頭針針刺對血管性癡呆大鼠行為及海馬體膽堿能抗炎通路的影響

李 忍,葉宇旋,周蔚華

(深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院,廣東 深圳 518133)

血管性癡呆(Vascular dementia,VD)是一種認知功能障礙性疾病,主要致病原因是腦血管發(fā)生病變,其發(fā)病率僅次于阿爾茲海默癥病的第二大類型癡呆癥,在癡呆患者總人數中占比15%～20%,部分發(fā)展中國家或地區(qū)可達30%。隨著全球人口老齡化,VD發(fā)病率明顯上升[1]。研究表明VD具有可逆性,但由于病因復雜,目前尚未清楚其發(fā)病機制,故臨床仍缺少針對的特異性治療方法和藥物。炎癥反應在VD發(fā)病和進展中發(fā)揮重要作用,可引起膽堿能神經元損傷并造成認知功能障礙[2]。Custodero等[3]通過一項薈萃分析顯示VD患者腦脊液白介素-6(Interleukin-6,IL-6)水平顯著升高,而IL-6的升高可致VD發(fā)病風險顯著增加[OR=1.28,95%CI:(1.03～1.59)]。機體內的膽堿能抗炎通路(Cholinergic anti-inflammatory pathway,CAP)可通過神經反射抑制全身炎癥反應,其中乙酰膽堿與巨噬細胞表面受體結合可通過NF-κB信號通路抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)等促炎因子的表達引起抗炎作用的產生,因此CAP可作為VD治療靶點[4-6]。本研究擬通過建立大鼠VD模型,探討頭針對大鼠行為的影響并分析CAP及相關炎癥因子表達水平。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取94只健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,來自廣東省醫(yī)學實驗動物中心,許可證號SCXK(粵)2003-0002,月齡4～5個月,體重180～220 g。所有大鼠于廣東省中醫(yī)院中心實驗室適應性飼養(yǎng)1周。室溫20～25 ℃,相對濕度55%,每12小時晝夜交替。

1.2 主要儀器和試劑 400R低溫離心機(德國HeraeuS);722型可見光分光光度計(上海市第三分析儀器廠);Multiskan MK3型酶標儀(芬蘭Thermo Labsystem公司);HH-4數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);Biofuge-28RS型高速冷凍離心機、DY89-1電動玻璃勻漿機(寧波市新芝科器研究所生產);DS-88型托盤天平(武漢市自動化工儀表廠生產);TGL-16C離心機(德國HeraeuS公司);JY3002型電子天平(上海市精密科學儀器有限公司);DYY-2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠);ProTEAN Ⅱ Xi cell電泳槽(美國Bio-RAD公司);TY-80B水平脫色搖床(上海浦東物理光學儀器廠);低溫冰箱(南京伯樂電器集團);S2-93自動雙重純水蒸餾器(上海市亞榮生化儀器廠);MIAS醫(yī)學圖象分析儀(南京奧康分析儀器有限公司);Motic B5顯微攝像系統(麥克奧迪實業(yè)集團公司);水合氯醛(上海市五聯化工廠);亞硝酸鈉(天津市四通化工廠);無水乙醇(鄭州化學試劑二廠);膽堿乙酰轉移酶(ChAT)試劑盒、乙酰膽堿酯酶(AChE)試劑盒、放射免疫沉淀試驗(Radioimmunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、考馬斯亮蘭蛋白試劑盒、TNF-α、IL-1β、IL-10、轉化生長因子-β(TGF-β)定量ELISA試劑盒、兔抗鼠核因子-κB(NF-κB)抗體、辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)標記羊抗兔IgG二抗、硝酸纖維素(Nitrocellulose,NC)膜、PBS、構橡酸鹽緩沖液(深圳晶賽生物技術有限公司)。

1.3 大鼠VD模型建立 所有大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后開展水迷宮測試,然后制備大鼠VD模型采用改良Pulsinelli四血管阻斷法,術前常規(guī)禁食12 h,禁水4 h,使用10%水合氯醛腹腔注射以麻醉大鼠,劑量0.3 ml/100 g,將麻醉后的大鼠固定于操作板上并呈俯臥位狀態(tài),施術區(qū)進行備皮、殺菌消毒,以第2頸椎棘突為中心在大鼠背側后頸部作一2 cm垂直切口,按順序切開皮膚以及皮下組織,將頸后部肌群進行逐層鈍性分離直至寰椎椎板處,在大鼠翼孔被暴露以后,朝向大鼠頭部方向將直徑0.5 mm的電烙針插入翼孔,深度約2 mm,對大鼠椎動脈進行間斷性燒灼并維持5～8 s(可重復灼燒,但一般不超過3次),灼燒至大鼠翼孔周圍的骨質逐漸呈現為蒼白色并且無血性液體流出時停止,之后對大鼠兩側頸動脈進行燒灼以及造成血管腔閉塞,在上述操作完成后為預防感染應使用0.9%氯化鈉溶液沖洗術區(qū)并滴加慶大霉素進行處理,肌肉和皮膚被逐層縫合后在大鼠切口處使用碘伏對其進行消毒處理,對大鼠進行標記處理后進行分籠飼養(yǎng),對大鼠術后的精神狀態(tài)及生命體征變化給予密切監(jiān)測觀察。在24 h之后再次對大鼠進行麻醉,使用腹腔注射10%水合氯醛溶液的方法,其劑量為0.3 ml/100 g,將麻醉后的大鼠于操作板上呈仰臥位固定,對施術區(qū)進行備皮、殺菌消毒,隨后作一個1.5 cm縱行切口于腹側頸正中偏下處,將皮膚至頸前肌群使用眼科手術剪剪開后沿頸正中部肌群與外側肌群交界處進行仔細分離,分離至頸總動脈鞘走行搏動處后,將頸總動脈周圍筋膜剝離開,使迷走神經分離開,3-0號線游離頸總動脈,完成上述操作后對對側使用同法處理,之后使用微型動脈夾在游離備用的3-0號線指引下將雙側頸總動脈可逆性夾閉,松開動脈夾在夾閉15 min后。夾閉是否成功標準如下:在夾閉雙側頸總動脈30～60 s內大鼠出現四肢僵直狀態(tài)并且其呼吸深度加深及速度加快,發(fā)生雙側眼球顏色變化呈現出灰白色眼球,瞳孔擴散變大,眼球顏色可立即恢復紅色在松開動脈夾之后,瞳孔重新縮小呈回縮現象。為預防感染,在夾閉成功后對術區(qū)使用0.9%氯化鈉溶液進行沖洗,并且使用慶大霉素進行處理,將其肌肉和皮膚進行逐層縫合后,對切口部位使用碘伏進行消毒處理,對大鼠進行標記處理后分籠進行飼養(yǎng)。

1.4 分組和給藥 按大鼠體重對94只大鼠進行編號,給予常規(guī)飼養(yǎng)1周后將大鼠隨機分為正常組12只、假手術組12只和造模組70只。本研究共造模造模成功48只,成功率為68.57%,其中假手術組大鼠僅暴露雙側椎動脈和頸總動脈,不行灼燒或夾閉操作。將造模成功的48只VD大鼠于造模第4周隨機分為模型組、美金剛組、頭針組及聯合組各12只,各組干預方法如下。

美金剛組:按體表面積法將鹽酸美金剛臨床用量折算為大鼠用藥劑量。人體表面積按照許文生氏公式計算:體表面積(m2)=0.0061×身高(cm)+0.0128×體重(kg)-0.1529,其中成人平均體重55 kg,平均身高165 cm。計算得成人平均體表面積為1.5576 m2,美金剛用量按10 mg/d計算,即成人用藥量約0.181 mg/kg,按體表面積計算約為6.420 mg/m2。大鼠體表面積按照Meeh-Rubner氏公式進行計算:體表面積(m2)=K×體重W(g)2/3×10-3,大鼠K=9.1,平均體重200 g。計算得平均體表面積為0.031 m2,因此大鼠等效用藥劑量為6.420× 0.031/0.2≈1 mg/kg,取10 mg鹽酸美金剛加入50 ml 0.9%氯化鈉溶液中,制成濃度0.2 mg/ml溶液,于每日8:00前對大鼠進行稱重,計算用藥量并進行灌胃。

頭針組:選用28號1寸毫針,參照大鼠穴位圖譜[9]選取百會、四神聰進行針刺,斜刺入針4 mm,施以捻轉手法5 min,留針15 min,再次施以捻轉手法5 min后取針,每周針刺6 d,休息1 d。同時于每日8:00前對大鼠進行稱重,并按照每金剛組中用藥量換算為相應體積0.9%氯化鈉溶液進行灌胃。

聯合組:按照頭針組和美金剛組中針刺及給藥方法進行干預。

正常對照組、假手術組和模型組:每日8:00前對大鼠進行稱重,并按照美金剛組中用藥量換算為相應體積0.9%氯化鈉溶液進行灌胃。

1.5 行為學評價 分別于造模前、造模4周、治療4周和治療8周進行Morris水迷宮實驗,水池高度為40 cm,直徑160 cm,水深30 cm,水溫(23±1)℃,直徑10 cm,高度28 cm的無色透明平臺。Morris水迷宮實驗包括2個部分:①定位航行試驗:將大鼠頭朝池壁放入水池中開始計時,至四肢完全站上平臺為止所需時間為逃避潛伏期,以120 s為限,超過者計為120 s,定位航行試驗共進行5 d,前2天為適應性階段,計算第3～5天逃避潛伏期均值,視為最終結果。②空間探索試驗:定位航行試驗結束第2天撤掉無色透明平臺,將大鼠從平臺所在象限放入水中并觀察120 s內穿越原平臺區(qū)域的次數,每只大鼠重復3次取平均值。

1.6 膽堿能神經遞質活性檢測 干預8周后將各組大鼠斷頸處死,取出腦組織并分離海馬,取部分海馬組織稱重后按重量與0.9%氯化鈉溶液體積1∶10比例配制冰浴勻漿,震蕩30 min后在4 ℃條件以3500 r/min離心10 min,取上清液采用比色法檢測膽堿乙酰轉移酶(Choline acetyltransferase,ChAT)和乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)活性,按照試劑盒操作,分別于520 nm和324 nm處測量吸光度值,根據其顏色深淺進行比色定量。

1.7 炎癥因子表達水平檢測 取部分海馬組織稱重后按重量與0.9%氯化鈉溶液體積1∶10比例配置冰浴勻漿,充分研磨后4 ℃條件下以10000 r/min離心10 min,再取上清液檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β表達水平。檢測方法為ELISA,操作方法按照試劑盒說明書完成,于450 nm處檢測吸光值并根據標準曲線計算各樣品炎癥因子水平。

1.8 NF-κB表達水平檢測 采取部分海馬組織稱重后按20 mg:150 μl的比例加入裂解液,于冰浴下勻漿,4 ℃條件下12000 r/min離心10 min,取上清液采用二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)法測定總蛋白濃度,分別用10%和4%的分離膠與濃縮膠對蛋白進行處理,行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),電泳分離蛋白后進行電轉膜,以5%脫脂奶粉搖床室溫封閉1 h后加入以兔抗鼠NF-κB抗體并于4 ℃孵育過夜,室溫環(huán)境下以TBST沖洗3次,10 min/次,然后加入羊抗兔IgG二抗(使用HRP標記),室溫環(huán)境孵育2 h,再以TBST洗滌3次,10 min/次,取出NC膜采用ECL試劑盒顯影,采用凝膠成像系統進行掃描并測定各條帶分光密度值,計算NF-κB相對蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠行為學評估結果比較 造模4周時,模型組、美金剛組、頭針組和聯合組大鼠逃避潛伏期顯著升高(P<0.05),穿越原平臺次數顯著降低(P<0.05)。治療8周時,美金剛組、頭針組和聯合組逃避潛伏期顯著降低(P<0.05),穿越原平臺次數顯著升高(P<0.05),且頭針組改善效果顯著優(yōu)于美金剛組(P<0.05),聯合組改善效果顯著優(yōu)于美金剛組和頭針組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠行為學評估結果比較

2.2 各組大鼠海馬組織ChAT和AChE活性比較 治療8周時,模型組、美金剛組、頭針組和聯合組海馬組織ChAT和AChE活性均顯著低于正常組(P<0.05),頭針組和聯合組ChAT和AChE活性均顯著高于模型組和美金剛組(P<0.05),聯合組ChAT活性高于頭針組(P<0.05),見表2。

2.3 各組大鼠海馬組織炎癥因子表達水平比較 治療8周時,模型組、美金剛組、頭針組和聯合組海馬組織TNF-α和IL-1β水平顯著高于正常組(P<0.05),IL-10和TGF-β水平顯著低于正常組(P<0.05);美金剛組、頭針組和聯合組TNF-α和IL-1β水平顯著低于模型組(P<0.05),IL-10和TGF-β水平顯著高于模型組(P<0.05),且頭針組TNF-α和IL-1β水平顯著低于美金剛組(P<0.05),IL-10和TGF-β水平顯著高于美金剛組(P<0.05);聯合組TNF-α和IL-1β水平顯著低于頭針組(P<0.05),IL-10和TGF-β水平顯著高于頭針組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠海馬組織炎癥因子水平比較(ng/mg)

2.4 各組大鼠海馬組織NF-κB表達水平比較 治療8周時,模型組、美金剛組、頭針組和聯合組海馬組織NF-κB蛋白表達水平顯著高于正常組(P<0.05);美金剛組、頭針組和聯合組NF-κB蛋白表達水平顯著低于模型組(P<0.05),且頭針組NF-κB蛋白表達水平顯著低于美金剛組(P<0.05),聯合組NF-κB蛋白表達水平顯著低于頭針組(P<0.05)。見圖1。

注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與美金剛組比較,△P<0.05;與頭針組比較,▲P<0.05

3 討 論

中醫(yī)將VD歸屬于“呆病”“健忘”或“不慧”等范疇,其病位在腦,《靈樞·大惑論》記載“上氣不足,下氣有余,故善忘也”,病機主要為陽氣虛衰,血氣瘀滯,痰凝阻絡,濁毒內蘊,從而破壞腦髓,導致迷惑健忘,行動呆滯等癥狀。本病為虛實夾雜之證,治療以補虛為主,同時兼顧祛邪,達到平衡陰陽,調和氣血的目的[7]。本研究建立大鼠VD模型進行研究顯示,造模4周時Morris水迷宮實驗評估逃避潛伏期,結果顯示模型組、美金剛組、頭針組和聯合組潛伏期時間更長,對比穿越平臺次數,模型組、美金剛組、頭針組和聯合組次數更少,說明建模成功后大鼠空間學習記憶能力明顯受損。對百會和四神聰進行針刺,并于治療8周時逃避潛伏期降低,且穿越原平臺次數增加。百會是調節(jié)大腦功能的要穴,具有通達陰陽,貫通諸經之功;四神聰可安心寧神,醒腦開竅。本研究結果顯示針刺百會和四神聰對VD大鼠空間學習記憶能力有良好改善效果,且效果優(yōu)于西藥美金剛治療。頭針與美金剛聯合治療VD大鼠具有協同作用,有利于提升療效。

CAP是生物體內廣泛分布的“免疫-神經-內分泌”信號通路,膽堿能神經遞質與受體結合后可啟動反饋調節(jié),從而產生抗炎效應。Damodaran等[8]研究認為大腦皮層和海馬等為較脆弱區(qū)域,缺血缺氧狀態(tài)下容易引起神經元發(fā)生損傷,導致認知障礙和造成記憶功能受損,刺激膽堿能系統利于改善認知缺陷。ChAT為催化乙酰膽堿合成的酶,AChE為催化乙酰膽堿分解的酶,兩者活性變化可共同維持腦組織中乙酰膽堿動態(tài)平衡[9-10]。本研究結果顯示模型組海馬組織ChAT和AChE活性較正常組和假手術組均明顯降低,表明ChAT和AChE活性降低可能是引起VD的重要因素,其機制可能與乙酰膽堿合成減少導致下游抗炎信號通路激活障礙有關。頭針治療可明顯提升VD大鼠海馬組織ChAT和AChE活性,與黃東挺等[11]報道顯示頭針可上調老年癡呆大鼠海馬組織乙酰膽堿表達水平的結果一致,有利于提升乙酰膽堿代謝轉換率,乙酰膽堿與受體結合激活抗炎通路,從而改善VD大鼠學習和記憶能力。本研究結果顯示頭針治療8周時VD大鼠海馬組織TNF-α和IL-1β表達水平顯著降低,同時IL-10和TGF-β表達水平顯著升高,表明針刺百會穴和四神聰有利于抑制促炎因子表達,增強抗炎因子表達,通過改善海馬組織炎癥反應,可減輕神經功能損傷,促進VD大鼠學習和記憶能力恢復,與李娜等[12]、鄧暢等[13]和田文靜等[14]研究結果相近。既往研究ChAT和AChE不僅參與調節(jié)乙酰膽堿代謝,還具有神經營養(yǎng)因子樣作用,可促進神經元發(fā)育和再生[15]。TGF-β屬于肽類生長因子,可促進細胞生長、增殖和分化,且對神經元損傷和凋亡具有拮抗作用,有利于減輕認知功能損害[16]。付倫姣等[17]研究發(fā)現TGF-β1/SMAD2信號通路被鈣通道α3亞基基因(GABRA3)所抑制,該機制會使神經元凋亡被促進,突觸形成和遞質釋放被抑制。

目前認為針刺調控CAP的機制可能與NF-κB等信號通路密切相關。冷鳳等[18]建立Alzheimer’s病大鼠模型進行研究顯示,預針刺可降低神經炎癥反應并改善學習記憶功能障礙,且其機制可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路激活存在密切聯系。本研究結果顯示模型組、美金剛組、頭針組和聯合組海馬組織NF-κB蛋白表達水平顯著高于正常組,表明VD大鼠海馬組織NF-κB信號通路激活,頭針治療8周時NF-κB水平明顯降低,提示頭針治療VD可抑制NF-κB信號通路,從而抑制炎癥反應水平。既往研究認為針灸可刺激迷走神經,同時對ChAT和AChE活性進行調控,從而調節(jié)乙酰膽堿合成和代謝,乙酰膽堿與免疫細胞表面特異性受體結合后形成的復合物影響NF-κB等下游信號通路激活,產生抗炎作用[19]。針刺百會穴和四神聰則可抑制海馬細胞炎癥信號通路活化并減少細胞凋亡,同時還可改善血液循環(huán),抑制興奮性氨基酸毒性,通過多重生理機制促進神經功能修復和重建[20]。本研究結果顯示對VD大鼠針刺百會穴和四神聰進行治療有利于增強ChAT和AChE活性,提升乙酰膽堿代謝水平,增強CAP作用,從而達到改善大鼠空間學習記憶能力的效果,且與興奮性氨基酸受體拮抗劑美金剛聯合治療可進一步提升療效。