細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)在聚乙烯醇栓塞微球材料評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

羅洋 陳思彬 李娜 孫惠麗 天津市醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心 （天津 300384）

內(nèi)容提要： 目的：通過(guò)細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)）評(píng)價(jià)聚乙烯醇栓塞微球潛在的遺傳毒性，從而來(lái)評(píng)價(jià)該材料的潛在致突變性。方法：選擇生理鹽水（0.9%氯化鈉水溶液）、二甲基亞砜（DMSO）和含10%血清培養(yǎng)基（R10）三種介質(zhì)對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行浸提，采用平板摻入法計(jì)數(shù)鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株TA97a、TA98、TA100及TA102在活化和非活化條件下的細(xì)菌回復(fù)突變菌落數(shù)，以檢測(cè)其致突變性。結(jié)果：陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的試驗(yàn)結(jié)果成立。聚乙烯醇栓塞微球采用生理鹽水、DMSO和R10浸提后，浸提液對(duì)試驗(yàn)所用菌株回復(fù)突變數(shù)均未超過(guò)陰性對(duì)照的2倍。結(jié)論：在本次試驗(yàn)條件下，栓塞微球浸提液均對(duì)鼠傷寒沙門氏菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株TA97a、TA98、TA100、TA102無(wú)誘變性。

介入栓塞治療學(xué)作為一門新興學(xué)科，在治療心血管疾病、惡性腫瘤方面有著良好的應(yīng)用前景，是一種有效且損傷小的治療方式。栓塞微球作為一種最熱門的栓塞材料因?yàn)槠淇煽氐某叽缗c球度能很好地改善栓塞效果來(lái)滿足臨床需求[1]。栓塞微球載體材料具有表面光滑、均勻的懸浮能力，在子宮肌瘤動(dòng)脈栓塞術(shù)中能減少并發(fā)癥且防止復(fù)發(fā)[2,3]。與傳統(tǒng)的治療手段相比，用聚乙烯醇可載藥栓塞微球治療中晚期肝癌患者具有手術(shù)效果好且并發(fā)癥較少的效果[4,5]。目前國(guó)內(nèi)外上市銷售的栓塞微球均為聚乙烯醇聚合微球，通過(guò)永久性栓塞達(dá)到良好的治療效果，但其遠(yuǎn)期效果與安全性還有待時(shí)間的檢驗(yàn)[6]。

細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames Test，簡(jiǎn)稱Ames試驗(yàn)）是一項(xiàng)體外評(píng)價(jià)受試物致突變性的試驗(yàn)，具有試驗(yàn)周期短、方法簡(jiǎn)便且結(jié)果穩(wěn)定的特點(diǎn)因而廣泛應(yīng)用于食品、藥品、醫(yī)療器械和農(nóng)藥等領(lǐng)域[7]。通過(guò)檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前常用浸提介質(zhì)一般都為生理鹽水（0.9%氯化鈉水溶液）和二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO），幾乎沒有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)使用含血清培養(yǎng)基來(lái)充當(dāng)浸提介質(zhì)的[8-10]。但是DMSO作為有機(jī)溶劑對(duì)很多心血管植入類產(chǎn)品有溶解作用，因此找到合適的兼具極性與非極性特性的浸提介質(zhì)具有相當(dāng)?shù)谋匾院途o迫性。利用多種浸提介質(zhì)，使用Ames試驗(yàn)檢測(cè)聚乙烯醇栓塞微球的研究更是少見。

本研究使用生理鹽水、二甲基亞砜和含10%血清培養(yǎng)基三種浸提基質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)Ames試驗(yàn)檢測(cè)聚乙烯醇栓塞微球材料的致突變性，為評(píng)價(jià)該材料體外遺傳毒性的潛在風(fēng)險(xiǎn)和相關(guān)產(chǎn)品的生物安全性評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)，從而為廣大人民的用械安全奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 一般材料

試驗(yàn)起止時(shí)間：2022年5月～2023年1月。

試驗(yàn)菌株：菌株（TA97a，TA98，TA100，TA102）來(lái)源于MOLTOX公司。各菌株進(jìn)行組氨酸缺陷型、脂多糖屏障缺失、R因子、紫外線損傷修復(fù)缺陷型、四環(huán)素抗性和自發(fā)回復(fù)率鑒定合格后備用。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)材料與浸提液制備

1.2.1.1 試驗(yàn)樣品

來(lái)自甲廠家的A產(chǎn)品：選擇規(guī)格為2mL:7mL（2mL栓塞微球:7mL生理鹽水），直徑為300～500μm，材質(zhì)為聚乙烯醇的栓塞微球。

來(lái)自乙廠家的B產(chǎn)品：選擇規(guī)格為綠色型（1g栓塞微球:7mL磷酸鹽緩沖鹽溶液），直徑為900～1200μm，材質(zhì)為聚乙烯醇的栓塞微球。

1.2.1.2 浸提液制備

浸提介質(zhì)采用生理鹽水，二甲基亞砜（DMSO）和含10%馬血清的1640培養(yǎng)基（R10）。A產(chǎn)品取樣前經(jīng)濾紙過(guò)濾，取微球按照0.2g/mL比例加入浸提介質(zhì)，放置于（50±2）°C搖床（72±2）h充分振蕩浸提，B產(chǎn)品同法制備。

1.2.1.3 對(duì)照樣品的制備

陰性對(duì)照組：取上述同批號(hào)介質(zhì)10mL，于相同條件下制備。

陽(yáng)性對(duì)照組：非活化試驗(yàn)組（-S9）：0.5mg/mL敵克松(Dexon)?；罨囼?yàn)組（+S9）：TA97a、TA98、TA100菌株采用0.2mg/mL 的2-氨基芴；TA102菌株采用10μL/mL的甲基磺酸甲酯。

1.2.2 試驗(yàn)方法

1.2.2.1 培養(yǎng)基制備

使用遺傳毒性Ames試劑盒A盒和B盒（北京匯智和源生物技術(shù)有限公司），按照試劑盒說(shuō)明書配制底層和頂層培養(yǎng)基，經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌。底層培養(yǎng)基每皿20mL，凝固后倒置于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)檢菌備用。頂層培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用，滅菌后分裝至2mL小管內(nèi)備用。

1.2.2.2 活化與非活化系統(tǒng)

按照表1將各組分混勻后傾注至底層平板，室溫固化。每組均設(shè)置3個(gè)平行皿。S9空白液和S9活化系統(tǒng)的配制方法詳見試劑盒說(shuō)明書。

表1 .測(cè)試混合體系

1.2.2.3 培養(yǎng)

全部平皿倒置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后觀察結(jié)果并計(jì)數(shù)。

2.結(jié)果

2.1 評(píng)價(jià)依據(jù)

計(jì)數(shù)并記錄每一平板的回復(fù)菌落數(shù)，并計(jì)算出3個(gè)平板的平均值，以±s表示。陰性對(duì)照組回復(fù)菌落數(shù)應(yīng)在預(yù)期的范圍內(nèi)，陽(yáng)性對(duì)照組回復(fù)菌落數(shù)應(yīng)至少為陰性對(duì)照組的3倍，否則對(duì)不在范圍內(nèi)的菌株應(yīng)重新試驗(yàn)。在背景生長(zhǎng)良好條件下，試驗(yàn)樣品組回復(fù)菌落數(shù)至少為陰性對(duì)照組回復(fù)菌落數(shù)的兩倍或兩倍以上（即回復(fù)菌落數(shù)≥2×陰性對(duì)照組數(shù)）即為陽(yáng)性反應(yīng)。如回復(fù)菌落數(shù)的增加與劑量相關(guān)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，或者至少在一個(gè)劑量水平出現(xiàn)可重復(fù)的并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)，即可認(rèn)為試驗(yàn)樣品為陽(yáng)性誘變劑。

2.2 計(jì)數(shù)與結(jié)果統(tǒng)計(jì)

A產(chǎn)品和B產(chǎn)品各浸提液組試驗(yàn)結(jié)果見表2、表3。

表2 .A產(chǎn)品各浸提液組試驗(yàn)結(jié)果(n=3,±s)

表2 .A產(chǎn)品各浸提液組試驗(yàn)結(jié)果(n=3,±s)

組別TA97a TA98 TA100 TA102生理鹽水浸提液135±5 35±1 155±1 299±5生理鹽水陰性對(duì)照 135±3 33±2 162±4 300±4 DMSO浸提液128±6 40±3 136±4 287±8 DMSO陰性對(duì)照125±2 37±4 144±5 307±10 R10浸提液119±4 44±3 131±1 268±3 R10陰性對(duì)照138±3 46±2 150±2 289±6陽(yáng)性對(duì)照2540±86 1281±39 1313±60 1566±89-S9生理鹽水浸提液124±3 31±4 147±5 266±7生理鹽水陰性對(duì)照 142±5 43±2 129±3 292±4 DMSO浸提液156±9 46±5 140±2 276±1 DMSO陰性對(duì)照144±6 38±1 159±8 299±6 R10浸提液129±2 43±4 138±1 260±4 R10陰性對(duì)照141±2 35±2 149±8 283±8陽(yáng)性對(duì)照2188±48 1988±38 1443±41 1895±40+S9

表3 .B產(chǎn)品各浸提液組試驗(yàn)結(jié)果(n=3,±s)

表3 .B產(chǎn)品各浸提液組試驗(yàn)結(jié)果(n=3,±s)

組別TA97a TA98 TA100 TA102生理鹽水浸提液148±4 43±2 144±2 274±9生理鹽水陰性對(duì)照 156±3 40±2 139±4 269±5 DMSO浸提液147±2 42±2 146±3 278±8 DMSO陰性對(duì)照157±8 40±2 141±4 277±3 R10浸提液133±5 38±3 136±6 288±3 R10陰性對(duì)照140±2 42±2 148±3 272±7陽(yáng)性對(duì)照2880±87 1061±55 1191±53 1368±94-S9生理鹽水浸提液152±12 44±4 153±1 275±5生理鹽水陰性對(duì)照 148±3 42±2 147±6 285±5 DMSO浸提液160±5 38±1 165±7 282±3 DMSO陰性對(duì)照146±1 45±2 141±4 298±9 R10浸提液155±4 45±3 144±1 266±3 R10陰性對(duì)照165±8 49±5 166±6 292±7陽(yáng)性對(duì)照2025±104 2049±94 1228±39 2049±80+S9

2.3 結(jié)果判定

通過(guò)結(jié)果可以看出，在本試驗(yàn)活化和非活化條件下，陰性對(duì)照組細(xì)菌回復(fù)突變菌落數(shù)在預(yù)期范圍內(nèi)，陽(yáng)性對(duì)照組回復(fù)菌落數(shù)大于陰性對(duì)照回復(fù)菌落數(shù)的3倍，試驗(yàn)成立。A產(chǎn)品和B產(chǎn)品0.2g/mL試驗(yàn)樣品生理鹽水、DMSO和R10浸提原液對(duì)試驗(yàn)所用菌株TA97a、TA98、TA100、TA102 四株菌株的回復(fù)菌落數(shù)均小于2×陰性對(duì)照組回復(fù)菌落數(shù)，對(duì)所用鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型均未發(fā)現(xiàn)誘變性。

3.討論

本文考察了來(lái)自不同廠家的聚乙烯醇栓塞微球的遺傳毒性，結(jié)果顯示該材料具有一致的遺傳毒特性即無(wú)致突變性。至少可以判斷來(lái)自不同廠家的產(chǎn)品A和產(chǎn)品B可能具有相似的原材料以及生產(chǎn)工藝。當(dāng)然，同一種材料在某種應(yīng)用中被認(rèn)為不具有不良的生物學(xué)反應(yīng)，但在其他應(yīng)用中未必成立。因此，對(duì)于不同工藝但主體成分一致的產(chǎn)品，在沒有充分試驗(yàn)數(shù)據(jù)論證其一致性的前提下，應(yīng)該采取謹(jǐn)慎的態(tài)度。

目前，很多遺傳毒性試驗(yàn)研究都是建立在一種浸提介質(zhì)即生理鹽水上進(jìn)行的。但是GB/T 16886.12-2017[11]中規(guī)定浸提時(shí)應(yīng)使用極性和非極性兩種溶劑，且非極性浸提介質(zhì)建議使用植物油。因此一種浸提介質(zhì)是不能滿足生物相容性遺傳毒性評(píng)價(jià)的。本實(shí)驗(yàn)室使用棉籽油作為陰性對(duì)照進(jìn)行細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)后發(fā)現(xiàn)，棉子油會(huì)浮在凝固的頂層培養(yǎng)基上。如果使用植物油作為浸提介質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)樣品植物油浸提液在試驗(yàn)及培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)法與試驗(yàn)菌株充分接觸從而失去檢測(cè)的意義。尤其值得指出，DMSO作為常用的浸提介質(zhì)大量運(yùn)用于Ames試驗(yàn)，但是對(duì)于會(huì)溶解其中的植入器械而言是不適用的。GB/T 16886.12-2017也允許使用含血清培養(yǎng)基進(jìn)行浸提，但在各試驗(yàn)室較少運(yùn)用且未規(guī)定血清含量。本次試驗(yàn)使用了含10%血清培養(yǎng)基作為一種兼具極性與非極性特性的介質(zhì)，試驗(yàn)過(guò)程和結(jié)果均顯示其結(jié)果的可靠性與穩(wěn)定性。為不適用DMSO浸提的醫(yī)療器械產(chǎn)品提供了新的浸提液選擇。本研究為含血清培養(yǎng)基具體運(yùn)用于醫(yī)療器械浸提液制備過(guò)程中提供了數(shù)據(jù)。本文使用3種浸提介質(zhì)可以模擬人體內(nèi)復(fù)雜的生理生化環(huán)境，為全面評(píng)價(jià)栓塞微球的遺傳毒性提供了依據(jù)。

作為一款新興且理想的材料，聚乙烯醇栓塞微球在具有良好的栓塞效果的同時(shí)應(yīng)該具有良好的生物相容性以保證患者的用械安全。但目前栓塞微球的研究主要集中在理化性能如外觀、彈性、粒徑溶脹率等，優(yōu)化制備過(guò)程如利用乳化-化學(xué)交聯(lián)法獲取最佳的聚乙烯醇微球制備條件、制備阿霉素載藥微球以擴(kuò)展預(yù)期用途，增加應(yīng)用場(chǎng)景（如將造影劑與微球球體結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)治療腫瘤血管栓塞的同時(shí)實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)觀察問題以及利用兔模型評(píng)估肝動(dòng)脈栓塞微球治療肝癌功效）的研究上，很少有文獻(xiàn)報(bào)道該材料的遺傳毒性[12-15]。當(dāng)然，生物相容性評(píng)價(jià)是一個(gè)廣泛而復(fù)雜的工作，Ames試驗(yàn)只是其中一個(gè)環(huán)節(jié)。還需要更多的體外和體內(nèi)試驗(yàn)來(lái)全面評(píng)估栓塞微球的性能。