殼聚糖肛腸抗菌凝膠的無菌方法學(xué)驗(yàn)證

孫明波 董健 郭芳 陳文博 王詩(shī)琪 蔡盼盼 劉浩 胡健 余洋 遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心 （遼寧 沈陽(yáng) 110171）

內(nèi)容提要： 目的：嘗試建立殼聚糖肛腸抗菌凝膠的無菌檢查方法。方法：嚴(yán)格按照《中華人民共和國(guó)藥典》（2020版）四部 第1101條無菌檢查方法，采用薄膜過濾法對(duì)殼聚糖肛腸抗菌凝膠進(jìn)行無菌檢查，并對(duì)建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：樣品管無菌生長(zhǎng)，六株陽(yáng)性對(duì)照菌生長(zhǎng)良好。結(jié)論：通過方法學(xué)驗(yàn)證說明建立的無菌檢查法適用于殼聚糖肛腸抗菌凝膠的無菌檢查，保證無菌檢查方法的有效性。

殼聚糖具有抗菌、抗腫瘤、促進(jìn)凝血等藥理活性。天然資源豐富，無毒，具有良好的生物相容性和生物降解性。它已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如止血?jiǎng)⒅寡罅虾涂晌胀饪瓶p合線等。近年來，越來越多地應(yīng)用于婦科產(chǎn)品，如殼聚糖婦科栓劑、殼聚糖宮頸抗菌膜[1]。

卡波姆，也被稱為聚羧乙烯，是一種由丙烯酸和丙烯基蔗糖交聯(lián)而成的聚合物。它的化學(xué)名稱是Carboxypolymethylene，最早是由美國(guó)的Goodrich公司生產(chǎn)的，現(xiàn)在被列入美國(guó)、英國(guó)和其他國(guó)家的藥典，2000年版我國(guó)藥典已收錄[2]?？ú肥且环N高分子的聚合物，初始的狀態(tài)是為白色的疏松的粉末狀，可能會(huì)有輕微的臭味，而且還容易吸引潮氣。卡波姆在許多行業(yè)中占有比較重要的地位。作為一種多用途高分子材料和藥物輔料，卡波姆被廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外藥品和化妝品的開發(fā)和生產(chǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。將該物質(zhì)放入在水中，加入10%的氫氧化鈉溶液之后就會(huì)變成凝膠狀，可以運(yùn)用于化妝品的生產(chǎn)，對(duì)皮膚有一定的保護(hù)作用。在化妝品的生產(chǎn)中添入適量的卡波姆能夠使霜膏乳液變得具有流動(dòng)性，還能增加產(chǎn)品的穩(wěn)定性和美觀性，且卡波姆在溶解成黏稠的透明質(zhì)物體時(shí)還具有一定的保濕的效果?？ú放c皮膚有一定的親和力，把卡波姆加入護(hù)膚品中，能夠減少刺激性物質(zhì)的對(duì)皮膚和黏膜的刺激和傷害，能夠抗紫外線，增強(qiáng)皮膚對(duì)紫外線的抵抗能力，減少紫外線對(duì)皮膚的傷害，所以很產(chǎn)品用它來做防曬霜的成分。同時(shí)，因?yàn)槠浔旧砭褪且环N天然的藥用成分，具有一定的消炎殺菌的作用，所以也可常見于一些藥妝成分，其可以通過一些綜合作用來保證化妝品的質(zhì)量。此外，卡波姆也被運(yùn)用于醫(yī)療方面，比如在做B超的時(shí)候會(huì)使用耦合劑，卡波姆能夠起到很好的介質(zhì)作用。

由于卡波姆的凝膠性狀以及殼聚糖的抗菌性，如何針對(duì)這兩種特性建立一種合理有效的無菌檢測(cè)方法一直是一個(gè)難題。本文結(jié)合《中華人民共和國(guó)藥典》[3]（2020版），四部 第1101條無菌檢查方法，建立了殼聚糖肛腸抗菌凝膠無菌檢測(cè)的一般流程，為改進(jìn)該產(chǎn)品的無菌檢測(cè)方法提供參考。

1.材料與方法

1.1 一般材料

試驗(yàn)起止時(shí)間：2022年8月～2023年3月。

1.1.1 試驗(yàn)儀器及耗材

集菌儀（HTY-2000A）（杭州高得醫(yī)療器械有限公司）；可重復(fù)性使用薄膜過濾器（杭州泰林生物技術(shù)有限公司）；一次性全封閉集菌器（杭州泰林生物技術(shù)有限公司）；50μm微孔濾膜（海寧市鹽官創(chuàng)為過濾器材廠）；生物安全柜（HFsafe-1200）（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；生化培養(yǎng)箱（沈陽(yáng)市偉明醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.1.2 供試品

殼聚糖肛腸抗菌凝膠，規(guī)格：3g，由生產(chǎn)廠家提供。

1.1.3 試驗(yàn)菌種

試驗(yàn)用白色念珠菌[CMCC（F）98001]（Candida albicans）、黑曲霉[CMCC（F）98003]（Aspergillus niger）、生孢梭菌[CMCC（B）64941]（Clostridium sporogenes）、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]（Staphylococcus aureus）、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]（Escherichia coli），六株試驗(yàn)菌均來自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.1.4 培養(yǎng)基及試劑

液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FTM）（德國(guó)默克公司）、胰蛋白酶大豆蛋白胨液體培養(yǎng)基（TSB）（德國(guó)默克公司）、沙氏葡萄糖瓊脂（TSA）（美國(guó)BD公司），以上培養(yǎng)基均通過培養(yǎng)基靈敏度的檢查；蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；吐溫80（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；0.9%無菌氯化鈉溶液（遼寧民康制藥有限公司）；無水氯化鈣（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物接種于胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)基中，將生孢梭菌新鮮培養(yǎng)物接種于液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中，在30°C～35°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。將白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20°C～25°C生化培養(yǎng)箱24～48h。用0.9%無菌氯化鈉溶液將上述培養(yǎng)物配制成100 CFU/mL以內(nèi)的菌懸液。將新培養(yǎng)的黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱20°C～25°C培養(yǎng)5～7d。加入3～5mL 0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫孢子。然后采用適當(dāng)?shù)姆椒▽㈡咦討腋∫何霟o菌試管中，用0.9%無菌氯化鈉溶液制備含菌量＜100CFU/mL的孢子懸浮液。

1.2.2 方法驗(yàn)證

1.2.2.1 樣品前處理

用100mL 0.1%無菌蛋白胨緩沖溶液稀釋15支樣品，再加入10%無菌氯化鈣溶液溶解，加入時(shí)搖勻。此時(shí)二價(jià)離子與羧酸自由基結(jié)合形成不溶性鹽，逐漸產(chǎn)生大量絮凝沉淀，邊加邊震蕩搖勻，直至沉淀量不再增加，使用約200mL氯化鈣溶液。

1.2.2.2 通過濾膜1的濾液中微生物的回收率

以金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]和白色念珠菌[CMCC（F）98001]為試驗(yàn)菌，將試驗(yàn)菌新鮮培養(yǎng)物（0～100CFU）加入到供試品溶液中，按1.2.2.1步驟操作，采用可重復(fù)性可滅菌薄膜過濾器濾筒，將絮狀混合物通過50μm濾膜1，在無菌濾膜1上分離沉淀，收集所有濾液[4]。將收集的所有濾液進(jìn)行薄膜過濾，計(jì)數(shù)，計(jì)算回收率。

1.2.2.3 無菌試驗(yàn)方法的驗(yàn)證

使用可重復(fù)滅菌的薄膜過濾器，無菌操作組裝孔徑為50μm的過濾膜（過濾膜1）。試驗(yàn)產(chǎn)品溶液全部過濾后，將所有濾液收集。采用封閉式三聯(lián)無菌薄膜過濾器（濾膜2），過濾收集的所有濾液，將試驗(yàn)用菌（生孢梭菌[CMCC（B）64941]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]＜100CFU的菌懸液加入到濾筒中。取另一容器，用相同體積的培養(yǎng)基，加入相同數(shù)量的試驗(yàn)菌，作為陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)規(guī)定的溫度培養(yǎng)3～5d。所有檢測(cè)用試驗(yàn)菌均用相同的方法進(jìn)行操作，并分別設(shè)立陰性對(duì)照組。

1.2.3 無菌檢查試驗(yàn)

取15個(gè)樣本，用100mL0.1%無菌蛋白胨緩沖液充分混勻，然后加入10%無菌氯化鈣溶液溶解，氯化鈣溶液總用量約為200mL。使用可重復(fù)滅菌的薄膜過濾器濾筒，無菌操作組裝孔徑為50μm的濾膜（濾膜1）。試驗(yàn)產(chǎn)品溶液過濾后，將通過濾膜1的所有濾液收集。選用封閉的三聯(lián)無菌過濾器（濾膜2），用來過濾所有收集的濾液。陽(yáng)性在濾筒中加入＜100CFU試驗(yàn)菌。按規(guī)定溫度培養(yǎng)14d，觀察結(jié)果。

2.結(jié)果

2.1 菌液制備結(jié)果

每種試驗(yàn)菌液經(jīng)相應(yīng)條件培養(yǎng)后生長(zhǎng)良好，均為混濁，同步進(jìn)行菌液計(jì)數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 .驗(yàn)證用菌液的稀釋級(jí)及接種量

2.2 經(jīng)過濾膜1過濾后，收集液中的微生物回收率

以金黃色葡萄球菌和白色念珠菌為試驗(yàn)菌，通過50μm濾膜1后，回收率結(jié)果見表2。

表2 .濾膜1微生物的回收率(%)

2.3 薄膜過濾法驗(yàn)證結(jié)果

采用薄膜過濾法進(jìn)行的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果見表3。從表3可以看出，試驗(yàn)品組和陽(yáng)性對(duì)照組均生長(zhǎng)良好，且生長(zhǎng)速度相同，結(jié)果表明用雙濾膜法進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，可去除供試品對(duì)6株陽(yáng)性菌的抑菌作用，可用此方法進(jìn)行供試品的無菌檢查。

表3 .殼聚糖肛腸抗菌凝膠的方法驗(yàn)證結(jié)果

2.4 供試品的無菌檢查

由表4可知，供試品管與陰性管均澄清，陽(yáng)性管生長(zhǎng)良好，供試品符合規(guī)定。

表4 .供試品無菌檢查結(jié)果

3.討論

殼聚糖作為抗菌劑已被科研工作者研究多年，雖然到目前為止具體的抗菌機(jī)制尚未清楚，但學(xué)者們提出了很多較為合理的抗菌機(jī)制。鄭連英等[5]認(rèn)為殼聚糖的抗菌作用主要有以下兩種機(jī)制：一種是通過吸附在細(xì)胞表面，形成一層高分子膜，阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸；另一種是滲透進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，發(fā)生絮凝作用。宋獻(xiàn)周等[6]認(rèn)為其抗菌機(jī)制為通過某種途徑進(jìn)入菌體細(xì)胞內(nèi)并擾亂其生理代謝實(shí)現(xiàn)的。

卡波姆凝膠具有良好的生物黏附性，可通過長(zhǎng)時(shí)間黏附黏膜獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和分泌物部位，將所含藥物釋放到治療部位，從而達(dá)到較好的治療效果。此外，它在控制藥物釋放、提高藥物生物利用度和定位給藥方面也具有日益顯著的優(yōu)勢(shì)。目前，卡波姆凝膠在皮膚、黏膜和口腔給藥途徑中發(fā)揮著越來越重要的作用。由于碳鏈之間的共價(jià)交聯(lián)，卡波姆形成了獨(dú)特的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。水化膨脹后形成凝膠，作為緩釋控釋劑中的水凝膠骨架材料，通過形成的凝膠層控制藥物釋放。因其形成凝膠具有黏性，堵塞微孔濾膜，故需要先通過加入無菌氯化鈣形成不溶性鹽，產(chǎn)生大量絮狀沉淀，初步過濾后再進(jìn)行無菌試驗(yàn)的薄膜過濾，因此在濾膜1的選擇上需要進(jìn)行研究。

細(xì)菌長(zhǎng)度一般在0.1～20μm，橫徑0.2～2μm，肉眼難以分辨細(xì)菌，只有通過顯微鏡放大1000倍后，才能辨別細(xì)菌的大小、形態(tài)、分布和染色特性[7]。相比于細(xì)菌，霉菌的基本單位稱為菌絲，呈長(zhǎng)管狀，寬度2～10μm，可不斷自前端生長(zhǎng)并分枝。無隔或有隔，具1至多個(gè)細(xì)胞核。酵母菌在分類上屬于子囊菌亞門，是單細(xì)胞真菌，代表為啤酒酵母菌，形態(tài)呈圓形卵圓形，長(zhǎng)5～30μm[8]。因此本試驗(yàn)選用50μm孔徑尼龍濾網(wǎng)，其主要由聚丙烯纖維紡織成型構(gòu)成一體，耐酸堿性，耐腐蝕，阻力較低，且可反復(fù)清洗，經(jīng)濟(jì)性極高?？ú纺z與無菌氯化鈣絡(luò)合形成不溶性鹽，產(chǎn)生的絮狀沉淀經(jīng)過50μm孔徑尼龍濾網(wǎng)過濾后，收集的濾液進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)，回收率可達(dá)到90%以上，說明可用50μm孔徑尼龍濾網(wǎng)對(duì)絮狀混合物進(jìn)行初步過濾，收集到的濾液能夠通過0.45μm孔徑，通過此方法可去除供試品對(duì)6株陽(yáng)性菌的抑菌作用，因此可用此方法進(jìn)行卡波姆凝膠類供試品的無菌檢查。

隨著2020版藥典的發(fā)布，微生物的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)有了新的提高，我國(guó)藥品、醫(yī)療器械的微生物檢驗(yàn)控制體系與國(guó)際通行標(biāo)準(zhǔn)全面接軌，由于藥品、醫(yī)療器械品種的多樣化、復(fù)雜化，無菌檢查的方法學(xué)建立是十分必要的。針對(duì)于含殼聚糖類的凝膠產(chǎn)品的無菌檢驗(yàn)方法，總結(jié)了如下幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：①供試品的選取、轉(zhuǎn)移過程要采取防止污染措施，確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。②供試液制備時(shí)，選用足夠體積的無菌氯化鈣進(jìn)行絡(luò)合，以免絡(luò)合不充分影響下一步的過濾。③要選擇合適孔徑的濾膜，既不能選擇孔徑太小的濾膜，以免影響經(jīng)過濾膜1過濾的濾液的微生物回收，造成無菌假陰性結(jié)果，也不能選用孔徑太大的濾膜，以免因?yàn)闉V液中殘留的絮狀物在做無菌檢查時(shí)難以通過濾膜。④由于試驗(yàn)為開放式膜式過濾器，需要配制試驗(yàn)溶液、更換濾膜、收集濾液等多個(gè)步驟，污染因素增加。因此，在本試驗(yàn)的操作中應(yīng)嚴(yán)格遵循無菌操作原則，避免因操作不規(guī)范而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。