較

與耐藥組比較,白花蛇舌草組各質(zhì)量濃度細(xì)胞增殖抑制率升高,IC50降低,激活劑組細(xì)胞增殖抑制率均降低,IC50升高(P<0.05);與白花蛇舌草組比較,聯(lián)合組細(xì)胞增殖抑制率降低,IC50升高(P<0.05);與激活劑組比較,聯(lián)合組細(xì)胞增殖抑制率升高,IC50降低(P<0.05)。見表2。耐藥組、白花蛇舌草組、激活劑組及聯(lián)合組IC50值分別為(15.98±3.51)、(3.14±0.42)、(29.98±4.01)、(6.71±0.85) μg·mL-1,白花蛇舌草組低于耐藥組,激活劑組高于耐藥組(P<0.05),而聯(lián)合組高于白花蛇舌草組,低于激活劑組(P<0.05)。

表2 多質(zhì)量濃度順鉑對各組細(xì)胞增殖抑制率的比較(x±s,n=5)

3.3 各組細(xì)胞凋亡率的比較

與耐藥組比較,白花蛇舌草組的凋亡率升高(P<0.05),激活劑組降低(P<0.05);與白花蛇舌草組比較,聯(lián)合組的凋亡率降低(P<0.05);與激活劑組比較,聯(lián)合組的凋亡率升高(P<0.05)。見表3、圖1。

注:A.耐藥組;B.白花蛇舌草組;C.激活劑組;D.聯(lián)合組。

表3 各組細(xì)胞凋亡率的比較

3.4 各組細(xì)胞葡萄糖攝取率的比較

與耐藥組比較,白花蛇舌草組的葡萄糖攝取率降低(P<0.05),激活劑組的葡萄糖攝取率升高(P<0.05);與白花蛇舌草組比較,聯(lián)合組的葡萄糖攝取率升高(P<0.05);與激活劑組比較,聯(lián)合組的葡萄糖攝取率降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組細(xì)胞葡萄糖攝取率的比較 (x±s,n=5)

3.5 各組細(xì)胞相對乳酸含量的比較

與耐藥組比較,白花蛇舌草組的相對乳酸含量降低(P<0.05),激活劑組的相對乳酸含量升高(P<0.05);與白花蛇舌草組比較,聯(lián)合組的相對乳酸含量升高(P<0.05);與激活劑組比較,聯(lián)合組的相對乳酸含量降低(P<0.05)。見表5。

表5 各組細(xì)胞相對乳酸含量的比較

3.6 各組細(xì)胞STAT3、Notch1蛋白表達(dá)水平的比較

與耐藥組比較,白花蛇舌草組STAT3、Notch1蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.05),激活劑組STAT3、Notch1蛋白的表達(dá)水平升高(P<0.05);與白花蛇舌草組比較,聯(lián)合組STAT3、Notch1蛋白的表達(dá)水平升高(P<0.05);與激活劑組比較,聯(lián)合組STAT3、Notch1蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表6、圖2。

注:A.耐藥組;B.白花蛇舌草組;C.激活劑組;D.聯(lián)合組。

表6 各組細(xì)胞STAT3、Notch1蛋白的表達(dá)水平的比較

4 討論

不良飲食習(xí)慣是胃癌的主要危險(xiǎn)因素,食用高鹽食物、熏制品、發(fā)霉食物均會誘發(fā)胃癌,幽門螺旋桿菌感染、慢性胃部疾病亦是其發(fā)病誘因[7-8]。由于我國胃鏡篩查覆蓋率低、檢查過程引起患者不適及患者對早期癥狀不重視等因素,多數(shù)患者臨床確診時(shí)已分期較晚,僅能用化療治療,但癌細(xì)胞可提升自身順鉑耐受、修復(fù)自身DNA損傷,使一線順鉑方案失敗,極大降低治療效果[9-10]。因此,探尋提高胃癌細(xì)胞順鉑敏感性的輔助新藥物是治療胃癌的關(guān)鍵。

糖酵解是腫瘤細(xì)胞常見的代謝方式,可將細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)分解并產(chǎn)生乳酸,從而獲得更多能量,其強(qiáng)度與腫瘤生長及轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)[11]。中醫(yī)對胃癌認(rèn)識已久,根據(jù)癥候特點(diǎn)將其歸為“胃脘痛、伏梁、噎膈、積聚”等范疇,乃本虛標(biāo)實(shí)之證,其主要病機(jī)為飲食無度、胃寒脾弱、正氣不足、寒氣蓄積、胃失和降、脾虛不運(yùn),以致氣機(jī)失常、血瘀不散、邪積熱毒,日久發(fā)為積聚,順鉑乃攻伐之藥,雖可抑癌,但亦加劇脾胃損傷,故配合化療用藥應(yīng)以養(yǎng)胃健脾、清熱解毒、活血通絡(luò)為主[12-13]。白花蛇舌草又稱蛇總管,是茜草科植物白花蛇舌草的全草,性涼,味微苦、微甘,歸胃經(jīng)、大腸經(jīng)、小腸經(jīng),可解毒、活血、止痛,治毒蛇咬傷、腸炎、癌腫[14]。白花蛇舌草含有黃酮類、蒽醌類、萜類等多種抗癌物質(zhì),有研究結(jié)果顯示,其可調(diào)控血清炎癥因子,降低癌細(xì)胞的活力與抗性,抑制異種移植結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,表明白花蛇舌草可作為消化系統(tǒng)惡性腫瘤潛在增敏及治療藥物[15]。本研究結(jié)果顯示,與耐藥組比較,白花蛇舌草組各質(zhì)量濃度細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率升高,IC50、葡萄糖攝取率、相對乳酸含量降低,表明白花蛇舌草可降低胃癌細(xì)胞順鉑耐藥、促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡、減弱胃癌細(xì)胞糖酵解。

STAT3是在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一種DNA結(jié)合蛋白,可與相應(yīng)因子受體結(jié)合形成聚合體,參與下游效應(yīng)因子轉(zhuǎn)錄[16-17]。Notch通路是細(xì)胞自我更新的重要信號通路,在細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過程中扮演著重要角色,其中Notch1受體與其配體結(jié)合后,在酶的作用下分解出Notch胞內(nèi)段,與胞核靶基因結(jié)合,促進(jìn)下游效應(yīng)蛋白合成,與STAT3蛋白共同作用,促進(jìn)細(xì)胞癌變,提升腫瘤細(xì)胞耐藥性[18-19]。ALSHAER W等[20]研究發(fā)現(xiàn),抑制STAT3、Notch1蛋白的表達(dá)可增強(qiáng)乳腺癌MCF7細(xì)胞對多柔比星的敏感性,降低其化療耐藥性。本研究結(jié)果顯示,與耐藥組比較,白花蛇舌草組STAT3、Notch1蛋白的表達(dá)水平降低,且在白花蛇舌草基礎(chǔ)上增用STAT3/Notch軸激活劑Jagged1,可減弱白花蛇舌草對胃癌細(xì)胞的化療增敏作用,表明白花蛇舌草可能通過介導(dǎo)該軸降低胃癌細(xì)胞的化療耐藥性。

綜上所述,白花蛇舌草可提高順鉑對胃癌細(xì)胞的增殖抑制率,減弱糖酵解并促進(jìn)其凋亡,降低胃癌細(xì)胞化療耐藥,其作用機(jī)制可能與抑制STAT3/Notch軸的活性有關(guān)。