大豆愈傷組織誘導(dǎo)及再分化的影響因素探索

何 莉, 候延寧, 唐玉林, 杜昕穎, 徐翠蓮

(塔里木大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 新疆 阿拉爾 843300)

大豆體細胞胚胎發(fā)生和器官發(fā)生再生系統(tǒng)于20世紀(jì)80年代初期成功建立,目前雖趨于完善,但相對于其他作物,大豆組織培養(yǎng)體系中仍然存在再生頻率較低,重復(fù)性差,基因型依賴性強等問題。在大豆組織培養(yǎng)的整個過程中,從外植體到愈傷組織,再到不定芽分化以及植株再生過程中,受諸多因素的影響,其中第一因素是內(nèi)部因素,主要包括材料本身基因型的影響,同時合適的外植體選取同樣也是大豆愈傷組織能否誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵;其二是外部因素,即培養(yǎng)基的種類和激素的組合配比以及光照、溫度等培養(yǎng)條件。培養(yǎng)基成分以及激素種類配比選取不同,大豆愈傷組織的誘導(dǎo)以及再生也會相應(yīng)呈現(xiàn)不同的效果。培養(yǎng)條件對大豆組織培養(yǎng)的作用也不容忽視。因此,深入探索大豆組培過程中愈傷組織誘導(dǎo)和不定根芽再分化的影響因素,并積極尋找對策是大豆組織培養(yǎng)體系得以完善的關(guān)鍵。

1 內(nèi) 因

1.1 材料本身基因型的影響

材料的基因型對愈傷組織的器官分化有決定性的影響,不同植物之間有明顯差異,比如煙草、胡蘿卜和矮牽牛等植物容易誘導(dǎo)器官的形成。而禾谷類、豆類、棉花等就比較困難。同一種植物不同品種,由于基因型差異,其誘導(dǎo)難易程度以及誘導(dǎo)頻率也不同。程林梅等[1]以8種不同基因型的大豆為試驗材料,研究激素濃度對大豆植株再生體系的影響發(fā)現(xiàn),所有的基因型在合適的培養(yǎng)條件下都可以誘導(dǎo)愈傷組織的生成,但不同的基因型由愈傷組織誘導(dǎo)植株再生頻率有顯著差異。李換麗等[2]探究了品種對大豆再生體系的影響,選取10個大豆品種在子葉與胚尖兩種不同的再生體系培養(yǎng),結(jié)果同樣表明,不同品種的大豆在同一再生體系有不同的誘導(dǎo)效果,即同一品種在不同的再生體系表現(xiàn)也不同。

1.2 外植體的影響

除了受基因型影響外,同一品種的不同外植體,其誘導(dǎo)的發(fā)生率也有差異,因此選擇適合的外植體也是組培成功的關(guān)鍵因素。外植體對再生體系的影響,主要包括外植體本身的種類、外植體的成熟度、大小以及選取季節(jié)等方面。通常,不同種類的植物甚至同一植物的不同外植體對誘導(dǎo)條件反應(yīng)不同,即有的部位誘導(dǎo)分化的成功率高,有的部位極難脫分化或再分化率很低。雷海英等[3]以晉豆19號為材料,選取子葉節(jié)、下胚軸、上胚軸、子葉、真葉等5個部位,旨在探究不同外植體的誘導(dǎo)效果,結(jié)果顯示,下胚軸誘導(dǎo)效果最好,其次依次是上胚軸,子葉節(jié)、子葉和真葉,愈傷組織誘導(dǎo)效果依次遞減,說明胚軸是比較適合的外植體。再者,外植體幼嫩程度的不同會影響外植體的滅菌率、誘導(dǎo)率和褐化率以及后期愈傷組織的生理狀況等。年齡較幼或幼嫩的外植體,污染程度較低,細胞活力好,易于誘導(dǎo)形成愈傷組織,而且也容易誘導(dǎo)分化成植株[4]。另外,取材季節(jié)、外植體的大小與滅菌效果及存活率存在一定關(guān)聯(lián),在合適時間如生長旺季取樣,試驗材料的消毒效果、成活率、誘導(dǎo)率及增殖率往往比在生長末期取樣有顯著提高。過小的外植體存活率很低,而過大的則容易污染,兩者均不利于誘導(dǎo)的成功。

2 外 因

2.1 培養(yǎng)基的影響

2.1.1培養(yǎng)基營養(yǎng)組分的影響

培養(yǎng)基是外植體賴以生存的基質(zhì)。培養(yǎng)基的種類、營養(yǎng)組分以及培養(yǎng)基的狀態(tài)等也關(guān)系著組織培養(yǎng)效果的好壞。用于植物細胞組培的培養(yǎng)基種類較多,其中MS培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中最常用的培養(yǎng)基,B5培養(yǎng)基是基于大豆根尖細胞培養(yǎng)而設(shè)計的培養(yǎng)基。這兩種培養(yǎng)基在大豆組織培養(yǎng)過程中較常用。離體培養(yǎng)和正常植株生長過程同樣需要齊全的營養(yǎng),培養(yǎng)基中的大量元素、微量元素、鐵鹽和有機物等四大類物質(zhì)會給外植體提供生長發(fā)育所需的營養(yǎng),如果缺乏某種元素,同樣會出現(xiàn)缺素癥狀或培養(yǎng)效果差。

培養(yǎng)基的狀態(tài)也對培養(yǎng)效果產(chǎn)生一定影響。通常,植物細胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)常用液體培養(yǎng)基,而器官的培養(yǎng)絕大部分常用固體培養(yǎng)基。瓊脂作為固體培養(yǎng)基常用的固化劑,其用量對培養(yǎng)效果也有一定影響,用量大則培養(yǎng)基透性較差,養(yǎng)分和激素的擴散速度慢,外植體無法及時獲取養(yǎng)分和生理活性物質(zhì)而受到抑制,同時代謝產(chǎn)生的廢物不能很好地擴散。若瓊脂用量過低,培養(yǎng)基凝固性差,不利于無菌操作的進行,同時也會增加培養(yǎng)瓶內(nèi)的濕度而容易產(chǎn)生“玻璃化苗”而導(dǎo)致培養(yǎng)效果不佳[5]。此外,培養(yǎng)過程中對培養(yǎng)基的酸堿度和滲透壓也有較為嚴(yán)格的要求[5]。

2.1.2培養(yǎng)基中激素組合與配比的影響

培養(yǎng)基的組成成分供給植物細胞生長所需的營養(yǎng),而植物生長調(diào)節(jié)劑(激素)則決定著細胞發(fā)育的方向。接種的外植體在激素的誘導(dǎo)下形成愈傷組織,是大豆組織培養(yǎng)的第一步,愈傷組織誘導(dǎo)的質(zhì)量對于大豆植株再生起著關(guān)鍵作用。不同種類的激素組合和配比對大豆愈傷組織的誘導(dǎo)效果有顯著差異。對大豆子葉形成愈傷組織的研究結(jié)果表明,所加激素均能誘導(dǎo)形成愈傷組織,但不同激素種類誘導(dǎo)愈傷有差異,以MS添加2 mg/L 2,4-D+1 mg/L KT效果最好[6]。因此,通常情況下,幾乎所有的大豆基因型材料都能誘導(dǎo)出愈傷組織,但是愈傷組織的進一步分化存在著一定的困難,在愈傷組織再分化及植株再生過程中,起決定性作用的依然是生長素類激素和細胞分裂素類激素的種類組合及濃度配比。愈傷組織分化根和芽與培養(yǎng)基中的生長素和細胞分裂素的相對濃度有關(guān),當(dāng)生長素/細胞分裂素比值高時,促進根的分化;比值低時則促進芽的分化;而當(dāng)兩者平衡時則會一直處于愈傷組織狀態(tài)。因此,探索最適的激素配比是組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。為此,大量研究人員針對大豆子葉節(jié)[7-10]、葉柄[11]以及胚尖[12-13]再生體系進行了探討。其中,劉思言等[9]以吉農(nóng)28、吉農(nóng)27、吉農(nóng)17三個基因型大豆子葉節(jié)作為外植體進行植株再生的研究,結(jié)果表明,適合大豆子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基是MS+3 mg/L 6-BA。適合大豆子葉節(jié)不定芽增殖的最佳增殖培養(yǎng)基是MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+31 mg/L GA。郭陽鑫等[11]建立了大豆葉柄外植體的離體再生體系,研究結(jié)果表明,葉柄愈傷組織形成的適宜培養(yǎng)基為改良MS+2 mg/L NAA,不定芽分化的適宜培養(yǎng)基為改良MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,不定根誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為1/2改良MS+0.8 mg/L IBA。胡潤芳[12]對菜用大豆胚尖轉(zhuǎn)化再生體系進行了優(yōu)化研究;閆帆等[13]對大豆胚尖再生體系建立的結(jié)果表明,6-BA對不定芽再生作用顯著,單獨使用或配合IBA使用均可獲得較高的再生率。

2.2 培養(yǎng)條件

2.2.1光的影響

在植物組織培養(yǎng)的愈傷組織誘導(dǎo)階段,一般因植物種類不同通常采用全暗、周期性光照、散射性光照3種做法,大豆愈傷組織誘導(dǎo)采用散射性光照比較好;而在器官發(fā)生階段,則一般給予周期性光照比較好。多數(shù)植物最常用的光周期是光照16 h,黑暗8 h。除此之外,光照強度影響外植體細胞的增殖,組織和器官的分化,因此不同植物對光照強度也有不同要求。大豆在體細胞胚胎發(fā)生誘導(dǎo)過程中對光照的要求不太嚴(yán)格,可以是黑暗,也可以采用12～24 h光照,光照強度的變化范圍也較寬,在50～6 000 lx之間[14]。

2.2.2溫度的影響

植物離體材料培養(yǎng)的最適溫度為(25±2)℃,而且對于多數(shù)植物的離體培養(yǎng)通常均采用恒溫培養(yǎng)即可較好地完成不定芽和植株再生等過程,大豆離體材料培養(yǎng)的溫度控制在25 ℃左右即可。

但也有資料表明,溫度高低對器官發(fā)生的數(shù)量和質(zhì)量仍有影響。如對禾本科、蘭科等的喜溫性植物的培養(yǎng)溫度可上調(diào)1～2 ℃,控制在26～28 ℃比較適宜。而對于十字花科、菊科等喜涼性植物的培養(yǎng)溫度可向下微調(diào),控制在25 ℃以下,20 ℃以上較為適宜。