表面等離體共振成像用于細(xì)菌分析與檢測(cè)的研究進(jìn)展

馬騰飛,喻肖瑤,趙天濤,吳 進(jìn),封 麗

(1.重慶市生態(tài)環(huán)境科學(xué)研究院 水環(huán)境工程技術(shù)創(chuàng)新中心, 重慶 401147;2.重慶工商大學(xué) 國(guó)家智能制造服務(wù)國(guó)際科技合作基地, 重慶 400067;3.重慶理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 重慶 400054)

0 引言

自1982年Liedeberg等證明了表面等離體共振(surface plasmon resonance,SPR)作為一種光學(xué)生物傳感器的效用以來(lái)[1],SPR技術(shù)在生物傳感器領(lǐng)域得到了快速的發(fā)展和應(yīng)用。SPR傳感器在生物分子相互作用研究方面具有用樣量少、無(wú)損免標(biāo)記和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的優(yōu)勢(shì)。因此,SPR生物傳感器在基礎(chǔ)生物學(xué)研究[2-5]、藥物發(fā)現(xiàn)和臨床診斷[6-8]、環(huán)境和農(nóng)業(yè)監(jiān)測(cè)[9-11]中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

SPR成像技術(shù)(surface plasmon resonance imaging,SPRI),也被稱為“SPR顯微鏡”[12],由Rothenh?usler等[13]在1988年首次提出,隨后相關(guān)領(lǐng)域研究獲得了快速增長(zhǎng)[14-15]。與傳統(tǒng)的SPR生物傳感器相比,SPRI提供的是傳感器芯片表面區(qū)域的平均共振信號(hào)隨時(shí)間的變化情況。利用SPRI技術(shù)可以研究芯片表面的特定區(qū)域(regions of interest,ROI),通過(guò)成像設(shè)備(通常是CCD或CMOS相機(jī))記錄芯片表面的SPR圖像。因此,當(dāng)芯片表面設(shè)計(jì)有大量的ROI(如微陣列)時(shí),可以實(shí)現(xiàn)高通量的分析。此外,在SPRI系統(tǒng)中引入透鏡[16-18](通常在棱鏡和相機(jī)之間),或者用高數(shù)值孔徑物鏡代替棱鏡[19-21]時(shí),可以獲得芯片表面的高空間分辨率圖像。

SPRI的優(yōu)點(diǎn)使其不僅可以用于生物分子研究,如蛋白質(zhì)[22-23]、DNA[24-25]、RNA[26-27],而且可以用于人體細(xì)胞研究,如細(xì)胞生理變化與表面的相互作用,以及細(xì)胞感應(yīng)等[28]。然而,相比生物分子和人體細(xì)胞研究領(lǐng)域,在與人類(lèi)生產(chǎn)生活和生命健康關(guān)聯(lián)緊密的細(xì)菌研究領(lǐng)域,SPRI的應(yīng)用進(jìn)展相對(duì)緩慢和有限。其主要原因可能是樣品復(fù)雜的處理要求和潛在的儀器污損問(wèn)題[28]。隨著近些年來(lái)SPRI技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步,SPRI技術(shù)用于細(xì)菌領(lǐng)域的研究也不斷增多。

為了引起更多相關(guān)領(lǐng)域研究人員的興趣和關(guān)注,展示SPRI技術(shù)在細(xì)菌分析與檢測(cè)領(lǐng)域的良好應(yīng)用前景,總結(jié)了過(guò)去十年中涉及細(xì)菌領(lǐng)域的相關(guān)SPRI研究,主要包括SPRI的基本原理介紹,SPRI用于單細(xì)菌行為和生物膜分析方面的研究,以及SPRI在細(xì)菌檢測(cè)與鑒定方面的應(yīng)用情況。同時(shí)對(duì)SPRI技術(shù)未來(lái)在細(xì)菌分析與檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用提出了展望,以期為SPRI技術(shù)進(jìn)一步應(yīng)用于細(xì)菌研究相關(guān)領(lǐng)域提供參考。

1 SPRI原理簡(jiǎn)介

當(dāng)外部光以一定條件入射在金屬表面,并在金屬/電介質(zhì)界面上誘導(dǎo)金屬的自由電子振蕩產(chǎn)生共振時(shí),就會(huì)發(fā)生SPR現(xiàn)象。因此,在一定的入射角度下,金屬吸收了輻射能量并顯示出反射率的最小值。這個(gè)共振角對(duì)與金屬表面(通常在垂直方向300 nm內(nèi))接觸的電介質(zhì)(即實(shí)驗(yàn)中的樣品)的折射率極為敏感。當(dāng)共振角固定時(shí),樣品的折射率變化導(dǎo)致反射率的變化,這可以在SPR圖像中得到體現(xiàn)。SPRI工作原理見(jiàn)圖1[29]。與傳感表面的折射率分布相對(duì)應(yīng)的反射光被CCD相機(jī)捕捉,并轉(zhuǎn)化為2D強(qiáng)度對(duì)比圖像[29]。

圖1 SPRI工作原理示意圖

2 SPRI用于單個(gè)細(xì)菌研究

2.1 蛋白質(zhì)與單個(gè)細(xì)菌相互作用

當(dāng)與外部配體相互作用時(shí),由于固有的細(xì)胞間的異質(zhì)性,單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的反應(yīng)可能不同。然而,這種異質(zhì)性會(huì)在細(xì)菌群體研究中被忽略了,因?yàn)閷?duì)細(xì)菌群體研究中獲得的數(shù)據(jù)通常是許多細(xì)菌的平均值。SPRI技術(shù)的出現(xiàn)為從單菌水平上測(cè)量配體與細(xì)菌相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)提供了新的思路[30]。通過(guò)將個(gè)體細(xì)菌修飾于SPRI芯片表面,隨后用SPRI系統(tǒng)對(duì)抗體與細(xì)菌的結(jié)合過(guò)程和解離過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè),最后可以從圖像序列提取的反射光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化曲線中獲得詳細(xì)的動(dòng)力學(xué)信息。結(jié)果表明,盡管所獲得的動(dòng)力學(xué)常數(shù)的平均值與體外實(shí)驗(yàn)研究的數(shù)據(jù)水平一致,但在結(jié)合動(dòng)力學(xué)方面存在著較大的細(xì)菌個(gè)體間差異,不同細(xì)菌個(gè)體間的動(dòng)力學(xué)常數(shù)甚至存在著若干個(gè)數(shù)量級(jí)水平的差異,這些差異可能與細(xì)菌表面抗原表達(dá)和分布的不同有關(guān)。這項(xiàng)研究顯示了細(xì)菌與外部配體結(jié)合能力的異質(zhì)性,進(jìn)而表明了SPRI技術(shù)在單個(gè)細(xì)菌水平上探索細(xì)菌生理特性的潛力。

2.2 單個(gè)細(xì)菌活性研究

細(xì)菌由于其自身代謝等生理活動(dòng),附著于物體表面時(shí)會(huì)表現(xiàn)出納米級(jí)別的“抖動(dòng)”行為,常規(guī)的光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡無(wú)法觀察到細(xì)菌的這種行為,而利用SPRI技術(shù)則可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的這種“抖動(dòng)”行為的監(jiān)測(cè)[31-32]。Syal等[31]通過(guò)觀察營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和不同抗生素作用下細(xì)菌在SPRI芯片表面的“抖動(dòng)”情況,證明細(xì)菌在芯片表面垂直方向上的振幅變化可以用來(lái)表征細(xì)菌活性變化,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌活性的實(shí)時(shí)快速判定?；诖?SPRI技術(shù)可以作為一種快速的抗生素敏感性測(cè)試方法[31],較傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法節(jié)省大量時(shí)間。類(lèi)似地,Liu等[32]采用SPRI方法來(lái)監(jiān)測(cè)水中存在不同化學(xué)物質(zhì)時(shí)單個(gè)細(xì)菌的活性,從而快速評(píng)估化學(xué)物質(zhì)的急性毒理作用。因此,SPRI技術(shù)可以作為一種實(shí)時(shí)快速檢測(cè)細(xì)菌活性的技術(shù)手段,從而用于抗菌藥物研發(fā)和物質(zhì)毒性毒理方面的研究。

3 SPRI用于細(xì)菌生物膜研究

生物膜是細(xì)菌存在的一種常見(jiàn)形式,在細(xì)菌感染、細(xì)菌抗藥性和廢水處理等領(lǐng)域都有大量研究。傳統(tǒng)的生物膜研究方式主要集中于生物膜生物量、表面形貌結(jié)構(gòu),由于技術(shù)手段要求,在取樣備樣過(guò)程中可能對(duì)生物膜結(jié)構(gòu)或細(xì)菌活性構(gòu)成損傷,且難以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)觀測(cè)。SPRI技術(shù)的出現(xiàn)為生物膜研究提供了一個(gè)新的視角。

通過(guò)對(duì)芯片表面進(jìn)行修飾模擬生物膜附著生長(zhǎng)的基底表面,根據(jù)細(xì)菌在芯片表面附著生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生的光強(qiáng)信號(hào)變化,SPRI技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)芯片表面細(xì)菌附著情況和生物膜形成過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。Abadian等首次使用SPRI對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞的生物膜形成和清除過(guò)程進(jìn)行觀察[33],并用SPRI檢驗(yàn)了牛血清蛋白和酪蛋白作為表面涂層對(duì)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜形成的預(yù)防效果[34]。類(lèi)似地,Aninwene等[35]利用SPRI分別觀察了金黃色葡萄球菌在修飾有糖蛋白潤(rùn)滑素(LUB)涂層的芯片和修飾有牛頜下腺粘蛋白(BSM)涂層的芯片表面的附著和成膜能力,結(jié)果表明金黃色葡萄球菌在LUB涂層表面的附著和成膜能力下降90%以上,在BSM表面僅下降7%左右。這些研究充分展現(xiàn)了SPRI技術(shù)在生物膜研究和抗生物膜材料研發(fā)方向的良好應(yīng)用前景。

4 SPRI用于細(xì)菌定性/定量檢測(cè)

對(duì)環(huán)境樣品或指定樣品中的細(xì)菌進(jìn)行定性鑒定和/或定量檢測(cè),在污染防治、食品安全和醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域均具有重要意義。SPRI技術(shù)由于其用樣量少、可以實(shí)時(shí)快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì),已在細(xì)菌鑒定和檢測(cè)方面顯示了巨大潛力?，F(xiàn)有研究報(bào)道中,根據(jù)檢測(cè)時(shí)是否在芯片表面對(duì)細(xì)菌進(jìn)行了一定時(shí)間的培養(yǎng),可將檢測(cè)方法分為非培養(yǎng)檢測(cè)和培養(yǎng)檢測(cè)兩類(lèi)。

4.1 非培養(yǎng)檢測(cè)

非培養(yǎng)檢測(cè)主要利用細(xì)菌的表面特異性實(shí)現(xiàn)。常用的方法包括直接檢測(cè)法和強(qiáng)化檢測(cè)法。直接檢測(cè)法通過(guò)在芯片表面修飾可以捕獲細(xì)菌的抗體或其他物質(zhì),從而將樣品中的細(xì)菌固定在芯片表面,由此產(chǎn)生的SPRI檢測(cè)信號(hào)變化表明細(xì)菌的存在并用于計(jì)算細(xì)菌的數(shù)量。當(dāng)樣品中細(xì)菌含量較低時(shí),直接法檢測(cè)信號(hào)弱,檢出限高,因此其使用較為受限。強(qiáng)化檢測(cè)法是在直接檢測(cè)法的基礎(chǔ)上通過(guò)在捕獲的細(xì)菌表面流過(guò)含有特異性抗體或探針的溶液,實(shí)現(xiàn)對(duì)SPRI檢測(cè)信號(hào)的進(jìn)一步放大。強(qiáng)化法檢出信號(hào)強(qiáng),檢出限低,可以檢出樣品中較低含量的細(xì)菌,因此,得到研究人員的更多關(guān)注。

Yodmongkol等[36]采用強(qiáng)化檢測(cè)法對(duì)溶液中的白色念珠菌進(jìn)行檢測(cè)。首先在SPRI芯片表面修飾一層11-巰基十二烷酸分子層,用于固定白色念珠菌特異性抗體,當(dāng)溶液中的白色念珠菌被芯片表面的抗體捕獲后,再次在溶液中流過(guò)白色念珠菌特異性抗體,從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大。由于使用了針對(duì)白色念珠菌表面特異性抗原的特異性抗體,該方法可以從白色念珠菌、大腸桿菌、變異鏈球菌、金黃色葡萄球菌、β-鏈球菌和干酪乳桿菌的混合樣品中檢測(cè)出白色念珠菌的含量。類(lèi)似地,Puttharugsa等[37]采用強(qiáng)化檢測(cè)法對(duì)植物樣品中致病菌Acidovoraxavenaesubsp.citrulli(Aac)進(jìn)行檢測(cè),在使用多克隆抗體對(duì)SPR信號(hào)進(jìn)行放大后,SPRI系統(tǒng)對(duì)Aac的檢出限可達(dá)5×105CFU/ml。

除了利用細(xì)菌表面特性進(jìn)行檢測(cè),Foudeh等[38]提出利用環(huán)境中細(xì)菌的16s rRNA進(jìn)行定性檢測(cè)。因?yàn)榄h(huán)境中RNA的存在與活細(xì)菌活動(dòng)直接相關(guān),而死亡的細(xì)菌的RNA會(huì)快速降解[39]。Foudeh等[38]采用SPRI技術(shù)對(duì)水體中引發(fā)軍團(tuán)病的Legionellapneumophila細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè),對(duì)L.pneumophila16s rRNA的檢測(cè)方法與細(xì)菌強(qiáng)化檢測(cè)法類(lèi)似,首先在SPRI芯片表面修飾上與L.pneumophila16s rRNA互補(bǔ)的DNA探針,然后將含有目標(biāo)RNA,以及可以與目標(biāo)RNA互補(bǔ)的識(shí)別探針的樣品流過(guò)芯片表面,樣品中的目標(biāo)RNA被DNA探針?biāo)东@,同時(shí)識(shí)別探針也與被捕獲的RNA結(jié)合,而識(shí)別探針上同時(shí)含有可與量子點(diǎn)結(jié)合的基團(tuán),當(dāng)最后含有量子點(diǎn)的溶液加入后,被捕獲的RNA因結(jié)合了量子點(diǎn),產(chǎn)生的SRPI信號(hào)得到進(jìn)一步放大,從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)水環(huán)境樣品中RNA在亞飛摩爾(sub-femtomole)水平上的快速檢出。

4.2 培養(yǎng)檢測(cè)

非培養(yǎng)檢測(cè)法中的直接法由于對(duì)低濃度細(xì)菌樣品檢測(cè)信號(hào)弱而應(yīng)用受限,因此研究人員考慮對(duì)芯片表面捕獲的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng),以增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)。Bouguelia等[40]研究發(fā)現(xiàn),隨著細(xì)菌增殖,SPRI信號(hào)不斷增強(qiáng),可以根據(jù)細(xì)菌濃度變化、細(xì)菌世代時(shí)間、SPRI信號(hào)變化和培養(yǎng)時(shí)間之間的量化關(guān)系,反推出培養(yǎng)初期的細(xì)菌濃度,即樣品中的細(xì)菌濃度。該方法可用于對(duì)Salmonellaenterica,Streptococcuspneumoniae和EscherichiacoliO157∶H7的檢測(cè),檢出限可低至(2.8±19.6)CFU/mL。類(lèi)似地,基于培養(yǎng)檢測(cè)法,Morlay等[41]采用SPRI技術(shù)實(shí)現(xiàn)嬰兒配方粉中的食品病原體克羅諾桿菌和沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè),檢出限可達(dá)30 CFU/25g奶粉;Mondani等[42]實(shí)現(xiàn)對(duì)不同溫度范圍內(nèi)保存的食物樣品中E.coliO157∶H7的有效檢測(cè);Mallevre等[43]則利用SPRI技術(shù)觀察了納米氧化銀壓力下細(xì)菌的生長(zhǎng)情況,實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)毒性檢測(cè)研究。

非培養(yǎng)檢測(cè)方法中的強(qiáng)化檢出法可以獲得較好的檢出限,但使用的抗體普遍較昂貴,因此研究人員也嘗試通過(guò)采用較為經(jīng)濟(jì)的物質(zhì)替代抗體的方式來(lái)降低實(shí)驗(yàn)成本。Bulard等[44]采用碳水化合物修飾到芯片表面以固定細(xì)菌。當(dāng)細(xì)菌被固定到芯片表面后,實(shí)時(shí)記錄生物芯片上細(xì)菌生長(zhǎng)的SPRI信號(hào)。通過(guò)對(duì)細(xì)菌SPRI信號(hào)和對(duì)照信號(hào)處理獲得不同菌株的“差分時(shí)間”,進(jìn)而得到碳水化合物芯片對(duì)不同菌株的指紋圖譜。該方法可以實(shí)現(xiàn)10 h內(nèi)對(duì)5種初始濃度僅為102CFU/mL的大腸桿菌菌株的有效區(qū)分和檢測(cè),在食品安全領(lǐng)域顯示出良好的應(yīng)用前景。

5 結(jié)束語(yǔ)

SPRI技術(shù)具有樣品用量少、實(shí)時(shí)快速和樣品無(wú)損監(jiān)測(cè)/檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn),在環(huán)境、農(nóng)業(yè)、食品安全和醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域的細(xì)菌分析與檢測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景。未來(lái)仍有許多需要深入研究的地方,以進(jìn)一步提高細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)度和細(xì)菌生理機(jī)制等方面研究的深度,以及繼續(xù)降低實(shí)驗(yàn)成本等。相關(guān)的研究方向包括但不限于:① 實(shí)際樣品預(yù)處理方法,如對(duì)影響背景信號(hào)的高鹽度樣品進(jìn)行脫鹽處理;② SPRI芯片的修飾及再生方法,如結(jié)合目標(biāo)菌株表面特性尋找或研發(fā)吸附結(jié)合力強(qiáng)且對(duì)細(xì)菌活性影響較小的芯片修飾物質(zhì),研制廉價(jià)易再生的芯片修飾涂層等;③ SPRI與其他技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用,如與電化學(xué)技術(shù)結(jié)合,檢測(cè)小分子物質(zhì)與細(xì)菌的結(jié)合動(dòng)力學(xué)[45],或是與質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行結(jié)合,探究不同條件下細(xì)菌分泌胞外蛋白和代謝產(chǎn)物情況[46];④ 對(duì)圖像數(shù)據(jù)處理方法進(jìn)行優(yōu)化,如引入計(jì)算機(jī)深度學(xué)習(xí)[47]等算法提升數(shù)據(jù)處理精準(zhǔn)度等。