ERK1/2/PPARα/SCAD信號途徑對生理性和病理性心肌肥大的調(diào)控*

黃秋菊， 黃金賢， 羅佳妮， 劉培慶， 陳少銳， 潘雪刁， 臧林泉， 周四桂△

(1廣東藥學院臨床藥學系，廣東 廣州 510006； 2中山大學藥學院藥理與毒理學實驗室，廣東 廣州 510006)

心肌是耗能最多的組織之一。哺乳動物胚胎期心臟主要以葡萄糖和乳酸作為能源，出生后則為以脂肪酸氧化為主；但在病理性心肌肥大時脂肪酸氧化降低，糖酵解增加，心肌能量代謝發(fā)生“胚胎型轉(zhuǎn)換”[1]。 長期運動訓練可使心肌能量代謝水平與適應(yīng)能力提高，脂肪酸氧化能力增強[2]。深入探討生理性和病理性心肌肥大2種不同的狀態(tài)下心肌細胞的能量代謝特征，將有助于進一步認識生理性與病理性心肌肥大的區(qū)別。

短鏈脂酰輔酶A脫氫酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase，SCAD) 是脂酰輔酶A 脫氫酶家族中的一員，特異性地分解短鏈脂酰輔酶A 底物，是脂肪酸β 氧化的第1個限速步驟，是脂肪酸氧化的關(guān)鍵酶[3]。采用定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)我們比較了16周齡自發(fā)性高血壓大鼠和血壓正常大鼠的心肌蛋白質(zhì)組，首次發(fā)現(xiàn)SCAD在自發(fā)性高血壓大鼠肥大心肌中的表達顯著降低[4]。我們進一步證實生理性心肌肥大模型中SCAD mRNA 和蛋白表達均明顯上調(diào)，而病理性心肌肥大模型中SCAD mRNA和蛋白表達均明顯下調(diào)，二者之間的表達具有顯著差異[5]，此外，我們采用體外苯腎上腺素(phenylephrine, PE)刺激誘導(dǎo)的病理性心肌細胞肥大模型中，SCAD在蛋白及mRNA水平上均顯著下調(diào)，進一步采用RNA干擾技術(shù)，觀察到SCADsiRNA干擾心肌細胞引起SCAD表達下調(diào)的同時，心肌細胞表面積明顯增大，心肌肥大標志物心房鈉尿因子(atrial natriuretic factor, ANF)和腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide, BNP)均明顯上升[6-7]，表明SCAD 表達失調(diào)可能與生理性和病理性心肌肥大的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

研究表明，心肌肥大發(fā)展過程中能量代謝底物的轉(zhuǎn)變與心肌過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)表達的下降及失活有關(guān)[8]。PPARα是核受體超家族成員，也是脂肪酸氧化酶基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控子。研究證實，與野生型小鼠相比，PPARα-/-小鼠心肌中SCAD蛋白表達顯著下調(diào)，且心肌對脂肪酸攝取、氧化能力下降，表明SCAD基因的表達受PPARα調(diào)控[9]。研究報道，PPARα為ERK1/2的下游作用靶點。PE誘導(dǎo)的心肌細胞病理性肥大模型中，激活的ERK1/2使PPARα的表達下調(diào),轉(zhuǎn)錄活性下降[10]。然而，研究表明，心臟生理性肥大時ERK1/2并無激活，與病理性心肌肥大的變化趨勢不一致[11]。

目前認為，蛋白激酶C激活Raf-1，進而激活有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activited protein kinase，MAPK)，MAPK信號通路(ERK1/2通路是其中之一)在心肌肥大中發(fā)揮著重要作用。然而MAPK信號通路在生理性和病理性心肌肥大中的作用尚未明確。本課題從心肌能量代謝的視角來探討生理性和病理性心肌肥大的發(fā)病機制，揭示生理性和病理性心肌肥大的分子調(diào)控機制的不同，豐富對心肌肥大發(fā)病機制的認識，以期為預(yù)測生理性與病理性心肌肥大及其預(yù)后尋找新的分子標志物，并為病理性心肌肥大的治療尋找新的靶點。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和乳鼠心肌細胞培養(yǎng)

RT-PCR測定試劑盒(DRR420A)、TRIzol(9108)和SYBR Green(DRR420S)購于TaKaRa；BCA蛋白定量試劑盒(23225)、Western blotting發(fā)光液(34080)購于Thermo；細胞SCAD活性比色法定量檢測試劑盒購于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；游離脂肪酸測定試劑盒(A042)購于南京建成生物研究所；IGF-1(SRP4121)、PE(P6126)、 單克隆鼠抗PPARα和單克隆鼠抗α-tubulin購于Sigma；單克隆兔抗SCAD購于Abcam;單克隆兔抗p-ERK1/2和單克隆兔抗ERK1/2購于Cell Signaling Technology。

采用本實驗室已建立的乳鼠心肌細胞改良法分離并培養(yǎng)心細胞，取2～3 d SD 乳鼠(廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心) 用胰蛋白酶(Sigma) 冰上消化20 min 后，37 ℃水浴多次消化將乳鼠心臟消化成為單細胞懸液，在差速貼壁分離后，調(diào)節(jié)細胞密度種于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并加入0.1 mmol/L BrdU(Sigma) 抑制成纖維細胞生長。按照上述方法分離制備的心肌細胞，經(jīng)α-actin 抗體的免疫細胞化學染色，純度可達95%以上，符合實驗要求。實驗分為：(1)對照組：正常培養(yǎng)心肌細胞；(2)IGF-1組：加入IGF-1(10 nmol/L)作用24 h;(3)PE組：加入PE(10 μmol/L)作用24 h。

2 方法

2.1心肌細胞表面積的檢測 按照實驗分組處理細胞，收獲細胞后用德國Zeiss(AX10)倒置熒光顯微鏡200倍攝像，各處理組隨機選取3次實驗的10個視野，每個視野約包含10個左右心肌細胞，測量100個心肌細胞的面積，以ImageJ圖像分析軟件分析結(jié)果。

2.2Real-time PCR檢測mRNA的表達 按照TRIzol(TaKaRa)說明書步驟提取細胞或組織總RNA，采用紫外分光光度計檢測RNA樣品的260 nm、280 nm波長下的A值，檢測純度并計算出RNA的濃度。參照TaKaRa有限公司RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將反應(yīng)管放置于PCR儀(Thermo) 中進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。兩步法進行PCR擴增反應(yīng)，按照說明書加入熒光染料(TaKaRa)、序列和RT 產(chǎn)物后在real-time PCR儀(Bio-Rad IQ5)中進行反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù): 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ (1個循環(huán))。具體引物序列見表1[由生工生物工程(上海)有限公司合成]。

表1 Real-time PCR擴增產(chǎn)物引物序列

2.3Western blotting法檢測蛋白表達 提取各組心肌細胞總蛋白，BCA 試劑(Thermo)檢測細胞蛋白含量后調(diào)整上樣量，分裝、變性，配置10% SDS 分離膠和5% 濃縮膠進行電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜(Bio-Rad)，室溫封閉1 h 后加入Ⅰ抗(SCAD，1 ∶1 000；PPARα，1∶1 000；p-ERK1/2，1∶1 000；ERK1/2，1∶1 000；α-tubulin，1∶10 000)，過夜。漂洗后加入Ⅱ抗，室溫孵育1 h，化學發(fā)光試劑增強反應(yīng)，X 線壓片曝光、顯影、定影，結(jié)果采用ImageJ 圖像分析系統(tǒng)對條帶進行分析。

2.4SCAD活性檢測 按照實驗分組處理細胞，收獲細胞后置于冰上裂解30 min，取上清液用BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白。酶活性檢測是基于2,6-二氯靛酚鈉(2,6-dichlorophenol indophenol, DCPIP)作為人工電子受體，替代黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)，在SCAD的作用下，由短鏈脂酰輔酶A提供電子，經(jīng)過硫酸甲酯吩嗪(phenazine methosulphate, PMS)的傳遞，被還原為無色產(chǎn)物，通過分光光度儀的峰值變化(600 nm 波長)，來定量分析SCAD的活性。嚴格按照說明書采用酶標儀法進行檢測。

2.5心肌細胞游離脂肪酸含量測定 游離脂肪酸含量檢測原理是游離脂肪酸能與銅離子結(jié)合形成脂肪酸的銅鹽而溶于氯仿中，其含量與游離脂肪酸含量成正比，用銅試劑測定其中銅離子的含量，即可推算出游離脂肪酸的含量。按照實驗分組處理細胞，收獲細胞后于冰上用手動勻漿器破碎細胞，取上清BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白。嚴格按照游離脂肪酸測定試劑盒(A042)說明書進行檢測，根據(jù)吸光率計算游離脂肪酸含量[nmol/(g protein)]。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD) 表示，采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件處理，組間比較應(yīng)用單因素方差分析。

結(jié) 果

1 各組心肌細胞表面積的變化

由圖1可見，與對照組相比，分別用PE和IGF-1刺激心肌細胞后，心肌細胞的表面積均顯著增大，表明PE和IGF-1都能誘導(dǎo)心肌細胞產(chǎn)生明顯肥大。

Figure 1. Surface area of neonatal rat cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control.

2 各組心肌細胞mRNA表達的變化

由圖2可見，與對照組相比，肥大標志物ANF和BNP都明顯升高，病理性肥大標志物α-骨骼肌肌動蛋白(α-skeletal actin, α-SkA)在PE刺激下明顯升高，而IGF-1刺激無明顯變化，與研究報道的結(jié)果一致[12-14]，這說明PE誘導(dǎo)的病理性肥大模型和IGF-1誘導(dǎo)的生理性肥大模型建立成功。與對照組相比，在PE刺激的心肌細胞中PPARα和SCAD mRNA表達均顯著下調(diào)，而IGF-1刺激的心肌細胞中PPARα和SCAD mRNA表達均顯著上調(diào)。PPARα和SCAD mRNA表達在2種不同心肌肥大模型中表現(xiàn)出明顯的不一致，表明生理性和病理性心肌肥大的發(fā)生發(fā)展可能與PPARα和SCAD的表達失調(diào)有密切關(guān)系。

3 各組心肌細胞蛋白表達的變化

由圖3可見，與對照組相比，PE刺激的心肌細胞中PPARα和SCAD蛋白的表達顯著下降，IGF-1刺激的心肌細胞中PPARα和SCAD蛋白的表達顯著上升，這一變化與PPARα和SCAD mRNA的表達變化一致。然而，與對照組相比，p-ERK1/2蛋白的表達在PE刺激的心肌細胞中顯著增加，在IGF-1刺激的心肌細胞中顯著下降。這表明PE可能通過刺激ERK1/2磷酸化激活抑制PPARα表達，從而抑制下游SCAD表達，引發(fā)病理性心肌肥大的發(fā)生；而IGF-1刺激可能通過引起ERK1/2磷酸化受抑制，使PPARα表達上調(diào)，從而促進SCAD表達增加引發(fā)生理性心肌肥大。

Figure 2. Relative mRNA expression of ANF, BNP, α-SkA, PPARα and SCAD in the myocardial cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control.

Figure 3. The protein expression of PPARα, SCAD and p-ERK1/2 in the myocardial cells.Mean±SD.n=3.*P<0. 05, **P<0. 01 vs control.

4 各組心肌細胞SCAD的酶活性變化

由圖4可見，與對照組相比，PE刺激的心肌細胞SCAD活性顯著減弱，而IGF-1刺激的心肌細胞SCAD活性顯著增強。各組心肌細胞的SCAD活性與其SCAD mRNA和蛋白表達變化趨勢一致。表明在2種不同的心肌肥大中，SCAD不僅在表達量上有不一致的變化，而且酶活性也存在不一致的結(jié)果。

5 各組心肌細胞游離脂肪酸含量的變化

由圖5可見，與對照組相比，PE刺激的心肌細胞中游離脂肪酸含量顯著升高，而IGF-1刺激的心肌細胞中游離脂肪酸含量顯著降低。這表明PE刺激的心肌細胞中SCAD蛋白表達和酶活性減低導(dǎo)致了心肌細胞脂肪酸β氧化能力降低，從而使心肌細胞中游離脂肪酸含量增加；而IGF-1刺激的心肌細胞中SCAD蛋白表達和酶活性增加導(dǎo)致了心肌細胞脂肪酸β氧化能力增強，從而使心肌細胞中游離脂肪酸含量下降。

Figure 4. The activity of SCAD in the myocardial cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control.

Figure 5. The content of free fatty acid in the myocardial cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control.

討 論

運動性心肌肥大本質(zhì)上是心臟對身體負荷的代償性機制, 是對運動訓練的良好適應(yīng)性反應(yīng)，身體訓練對于心臟的負荷作用遠遠小于因持續(xù)性和進行性容量或壓力負荷過重等病理負荷對心臟的影響[15]。高血壓引起的病理性心肌肥大是心臟對急、慢性血流動力學超負荷的一種適應(yīng)性反應(yīng)，是心臟為適應(yīng)長期的壓力或容量負荷而產(chǎn)生的代償性改變，是心力衰竭的前驅(qū)病變。越來越多的研究表明，病理性心肌肥大是臨床上多種心血管疾病發(fā)生率和死亡率增高的一個獨立危險因素[16]。因此，探討生理性與病理性心肌肥大的本質(zhì)區(qū)別，尋找防治病理性心肌肥大的潛在靶點，改善心臟功能，延緩其向心衰發(fā)展，對臨床心血管疾病治療有重要意義。

IGF-1作為一種媒介，參與心臟發(fā)育、心肌肥厚以及對肌肉體積、力量、身體成分的維持和營養(yǎng)代謝調(diào)節(jié)的重要作用。越來越多的證據(jù)表明，IGF-1在心血管系統(tǒng)中具有特殊作用。它可以促進心肌生長，提高心肌收縮力、心輸出量、心室容積并且可以通過刺激收縮和抑制細胞凋亡來維持心臟功能[17]。在誘導(dǎo)心肌細胞肥大的因素中, 神經(jīng)體液因素是一類常見的原因, 其中腎上腺素受體及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是心肌細胞肥大的一個重要因素。本研究中，IGF-1和PE刺激的心肌細胞表面積與對照組相比均顯著增大。同時，在mRNA表達變化研究中，肥大標志物ANF和BNP都明顯升高，而病理性肥大標志物α-SkA在PE刺激下升高，而IGF-1刺激無明顯變化，與研究報道的結(jié)果一致[12-14]。這表明PE誘導(dǎo)的病理性心肌細胞肥大模型和IGF-1誘導(dǎo)的生理性心肌細胞肥大模型都建立成功。

SCAD是脂酰輔酶A 脫氫酶家族中的一員，是脂肪酸氧化的關(guān)鍵酶[3]。本研究中，IGF-1刺激的心肌細胞SCAD mRNA和蛋白表達均顯著上調(diào)，而PE刺激的心肌細胞SCAD mRNA和蛋白表達均顯著下調(diào)，兩者之間存在顯著差異，與蛋白質(zhì)組學的研究結(jié)果一致[4]。這表明SCAD的表達失調(diào)可能與生理性和病理性心肌肥大的發(fā)生發(fā)展密切關(guān)系。同時，IGF-1刺激的心肌細胞SCAD活性明顯增強，游離脂肪酸含量顯著下降，表明IGF-1刺激的心肌細胞中SCAD蛋白表達和酶活性增加可能導(dǎo)致了心肌細胞脂肪酸β氧化能力增強，促進了心肌細胞游離脂肪酸代謝，使心肌細胞中游離脂肪酸含量下降，從而達到心肌細胞能量代謝和功能增強的作用。而PE刺激的心肌細胞SCAD活性明顯減弱，游離脂肪酸含量顯著增高，表明PE刺激的心肌細胞中SCAD蛋白表達和酶活性下降可能導(dǎo)致了心肌細胞脂肪酸β氧化能力減弱，使得心肌細胞對游離脂肪酸利用減少，使心肌細胞中游離脂肪酸含量增加，這種變化引起了心肌細胞能量代謝紊亂和結(jié)構(gòu)改變以及功能的降低。綜上所述，SCAD在2種不同的心肌肥大中具有顯著差異，提示SCAD可能成為區(qū)別生理性和病理性心肌肥大的分子標志物，并且有可能成為病理性心肌肥大的潛在治療靶點。

心肌肥大發(fā)展過程中能量代謝底物的轉(zhuǎn)變與心肌PPARα表達的下降及失活有關(guān)[8]。PPARα是核受體超家族成員，也是脂肪酸氧化酶基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控子。本研究中，IGF-1刺激的心肌細胞PPARα mRNA和蛋白表達均顯著上調(diào)，而PE刺激的心肌細胞PPARα mRNA和蛋白表達均顯著下調(diào)，與SCAD mRNA和蛋白表達變化趨勢相一致。表明PPARα可能調(diào)控SCAD的表達，并且這種表達調(diào)控呈正相關(guān)性。有研究報道，PPARα為ERK1/2的下游作用靶點。同時，在本研究中，p-ERK1/2蛋白的表達在IGF-1刺激的心肌細胞中顯著下降，在PE刺激的心肌細胞中顯著增高，而總ERK1/2在各組間無明顯變化。這表明ERK1/2可能在磷酸化激活后調(diào)控PPARα的表達，并且這種表達調(diào)控呈負相關(guān)性。

綜上所述， IGF-1可能通過刺激心肌細胞中ERK1/2磷酸化受抑制，從而使PPARα表達增加，進一步使SCAD表達和酶活性增加，促使心肌細胞脂肪酸β氧化能力增強，導(dǎo)致生理性心肌肥大；而PE可能通過刺激心肌細胞中ERK1/2磷酸化激活后，從而抑制PPARα表達，進一步使SCAD表達和酶活性降低，導(dǎo)致了心肌細胞脂肪酸β氧化能力減弱，引發(fā)病理性心肌肥大的發(fā)生。本研究揭示了生理性和病理性心肌肥大的分子機制調(diào)控的不同，豐富了對心肌肥大機制的認識。然而，SCAD作為生理性和病理性心肌肥大的分子標志物和病理性心肌肥大的作用靶點的可能仍需要更深入的研究。

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