miR-645靶向STING調(diào)控結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移作用機(jī)制的研究

王志超 楊廣達(dá) 朱藹瑜 陳倩雅

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，廣東 廣州 511300）

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。雖然結(jié)直腸癌治療取得了進(jìn)展，但轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的治療仍具有挑戰(zhàn)性。本研究旨在探索miR-645是否通過(guò)靶向調(diào)控STING來(lái)影響結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，并進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制。使用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型來(lái)研究miR-645在結(jié)直腸癌中的功能，并通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）、Western blot、免疫熒光染色等技術(shù)來(lái)評(píng)估m(xù)iR-645和STING的表達(dá)水平以及結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。通過(guò)這項(xiàng)研究，希望進(jìn)一步了解miR-645和STING在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的相互關(guān)系，并為開(kāi)發(fā)新的靶向miR-645和STING的治療策略提供理論基礎(chǔ)。這將為結(jié)直腸癌患者的個(gè)體化治療和預(yù)后改善提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 結(jié)直腸癌細(xì)胞系和組織樣本的獲取和處理 結(jié)直腸癌細(xì)胞系和組織樣本的獲取和處理是研究miR-645靶向STING調(diào)控結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移作用機(jī)制的重要步驟。

1.1.1 結(jié)直腸癌細(xì)胞系的選擇與培養(yǎng) 結(jié)直腸癌細(xì)胞系的選擇對(duì)于研究具有轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞行為至關(guān)重要。通常選擇具有不同轉(zhuǎn)移能力的結(jié)直腸癌細(xì)胞系作為研究對(duì)象，如具有高度轉(zhuǎn)移能力的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌細(xì)胞系和較低轉(zhuǎn)移能力的非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌細(xì)胞系。這樣可以比較它們?cè)趍iR-645調(diào)控下的表型差異。

結(jié)直腸癌細(xì)胞系的來(lái)源和鑒定是確保實(shí)驗(yàn)可靠性和重復(fù)性的重要步驟。細(xì)胞系的來(lái)源可以是臨床樣本、細(xì)胞庫(kù)或其他研究實(shí)驗(yàn)室。在選擇細(xì)胞系時(shí)，需要對(duì)其進(jìn)行鑒定，確認(rèn)其為結(jié)直腸癌細(xì)胞，并排除其他細(xì)胞類(lèi)型的污染。結(jié)直腸癌細(xì)胞系的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基的配制需要根據(jù)細(xì)胞系的特性進(jìn)行優(yōu)化。常用的培養(yǎng)基包括DMEM（Dulbecco's modified eagle medium）和RPMI-1640（roswell park memorial institute 1640），其中添加適當(dāng)濃度的胎牛血清、抗生素和其他所需添加物。細(xì)胞應(yīng)在37°C恒溫培養(yǎng)箱中、5% CO2的濕度條件下培養(yǎng)。

結(jié)直腸癌組織樣本的獲取是進(jìn)行臨床相關(guān)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。結(jié)直腸癌組織樣本可以通過(guò)手術(shù)切除、活檢或穿刺等方法獲取。在收集樣本時(shí)，需要遵循倫理審查委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定和患者知情同意。收集到的組織樣本應(yīng)盡快進(jìn)行處理或儲(chǔ)存，以確保其質(zhì)量和可靠性。

1.1.2 處理結(jié)直腸癌細(xì)胞系和組織樣本 處理結(jié)直腸癌細(xì)胞系和組織樣本包括細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代和凍存，以及組織樣本的固定、切片和染色等操作。細(xì)胞的培養(yǎng)需要定期檢查細(xì)胞的健康狀況，包括細(xì)胞形態(tài)、增殖速度和細(xì)胞存活率。傳代細(xì)胞是為了維持細(xì)胞系的穩(wěn)定生長(zhǎng)和擴(kuò)增。細(xì)胞的凍存可用于長(zhǎng)期保存和后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于結(jié)直腸癌組織樣本，需要進(jìn)行固定處理。常用的固定劑包括10%緩沖福爾馬林（formaldehyde）溶液，該溶液可固定組織細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。固定后，組織樣本可以進(jìn)行切片制備。切片可以使用切片機(jī)將組織切割成薄片，通常為 5～10 μm厚度。切片后，可以進(jìn)行染色處理，如常用的組織學(xué)染色方法包括血液學(xué)染色（如血液片染色）、免疫組織化學(xué)染色和核酸染色（如HE染色和DAPI染色）等。這些染色方法可用于觀察組織細(xì)胞的形態(tài)特征、蛋白質(zhì)表達(dá)以及核酸的定位和含量[1]。

結(jié)直腸癌細(xì)胞系和組織樣本的獲取和處理是研究miR-645靶向STING調(diào)控結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移作用機(jī)制的關(guān)鍵步驟。通過(guò)獲取適當(dāng)?shù)募?xì)胞系和組織樣本，并進(jìn)行相應(yīng)的處理和處理，可以為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)和分析提供可靠的材料基礎(chǔ)。這將有助于深入理解miR-645和STING在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，并為進(jìn)一步研究提供有力的支持。

1.2 miR-645和STING的表達(dá)檢測(cè) miR-645和STING的表達(dá)檢測(cè)是研究miR-645靶向STING調(diào)控結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移作用機(jī)制的關(guān)鍵步驟。下面闡述了相應(yīng)的方法和技術(shù)。

1.2.1 miR-645的表達(dá)檢測(cè) ①RNA提?。菏褂蒙虡I(yè)化的RNA提取試劑盒從結(jié)直腸癌細(xì)胞系或組織樣本中提取總RNA，包括小RNA分?jǐn)?shù)。②miRNA逆轉(zhuǎn)錄：使用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取得到的小RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，其中包括miR-645。③實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）：使用miR-645特異性引物和探針進(jìn)行qPCR，測(cè)定miR-645的表達(dá)水平。常規(guī)化對(duì)內(nèi)參（如U6 snRNA）的表達(dá)量，計(jì)算miR-645的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 STING的表達(dá)檢測(cè) ①蛋白提?。菏褂眉?xì)胞裂解緩沖液或蛋白提取試劑盒從結(jié)直腸癌細(xì)胞系或組織樣本中提取總蛋白。②Western blot：將提取的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到聚丙烯酰胺膜上。使用特異性的STING抗體進(jìn)行免疫印跡分析，檢測(cè)STING的蛋白表達(dá)水平。常規(guī)化對(duì)內(nèi)參（如β-actin）的表達(dá)量，計(jì)算STING的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 miR-645過(guò)表達(dá)和沉默技術(shù)的建立

1.3.1 miR-645過(guò)表達(dá)技術(shù) ①構(gòu)建miR-645過(guò)表達(dá)載體：將miR-645的序列克隆到合適的miRNA過(guò)表達(dá)載體中，如pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro。②轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞系：使用合適的轉(zhuǎn)染試劑將miR-645過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，如使用Lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。③篩選和確認(rèn)過(guò)表達(dá)細(xì)胞系：使用適當(dāng)?shù)暮Y選劑，如puromycin，篩選并擴(kuò)增miR-645過(guò)表達(dá)細(xì)胞系。使用qPCR驗(yàn)證miR-645的過(guò)表達(dá)水平。

1.3.2 miR-645沉默技術(shù) ①miR-645抑制劑轉(zhuǎn)染：使用miR-645特異性的抑制劑（anti-miR-645）將其轉(zhuǎn)染到結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，如使用Lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。②篩選和確認(rèn)沉默細(xì)胞系：根據(jù)抑制劑的特性，選擇合適的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行沉默效果的評(píng)估。使用qPCR檢測(cè)miR-645的表達(dá)水平來(lái)確認(rèn)miR-645的沉默效果。

2 結(jié)果

2.1 miR-645在結(jié)直腸癌組織中的高表達(dá) 使用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）方法對(duì)結(jié)直腸癌組織樣本進(jìn)行miR-645的表達(dá)檢測(cè)。qRT-PCR分析顯示，miR-645的表達(dá)水平在結(jié)直腸癌組織中明顯升高，與對(duì)照組織相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異（P＜0.05）。進(jìn)一步的分析顯示，miR-645的高表達(dá)與結(jié)直腸癌的臨床病理特征相關(guān)。與低表達(dá)組相比，miR-645高表達(dá)組在腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期等方面呈現(xiàn)出更嚴(yán)重的病理特征。這提示miR-645的高表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)。此外，通過(guò)生存分析，觀察到miR-645的高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。高miR-645表達(dá)組的患者生存期明顯縮短，表明miR-645的高表達(dá)可能作為結(jié)直腸癌預(yù)后的不良預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，研究結(jié)果顯示miR-645在結(jié)直腸癌組織中高度表達(dá)，并與結(jié)直腸癌的臨床病理特征和患者預(yù)后密切相關(guān)。這表明miR-645在結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展中可能具有重要的調(diào)控作用。進(jìn)一步的機(jī)制研究將有助于揭示miR-645在結(jié)直腸癌中的功能機(jī)制，并為miR-645作為潛在的治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。見(jiàn)圖1。

圖1 結(jié)直腸癌腫瘤組織（CRC）和癌旁組織（NAT）中miR-645的檢測(cè)結(jié)果

2.2 生物信息學(xué)方法 我們使用生物信息學(xué)方法對(duì)miR-645的潛在靶向基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并發(fā)現(xiàn)STING基因是miR-645的潛在靶向靶點(diǎn)之一。通過(guò)使用多個(gè)公開(kāi)可用的miRNA靶向預(yù)測(cè)算法和數(shù)據(jù)庫(kù)，我們對(duì)miR-645與STING基因之間的相互作用進(jìn)行了分析。這些算法和數(shù)據(jù)庫(kù)包括miRanda、TargetScan、miRBase和miRTarBase等。綜合這些預(yù)測(cè)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)STING基因在其3'非翻譯區(qū)（3' UTR）具有與miR-645互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)序列。

進(jìn)一步的分析顯示，miR-645與STING基因的結(jié)合位點(diǎn)具有高度的保守性，這表明miR-645可能通過(guò)與STING基因的結(jié)合來(lái)調(diào)控其表達(dá)水平。通過(guò)生物信息學(xué)分析，還發(fā)現(xiàn)miR-645與STING基因在功能途徑和信號(hào)通路上存在潛在的關(guān)聯(lián)。STING作為一個(gè)重要的免疫調(diào)節(jié)分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫應(yīng)答和抗病毒防御。miR-645可能通過(guò)靶向STING基因的調(diào)控，影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的免疫逃逸和轉(zhuǎn)移能力。故而，生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-645 可能通過(guò)靶向STING基因參與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移調(diào)控。這一發(fā)現(xiàn)為深入研究miR-645和STING之間的相互作用及其在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制提供了初步的線索。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究將有助于驗(yàn)證miR-645與STING基因之間的相互作用，并揭示其在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的具體調(diào)控機(jī)制。miR-645與STING 3'UTR結(jié)合示意圖見(jiàn)圖2。

圖2 miR-645與STING 3'UTR結(jié)合示意圖

2.3 熒光素酶活性檢測(cè) 我們將STING的3'UTR構(gòu)建到熒光素酶報(bào)告基因下游，然后過(guò)表達(dá)或干擾miR-645后檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-645能夠降低熒光強(qiáng)度，干擾miR-645能夠上調(diào)熒光強(qiáng)度。這表明miR-645能夠通過(guò)結(jié)合STING的3'UTR對(duì)其進(jìn)行負(fù)調(diào)控。見(jiàn)圖3。

圖3 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 miR-645靶向STING調(diào)控結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制 miR-645作為一種重要的微小RNA分子，已被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中表達(dá)異常，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。在本研究中，發(fā)現(xiàn)miR-645在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，并通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-645可能通過(guò)靶向STING基因參與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移調(diào)控。STING作為一種免疫調(diào)節(jié)分子，在細(xì)胞的免疫應(yīng)答和抗病毒防御中發(fā)揮重要作用。過(guò)去的研究已經(jīng)表明STING在抑制腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中具有重要功能。然而，miR-645通過(guò)靶向STING基因的調(diào)控可能導(dǎo)致STING的表達(dá)下調(diào)，從而影響免疫逃逸和轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展[2]。

在本研究中，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-645在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的高表達(dá)與STING的蛋白表達(dá)水平的逆相關(guān)關(guān)系。miR-645的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致STING的表達(dá)下調(diào)，而miR-645的沉默則使STING的表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-645的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移能力，而miR-645的沉默則抑制了細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。這些結(jié)果提示miR-645通過(guò)靶向STING基因調(diào)控結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程。miR-645的高表達(dá)可能導(dǎo)致STING的下調(diào)，從而減弱了免疫應(yīng)答和抗腫瘤能力，促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。相反，miR-645的沉默可能通過(guò)增強(qiáng)STING的表達(dá)，提高免疫逃逸和抑制轉(zhuǎn)移能力，抑制結(jié)直腸癌的發(fā)展。

需要進(jìn)一步研究來(lái)探索miR-645和STING之間的調(diào)控機(jī)制。如通過(guò)深入研究miR-645和STING的相互作用界面和調(diào)控途徑，可以揭示miR-645如何通過(guò)靶向STING基因調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。此外，進(jìn)一步的臨床研究可以探索miR-645和STING的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，以及其在免疫治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值[3]。

總之，研究結(jié)果表明miR-645在結(jié)直腸癌中的高表達(dá)與STING的調(diào)控有關(guān)，可能參與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程。這為深入研究miR-645和STING之間的相互作用、探索新的治療靶點(diǎn)以及開(kāi)發(fā)個(gè)體化治療策略提供了新的線索和理論基礎(chǔ)。進(jìn)一步的研究努力將有助于加深對(duì)miR-645和STING的理解，并為結(jié)直腸癌的預(yù)后評(píng)估和治療提供新的方向和策略。

3.2 miR-645對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 miR-645對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響是本研究的重點(diǎn)之一。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-645的過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而miR-645的沉默則呈現(xiàn)相反的效果。

這些發(fā)現(xiàn)表明miR-645在結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲過(guò)程中具有促進(jìn)作用。miR-645的高表達(dá)可能通過(guò)調(diào)節(jié)與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的基因和信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力增強(qiáng)。進(jìn)一步研究miR-645調(diào)控的靶基因，如轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞黏附分子和基質(zhì)金屬蛋白酶等，可以更深入地揭示miR-645參與結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制。這些研究結(jié)果對(duì)于理解結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移過(guò)程的分子機(jī)制具有重要意義。進(jìn)一步研究miR-645的功能和調(diào)控機(jī)制，可以為開(kāi)發(fā)新的治療策略和靶向治療結(jié)直腸癌的方法提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)，miR-645可能成為評(píng)估結(jié)直腸癌患者預(yù)后和治療反應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物。因此，深入研究miR-645對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的調(diào)控，對(duì)于指導(dǎo)個(gè)體化治療和改善患者預(yù)后具有重要的臨床意義[4]。

3.3 miR-645對(duì)STING蛋白表達(dá)的調(diào)控 本研究還揭示了miR-645對(duì)STING蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-645的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致STING蛋白的表達(dá)下調(diào)，而miR-645的沉默則使STING蛋白的表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果表明miR-645通過(guò)靶向STING基因參與了結(jié)直腸癌細(xì)胞中STING蛋白的調(diào)控。STING作為免疫調(diào)節(jié)分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫應(yīng)答和抗病毒防御。miR-645的高表達(dá)可能導(dǎo)致STING的下調(diào)，從而減弱了免疫應(yīng)答和抗腫瘤能力，促進(jìn)了結(jié)直腸癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步的研究需要探索miR-645調(diào)控STING的分子機(jī)制?？赡艿臋C(jī)制包括miR-645與STING基因的結(jié)合導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制，或者通過(guò)調(diào)控其他調(diào)節(jié)STING表達(dá)的信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子來(lái)影響STING的表達(dá)水平[5]。從臨床角度來(lái)看，miR-645對(duì)STING的調(diào)控可能對(duì)結(jié)直腸癌患者的治療和預(yù)后具有重要意義。結(jié)直腸癌患者的免疫狀態(tài)和治療反應(yīng)與STING的表達(dá)水平密切相關(guān)。因此，miR-645的表達(dá)水平和對(duì)STING的調(diào)控可能成為結(jié)直腸癌患者預(yù)后評(píng)估和治療決策的重要指標(biāo)。

3.4 miR-645和STING作為治療靶點(diǎn)的潛在應(yīng)用 miR-645和STING作為治療靶點(diǎn)的潛在應(yīng)用是本研究的重要發(fā)現(xiàn)之一。miR-645的高表達(dá)與結(jié)直腸癌的惡性特征和不良預(yù)后密切相關(guān)，而STING作為免疫調(diào)節(jié)分子在腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。因此，針對(duì)miR-645和STING的調(diào)控可能成為新的治療策略。一方面，通過(guò)抑制miR-645的表達(dá)或阻斷其功能，可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程。針對(duì)miR-645的治療策略可以包括使用miRNA抑制劑或開(kāi)發(fā)靶向miR-645的藥物。另一方面，增強(qiáng)STING的表達(dá)或激活其信號(hào)通路，可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫攻擊的敏感性，促進(jìn)腫瘤的免疫清除。目前已經(jīng)有針對(duì)STING的免疫治療策略在臨床試驗(yàn)中展開(kāi)，包括STING激動(dòng)劑的使用和STING信號(hào)通路的調(diào)節(jié)劑。

因此，miR-645和STING作為治療靶點(diǎn)具有重要的潛在應(yīng)用。進(jìn)一步的研究將有助于深入了解miR-645和STING在結(jié)直腸癌發(fā)展中的作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)針對(duì)這些靶點(diǎn)的治療策略提供理論基礎(chǔ)。這些治療策略有望為結(jié)直腸癌患者提供新的個(gè)體化治療選擇，并提高患者的治療效果和預(yù)后。

總之，本研究揭示了miR-645對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的調(diào)控作用，以及對(duì)STING蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。進(jìn)一步的研究將有助于深入了解miR-645和STING之間的相互作用，以及其在結(jié)直腸癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的重要性。這些研究成果可能為結(jié)直腸癌的個(gè)體化治療和預(yù)后評(píng)估提供新的思路和策略。