比色和熒光雙模式農(nóng)藥殘留傳感新方法研究

朱少昊, 孫學(xué)萍, 譚婧盈, 楊東旭, 王海霞, 王修中*

1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院, 山東 青島 266109

2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院, 山東 青島 266109

引 言

俗話說“民以食為天”, 近年來農(nóng)藥殘留引起的食品污染事件時有發(fā)生, 大多是殘留農(nóng)藥污染的食物(如谷物、 蔬菜和水果等)而引起[1-2]。 農(nóng)藥可與乙酰膽堿酯酶結(jié)合, 使其失去原有催化乙酰膽堿水解的功能, 造成乙酰膽堿大量蓄積, 對神經(jīng)過分刺激而引起中毒, 中毒者表現(xiàn)為流涎腹瀉、 震顫肌束顫動等癥狀, 嚴重者可導(dǎo)致癱瘓和死亡[3]。 發(fā)展快速、 簡便、 準確靈敏的農(nóng)藥殘留檢測新方法, 加強對食品和農(nóng)產(chǎn)中農(nóng)藥殘留的監(jiān)測, 對保證食品安全, 尤其對保障人類的健康具有重大的理論和現(xiàn)實意義。

食品成分復(fù)雜, 實現(xiàn)農(nóng)藥殘留的監(jiān)測, 必須使用特異性強, 靈敏度高的檢測方法。 目前已報道的檢測方法主要有色譜法[4]、 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]、 免疫分析法[6]、 酶抑制法[7]和生物傳感器等技術(shù)[8]。 色譜法需要復(fù)雜樣品前處理, 與質(zhì)譜聯(lián)用所需儀器昂貴; 免疫分析法抗體制備復(fù)雜且難度大, 試劑盒的成本較高; 酶抑制法使用的酶易失活, 導(dǎo)致重現(xiàn)性差。 生物傳感器具有簡單快速, 選擇性好, 可直接對復(fù)雜試樣進行檢測等優(yōu)點, 在化學(xué)、 醫(yī)學(xué)和食品安全檢測等領(lǐng)域應(yīng)用呈現(xiàn)快速發(fā)展趨勢[9]。

生物傳感器中, 比色法簡單直觀, 可以實現(xiàn)裸眼檢測; 熒光法具有靈敏度高, 選擇性好等優(yōu)點在農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域獲得了較多進展[10]。 例如在氧化石墨烯的輔助下, 利用金納米粒子聚集分散變色特性, Ritika等[11]開發(fā)了細胞中大腸桿菌的檢測平臺。 根據(jù)溶液顏色從紅色變?yōu)樗{色, 肉眼觀察到的檢測限為102個細胞/毫升。 Lee等[12]首先將肽配體固定在納米金上, 使得納米金粒子均勻分散在溶液中, 借助真菌孢子與納米金相互作用, 使得納米金粒子沉淀, 導(dǎo)致上清液的顏色發(fā)生明顯變化。 簡單的比色法顯示出約50個孢子的高靈敏度和小于10 min的快速檢測時間, 并可與基于智能手機的圖像分析應(yīng)用程序一起使用。 Yu等[13]對多效唑溶液和蘋果汁-多效唑混合溶液的熒光光譜及其導(dǎo)數(shù)光譜進行了回歸分析, 分別得到了兩種方法的濃度與熒光強度之間的預(yù)測模型函數(shù), 為農(nóng)藥殘留的定量檢測提供了實驗參考。 有報道研究了吡蟲啉的熒光性質(zhì), 實現(xiàn)了對蘋果汁中吡蟲啉農(nóng)藥殘留進行檢測和分析。 盡管有關(guān)生物傳感器用于農(nóng)藥殘留的檢測已有較大發(fā)展, 但是現(xiàn)有報道大多是單一的測定模式, 不僅檢測結(jié)果存在假陽性的可能, 而且現(xiàn)有熒光檢測方法大多需要熒光標記物, 標記過程繁瑣, 價格高[14]。

本工作借助農(nóng)藥分子使分散的金納米粒子聚集而引起溶液顏色發(fā)生變化的原理, 實現(xiàn)裸眼檢測樣品中的農(nóng)藥殘留; 同時為了避免單一檢測模式可能出現(xiàn)的假陽性, 利用熒光染料羅丹明110與金納米發(fā)生熒光內(nèi)濾效應(yīng)的原理, 由于農(nóng)藥分子與金納米的強相互作用, 使得吸附在金納米表面的熒光染料重新釋放到溶液中, 熒光得以恢復(fù), 從而實現(xiàn)對農(nóng)藥殘留的高靈敏檢測。 以辛硫磷為模式目標物, 考察了該比色和熒光雙模式傳感器的性能及其在實際樣品中農(nóng)藥殘留檢測的應(yīng)用。 為進一步開發(fā)農(nóng)藥殘留分析的新方法和新技術(shù), 實現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品和食品等復(fù)雜樣品中痕量農(nóng)藥殘留的特異性和高靈敏的快速檢測提供新思路。

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

氯金酸, 辛硫磷, 馬拉硫磷, 丙溴磷, 甲霜靈, 福美鋅, 莠去津, 吡蟲啉購自上海阿拉丁試劑有限公司, 檸檬酸鈉, 氫氧化鈉, 磷酸氫二鈉, 磷酸二氫鈉, 氯化鈉, 乙腈, 醋酸鈉, 無水硫酸鈉和無水硫酸鎂, 均購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。 N-丙基乙二胺(PSA), C18, 石墨化碳黑(GCB)樣品前處理材料購自天津博納艾杰爾科技有限公司。 所用試劑均為分析純, 實驗用水為二次去離子水。

U-3900紫外-可見分光光度計(日立, 日本), F-7000熒光分光光度計(日立, 日本), PB-10酸度計(賽多利斯, 德國), HT7700透射電子顯微鏡(日立, 日本), 激光納米粒度儀(馬爾文, 英國)。

1.2 方法

1.2.1 金納米粒子的制備

納米金的制備根據(jù)文獻略做修改[15], 所有玻璃器皿在王水(濃鹽酸∶濃硝酸=3∶1,V/V)中徹底清洗后, 用二次去離子水沖洗干凈, 烘干備用。 制備過程: 在劇烈攪拌下, 將0.02%的HAuCl4(96 mL)水溶液煮沸, 將2%檸檬酸三鈉(4.0 mL)水溶液快速添加至上述溶液中, 溶液顏色從灰黃色變?yōu)樯罴t色, 繼續(xù)回流20 min后停止加熱, 待溶液冷卻后用0.45 μm濾膜過濾, 濾液置于棕色試劑瓶中, 于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 金納米粒子的結(jié)構(gòu)表征

取一定量上述制備的金納米溶液, 分別對其紫外-可見吸收光譜、 透射電子顯微鏡、 動態(tài)光散射及表面的Zeta電位進行測定。 同時在納米金溶膠中加入一定量的熒光染料羅丹明110, 形成納米金-羅丹明110納米復(fù)合粒子后, 再次對其吸收光譜和表面電荷情況進行測定。

1.2.3 比色及熒光測定

取一定量的納米金溶膠, 加入不同濃度的目標物后, 溶液顏色由酒紅色逐漸變?yōu)樗{紫色, 溶膠的吸光度值的變化與目標物濃度具有定量關(guān)系, 據(jù)此實現(xiàn)農(nóng)藥殘留的比色法檢測。

取一定量的納米金溶膠, 加入一定濃度的羅丹明110, 形成納米金復(fù)合物, 測試其熒光強度, 作為空白對照。 加入不同濃度的目標物后, 再次測試體系的熒光強度, 熒光增強的程度與目標物濃度在一定濃度范圍內(nèi)具有定量關(guān)系, 據(jù)此實現(xiàn)農(nóng)藥殘留的熒光高靈敏檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 金納米粒子及其復(fù)合物的表征

分別利用紫外-可見光譜(UV-Vis), 透射電鏡(TEM)和動態(tài)光散射對制備的納米金進行形貌表征, 如圖1所示。 由圖1(a)曲線1可以看到金納米粒子的最大吸收波長約為520 nm, 金納米粒子等離子體共振紫外可見吸收特征峰。 當(dāng)形成金納米-羅丹明110納米復(fù)合粒子后, 其最大吸收波長沒有明顯改變, 但其吸光強度有所下降(曲線2)。 從圖1(b)的TEM圖可看出所制備的Au納米粒子尺寸約為13 nm, 呈規(guī)整的球形, 邊界清晰, 分散良好。 圖1(c)為金納米-羅丹明110復(fù)合物的TEM圖, 可以看出粒子的直徑大小幾乎沒有改變。 圖1(d)的動態(tài)光散射結(jié)果顯示絕大多數(shù)納米粒子直徑同樣保持13 nm左右, 與TEM測試粒徑保持一致。 圖1(e)是金納米-羅丹明110復(fù)合物的動態(tài)光散射結(jié)果, 可以看出粒徑略微有少許增加。 圖1(f)顯示單獨金納米粒子表面的zeta電位為-44.1 mV, 金納米-羅丹明110納米復(fù)合粒子表面的zeta電位明顯升高, 為-30.3 mV, 這是由于金納米表面吸附了一定量帶正電荷的熒光染料羅丹明110所導(dǎo)致。

圖1 納米金及其復(fù)合物的表征

2.2 比色和熒光雙模式檢測的實驗原理

農(nóng)藥殘留的比色和熒光雙模傳感原理如圖2所示。 檸檬酸鹽還原法制備的AuNPs表面帶有較多的負電荷, 即使在一定濃度鹽存在下, 粒子之間的靜電排斥力使得金納米膠處于良好的分散狀態(tài), 其溶液顯示酒紅色。

圖2 比色和熒光雙模式傳感原理示意圖

當(dāng)存在農(nóng)藥分子時, 與納米金之間通過形成Au—N或者Au—O配位鍵結(jié)合, 導(dǎo)致分散的AuNPs在農(nóng)藥分子誘導(dǎo)作用下發(fā)生聚集, AuNPs溶液顏色由酒紅色變?yōu)樗{紫色, 其在520 nm處的吸光度逐漸降低, 通過檢測溶液吸光度的變化即可實現(xiàn)農(nóng)藥含量的測定。 溶液顏色的顯著變色即便裸眼也可以觀察, 該檢測方式具有簡便、 快速和成本低的優(yōu)勢。 單一的比色檢測模式雖然簡單, 但是其測試結(jié)果存在假陽性的可能。 為進一步驗證結(jié)果的準確性, 同時提高檢測的靈敏度, 本文利用熒光分子的發(fā)射與金納米的紫外可見吸收產(chǎn)生內(nèi)濾效應(yīng)(IFE), 設(shè)計了熒光傳感策略用于農(nóng)藥的高靈敏檢測。 在金納米溶膠中引入帶正電的熒光染料羅丹明110, 由于靜電作用, 羅丹明110會吸附在帶負電荷的納米金表面, 此時納米金在溶膠中仍處于良好的分散狀態(tài), 溶膠顯示酒紅色。 而熒光染料羅丹明110發(fā)射的熒光正好可以被金納米吸收, 此時溶液的熒光強度很弱, 甚至不發(fā)射熒光。 一旦溶液中存在農(nóng)藥分子, 與熒光染料產(chǎn)生競爭反應(yīng), 從而誘導(dǎo)金納米聚集, 溶液由酒紅色變?yōu)樗{紫色, 同時釋放金納米表面吸附的熒光分子到溶膠中, 實現(xiàn)熒光的恢復(fù), 根據(jù)溶液吸光度和熒光強度變化實現(xiàn)對目標物的雙模式檢測。

2.3 實驗的可行性研究

2.3.1 比色法檢測農(nóng)藥殘留

分別對金納米溶膠和加入辛硫磷后的金納米溶膠進行紫外可見光譜掃描, 結(jié)果如圖3(a)所示。 結(jié)果表明, 與單獨的金納米溶膠相比, 加入不同濃度的辛硫磷后的金納米溶膠在520 nm波長處吸光度逐漸減小, 同時650 nm波長處吸光度逐漸增加。 這是由于辛硫磷的加入引起了分散的AuNPs團聚, 導(dǎo)致金表面等離子共振吸收峰發(fā)生位移。 溶膠在650與520 nm處吸光度的比值(A650/520)與加入的目標物濃度具有定量關(guān)系, 據(jù)此實現(xiàn)比色法測定辛硫磷的含量的目的。

圖3 實驗的可行性研究

2.3.2 熒光法檢測農(nóng)藥殘留

分別測試羅丹明110溶液, 金納米與羅丹明110復(fù)合物溶膠以及加入一定量的農(nóng)藥后溶膠的熒光強度作對照, 其實驗結(jié)果如圖3(b)所示。 圖中三條曲線的峰形及最大發(fā)射波長一致, 表明AuNPs、 辛硫磷并未與羅丹明 110作用生成新物質(zhì)。 可以看出, 羅丹明110的熒光最強(曲線1), 其最大發(fā)射波長為520 nm; 而金納米與羅丹明110復(fù)合物的熒光發(fā)射強度顯著降低(曲線2), 這是由于羅丹明110分子可通過靜電作用吸附在AuNPs表面, 此時, 由于AuNPs與羅丹明110分子間的IFE產(chǎn)生熒光猝滅效應(yīng); 當(dāng)加入待測目標物農(nóng)藥后, 溶液的熒光強度又逐漸恢復(fù)(曲線3), 主要因為農(nóng)藥分子與納米金的強結(jié)合能力, 使得吸附在納米金表面的羅丹明110分子重新釋放到溶膠中, 其熒光的恢復(fù)程度與目標農(nóng)藥的濃度具有定量關(guān)系, 據(jù)此, 實現(xiàn)高靈敏熒光檢測農(nóng)藥殘留量。

2.3.3 金納米與羅丹明110的內(nèi)濾光效應(yīng)(IFE)

當(dāng)溶液中某物質(zhì)的吸收光譜與共存的某熒光分子的熒光光譜發(fā)生重疊或者部分重疊時, 則該物質(zhì)將能猝滅熒光分子的熒光發(fā)射, 導(dǎo)致溶液的熒光強度減弱甚至消失, 這種現(xiàn)象稱為IFE。 本實驗金納米粒子的吸收光譜與熒光染料羅丹明110的熒光光譜恰好發(fā)生了重疊, 如圖3(c)所示。 結(jié)果進一步證實, 二者之間確實存在IFE。 上述結(jié)果表明, 本實驗設(shè)計的比色和熒光雙模式檢測策略是可行的。

2.4 實驗條件的優(yōu)化

2.4.1 羅丹明110濃度的優(yōu)化

實驗中AuNPs和羅丹明110的相對量會直接影響熒光檢測的靈敏度。 游離的羅丹明110分子在溶液中本身發(fā)射熒光, 如果其濃度過高, 會使檢測的背景信號增大; 反之, 若羅丹明110濃度過低, 加入待測物質(zhì)后, 形成的聚集態(tài)AuNPs使熒光恢復(fù)程度較小, 降低了測定的靈敏度。 固定金納米溶液的濃度, 測試不同濃度羅丹明110的熒光強度與二者復(fù)合物溶液的熒光強度差值的變化情況, 如圖4(a)所示。 可以看出隨著羅丹明110的濃度的增加, 熒光強度差值逐漸增大, 當(dāng)羅丹明110的濃度為0.5 μmol·L-1時, 二者的差值達到最大, 羅丹明110的濃度再增大, 熒光背景增大, 二者的差值又逐漸減小, 因此, 選擇0.5 μmol·L-1的羅丹明110作為最佳實驗條件。

圖4 實驗條件的優(yōu)化

2.4.2 體系酸度的優(yōu)化

分別測試了不同酸度條件下, 體系的吸光度和熒光強度的差異, 結(jié)果如圖4(b)所示。 表明pH值較低時, 利于羅丹明110的質(zhì)子化, 其與AuNPs的作用力大, 不利于農(nóng)藥分子與羅丹明110在AuNPs表面的競爭, 因此, 體系的吸光度值(A650/520)較低, 熒光強度也比較弱。 隨著pH值的增大, 吸光度和熒光強度均逐漸升高; 當(dāng)溶液的pH超過7.5后, 體系的熒光強度有一定的下降, 可能是羅丹明110分子羧基中氫離子解離的緣故, 如圖4(b)所示。 因此, 確定實驗的最合適pH為7.5。

2.4.3 反應(yīng)時間的優(yōu)化

在最合適pH和濃度條件下, 分別改變目標物, 羅丹明110與金納米作用時間, 測試溶液的吸光度和熒光強度的變化, 如圖4(c)所示。 結(jié)果表明, 目標物與金納米作用時間為60 min; 羅丹明110與金納米作用時間30 min的情況下, 吸光度和熒光強度達到最佳。

2.5 體系的檢測性能及抗干擾能力

2.5.1 農(nóng)藥殘留的比色分析

選取辛硫磷為模型分析物, 驗證基于納米金比色傳感策略的檢測效果, 圖5(a)是不同濃度的辛硫磷存在時, 溶膠的吸收曲線, 插圖為相應(yīng)濃度的目標物導(dǎo)致的溶液顏色的變化情況。 由圖5(a)可知, 隨著目標物濃度的增大, 520 nm處吸光度逐漸降低, 表現(xiàn)為從a到f顏色由酒紅色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樗{紫色。 在0.05～10 μmol·L-1濃度范圍內(nèi), 溶液在650 nm處與520 nm處的吸光度比值, 即(A650/A520)與目標物濃度之間有良好的線性關(guān)系, 如圖5(b)所示。 線性回歸方程:A650/520=0.073c+0.083(A650/A520: 波長650與520 nm處吸光度比值;c: 目標物濃度, μmol·L-1), 相關(guān)系數(shù)為0.997, 檢出限為15 nmol·L-1。

圖5 不同濃度目標物存在時, 體系的紫外-可見吸收和熒光響應(yīng)情況

2.5.2 農(nóng)藥殘留的熒光分析

在最佳實驗條件下, 測試了不同濃度模型化合物與溶液熒光強度的變化關(guān)系, 如圖5(c)所示。 可以看出體系的熒光強度隨著目標物濃度的增加輻逐步增大。 在目標物濃度從0.01～5 μmol·L-1的范圍內(nèi), 體系的熒光強度和目標物濃度之間存在良好的線性關(guān)系, 如圖5(d)所示。 線性回歸方程:I=26.60c+ 6.82(I: 熒光強度;c: 目標物濃度, μmol·L-1), 相關(guān)系數(shù)為0.994, 檢出限為4 nmol·L-1。

2.5.3 干擾實驗

由于實際樣品中可能有多種成分同時存在, 因此, 進一步研究其他的類似物如馬拉硫磷, 丙溴磷, 甲霜靈, 福美鋅, 莠去津和吡蟲啉等農(nóng)藥存在時, 體系熒光的變化情況, 結(jié)果圖6所示。 所有農(nóng)藥濃度均為2.0 μmol·L-1, 可以看出, 該傳感器對辛硫磷、 吡蟲啉和莠去津的響應(yīng)較好, 對丙溴磷和甲霜靈響應(yīng)較差。 分析其分子結(jié)構(gòu)可以得出, 響應(yīng)好的農(nóng)藥分子具有較多的氮、 氧和硫原子, 但是福美鋅分子同樣具有較多的硫原子, 熒光響應(yīng)一般, 可能是由于福美鋅分子中的氮原子與鋅形成了配位鍵, 導(dǎo)致其與金納米表面作用力較弱的緣故。 同樣測試了部分金屬離子共存時, 體系的熒光響應(yīng)情況, 結(jié)果表明, 金屬離子幾乎不影響體系的熒光, 可能是由于溶液中共存的金屬離子經(jīng)過樣品預(yù)處理時, 與吸附劑中N-丙基乙二胺(PSA)的發(fā)生了配位結(jié)合而被去除的緣故。

圖6 不同農(nóng)藥分子和金屬離子存在時的熒光響應(yīng)

2.6 樣品測定

在最佳實驗條件下, 將該雙模式傳感器的熒光檢測策略用于市場購買的生姜和天然水中農(nóng)藥殘留量的測定。 新鮮生姜使用QuEChERS方法處理, 步驟如下: 取市售新姜10.000 0 g, 搗碎, 加入10 mL含1%醋酸的乙腈溶液和1 g醋酸鈉, 搖勻后加入1 g氯化鈉和4 g無水硫酸鈉趁熱劇烈震蕩1 min, 以7 000 r·min-1離心5 min。 取上清液 5.00 mL, 加入0.25 g PSA, 0.25 g C18(碳18), 0.1 g GCB石墨化碳黑和6.25 g無水硫酸鎂, 再次以7 000 r·min-1離心2 min, 取上清液待測。 天然水樣取之青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)虹子湖, 水樣經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾后, 待測。

在以上處理好的生姜提取液和水樣中, 分別加入濃度為0.2和2 μmol·L-1的辛硫磷, 混合均勻進行檢測, 每個濃度進行6次重復(fù)的實驗, 實驗結(jié)果如表1所示。 與天然湖水相比, 生姜處理液的加標回收率檢測結(jié)果偏差稍大, 可能與生姜處理液的成分相對復(fù)雜有關(guān)。 研究表明本方法具有良好的抗干擾能力, 可以用于實際樣品的測定。

表1 生姜和天然水中辛硫磷殘留的測定

3 結(jié) 論

以檸檬酸為還原劑合成金納米粒子, 設(shè)計與熒光染料羅丹明110發(fā)生內(nèi)濾光效應(yīng), 導(dǎo)致金納米對羅丹明110的熒光猝滅。 以辛硫磷農(nóng)藥為模型, 構(gòu)建了比色和熒光雙模式農(nóng)藥殘留傳感器。 通過目標物與金納米粒子相互作用, 引起溶液吸光度與熒光強度變化, 實現(xiàn)了對辛硫磷農(nóng)藥殘留的高靈敏檢測, 并用于實際樣品的測定。 相對于以往單一信號識別, 實現(xiàn)了農(nóng)藥殘留檢測雙信號輸出, 將在很大程度上避免假陽性出現(xiàn)的可能。