豬圓環(huán)病毒2 型感染樹突狀細(xì)胞外泌體中差異miRNA 分析

上官琳暉，丁文文，劉佳宇，范闊海，尹偉，孫娜，孫盼盼，李宏全*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院/中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 晉中 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心，山西 晉中 030801）

豬圓環(huán)病毒2 型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病（Porcine circovirus type 2 associated disease，PCVAD）主要病原體［1］。PCV2 感染后主要侵害機(jī)體免疫系統(tǒng)，表現(xiàn)為感染豬外周血和免疫器官中淋巴細(xì)胞大量凋亡，致使感染豬出現(xiàn)免疫抑制并繼發(fā)感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV）、豬細(xì)小病毒和豬流行性腹瀉病毒等多種病原體［2-3］。在PCV2 感染豬體內(nèi)，其抗原主要存在于樹突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）中［4］。體外實(shí)驗(yàn)表明，PCV2 在體外感染樹突狀細(xì)胞后，會(huì)抑制DC 成熟增強(qiáng)DC 內(nèi)吞作用，減弱DC對(duì)T 淋巴細(xì)胞的刺激作用［5］。因此，探討PCV2 與樹突狀細(xì)胞相互作用的機(jī)制是有必要的。

DC 作為功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞（Antigenpresenting cell，APC），在免疫反應(yīng)中起捕獲外來(lái)抗原的作用［6］。但是病毒也可以通過(guò)干擾DC 功能來(lái)逃避機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)并導(dǎo)致持續(xù)感染［7］，或者利用DC 攝取抗原后向淋巴結(jié)遷移的特性以DC 為媒介在體內(nèi)傳播［8-9］。研究表明，PCV2感染機(jī)體后，以巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞為靶細(xì)胞，單核細(xì)胞來(lái)源的樹突狀細(xì)胞（Mononuclear-derived dendritic cells，MoDC）中持續(xù)存在并保持感染性；這種現(xiàn)象表明DC 可能是PCV2 在體內(nèi)傳播的媒介［10-11］。

外泌體（Exosome，Exo）是一種由細(xì)胞釋放的細(xì)胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs），直徑為30~150 nm，呈橢圓或圓形盤狀［12-14］。外泌體可通過(guò)傳遞其所攜帶的內(nèi)容物（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、miRNA、tRNA 等）參與細(xì)胞間的分子傳遞來(lái)調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生理狀態(tài)［15］。在病毒感染中，外泌體可以通過(guò)內(nèi)容物變化，對(duì)機(jī)體的抗病毒作用產(chǎn)生影響［16］。MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，大小為19~25 nt，在細(xì)胞凋亡、免疫功能和腫瘤發(fā)生等過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，通常會(huì)導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默［17-18］。研究表明，病毒感染會(huì)引起宿主細(xì)胞中miRNA 表達(dá)量的變化，差異miRNA 又可以通過(guò)靶向宿主或病毒的基因轉(zhuǎn)錄，來(lái)調(diào)節(jié)病毒感染過(guò)程和宿主的免疫反應(yīng)［19］，如PRRSV可以通過(guò)上調(diào)感染細(xì)胞中miR-382-5p 和miR-30c表達(dá)，抑制Ⅰ型IFN 產(chǎn)生，促進(jìn)PRRSV 的感染和復(fù)制［20-21］。病毒與miRNA 這種相互作用可以被外泌體介導(dǎo)。PCV2 感染PK-15 細(xì)胞后，PK-15 外泌體可以通過(guò)上調(diào)miR-125a-5p 來(lái)抑制靶基因Bcl-2 表達(dá)，從而激活線粒體凋亡通路，抑制脾淋巴細(xì)胞增殖［22-23］。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PCV2 感染MoDC 后，在MoDC 來(lái)源外泌體中檢測(cè)到病毒成分，但PCV2感染后是否可以引起MoDC 來(lái)源外泌體中miRNAs 變化，以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)目前尚不清楚。因此，本研究通過(guò)建立PCV2 感染豬MoDC 模型，對(duì)正常MoDC 來(lái)源外泌體（DEX）與病毒感染的MoDC 來(lái)源外泌體（VDEX）中miRNA 進(jìn)行高通量測(cè)序，旨在探明PCV2 影響下VDEX 中差異表達(dá)miRNAs 及其靶基因的變化規(guī)律，為明確PCV2 感染的分子機(jī)制提供思路。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和細(xì)胞制備

PCV2-SH 毒株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)姜平教授提供，經(jīng)PK-15 增殖后測(cè)定病毒TCID50 為10-5.38。選取1 月齡臨床健康且PCV2 陰性長(zhǎng)白豬，購(gòu)自太谷縣冠農(nóng)農(nóng)牧科技有限公司，采集前腔靜脈血20 mL，使用豬外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）分離液試劑盒（天津?yàn)螅┨崛BMC。將PBMC 在MoDC 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d，每隔天更換半量培養(yǎng)基，即可得到MoDC。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 建立MoDC 感染PCV2 模型

將所得MoDC 接種到96 孔板中，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，37 ℃孵育12 h。棄去原培養(yǎng)基，加入2%1640 培養(yǎng)基和感染復(fù)數(shù)為1 MOI 的PCV2 病毒液，同時(shí)設(shè)置空白細(xì)胞對(duì)照組，每組3 個(gè)重復(fù)孔，病毒作用于細(xì)胞2 h 后棄去病毒液，加入2% 1640 培養(yǎng)基，培養(yǎng)至48 h。使用PCV2 間接免疫熒光檢測(cè)試劑盒（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）檢測(cè)MoDC 是否感染PCV2。

1.2.2 外泌體制備及鑒定

超高速離心法提取DEX 與VDEX。將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到10 mL EP 管中，1500 r·min-1，離心10 min，去除細(xì)胞沉淀；6000 r·min-1，4 ℃，離心10 min，去除死細(xì)胞；15 000 r·min-1，4 ℃，離心30 min，去除細(xì)胞碎片；31 200 r·min-1，4℃，離心90 min，棄去液體，1 mL 預(yù)冷PBS 完全溶解沉淀后，補(bǔ)滿PBS；31 200 r·min-1，4℃，離心90 min，棄去液體，100 μL 預(yù)冷PBS 重懸沉淀，經(jīng)0.22 μm 濾器過(guò)濾后分裝，-80 ℃保存。

納米顆粒追蹤技術(shù)（NTA）檢測(cè)：使用超純水清洗Zeta View PMX 110 樣本池，聚苯乙烯微球（110 nm）校準(zhǔn)機(jī)器，PBS 溶液再次清洗樣本池，將DEX 與VDEX 樣品使用PBS 溶液稀釋后上機(jī)檢測(cè)。

Western blot 檢測(cè)：分別取100 μL 溶于PBS 的DEX 與VDEX 提取總蛋白，二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)蛋白濃度，Western blot 鑒定外泌體表面標(biāo)志物CD63 和TSG101，一抗Anti-CD63 antibody（Abcam）和TSG101 Polyclonal Antibody（三鷹生物）以5% BSA 封閉液按1：1000 稀釋，二抗Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）-HRP（全式金）以TBST 按1∶40 000 稀釋。

1.2.3 Small RNA 測(cè)序

TRIzol 法分別提取DEX 與VDEX 組總RNA，用于Small RNA 文庫(kù)制備。使用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits 試劑盒制備Small RNA 測(cè)序文庫(kù)，由聯(lián)川生物技術(shù)公司完成測(cè)序。

1.2.4 測(cè)序結(jié)果分析

使用ACGT101-miRNA 軟件對(duì)miRNA 測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控處理后得到clean reads，留堿基長(zhǎng)度在18~26 nt 序列，再將其與各種RNA 數(shù)據(jù)庫(kù)（mRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)、RFam 數(shù)據(jù)庫(kù)和Repbase 數(shù)據(jù)庫(kù)）序列比對(duì)與過(guò)濾，最后獲得有效數(shù)據(jù)，對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定和預(yù)測(cè)分析。

1.2.5 miRNA 表達(dá)和差異分析

將DEX 組和VDEX 組miRNA 表達(dá)量歸一化到同一數(shù)量級(jí)，每組樣品拷貝數(shù)=原始拷貝數(shù)×算法校正因數(shù)；當(dāng)miRNA 表達(dá)量>1000 為高表達(dá)，表達(dá)量在10~999 之間為中表達(dá)，表達(dá)量在0~9 之間為低表達(dá)。miRNA 差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）=VDEX 組均值/DEX 組均值，采用獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)分析兩組樣品間miRNA 差異顯著性，當(dāng)|Log2（FC）|>1 時(shí)，如P<0.01 則miRNA 表達(dá)差異極顯著；0.010.05 時(shí)miRNA 差異表達(dá)不顯著。選擇差異最顯著40 個(gè)miRNA（校正P值FDR 最小的3.14e-08~9.70e-04）利用百邁克云平臺(tái)熱圖繪制軟件繪制了聚類熱圖。

1.2.6 miRNA 靶基因預(yù)測(cè)和富集性分析

使用TargetScan（v5.0）和miRanda（v3.3a）對(duì)差異顯著（P<0.05）的miRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。在TargetScan算法中保留閾值為TargetScan score≥50，miRanda Energy<-10，兩款軟件篩選結(jié)果取交集即為miRNA 靶基因。對(duì)靶基因進(jìn)行GO 功能和KEGG通路富集分析。

1.2.7 目標(biāo)miRNA 的qPCR 驗(yàn)證

根據(jù)測(cè)序所得miRNA 序列采用加尾法在DNAMAN 9 軟件中設(shè)計(jì)miRNA 上游引物（表1），引物序列由西安擎科生物科技有限公司合成，下游通用引物由M5 miRNA qPCR Assay Kit 提供。使用Easy Pure? miRNA Kit 試劑盒（全式金）提取并純化DEX 與VDEX 中miRNA，根據(jù)M5 miRNA cDNA Synthesis Kit（聚合美）說(shuō)明書進(jìn)行操作，qPCR 反應(yīng)體系20 μL：2×M5 miRNA qPCR Mixture 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線15 s。目的基因表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

1.3 數(shù)據(jù)分析

miRNA 測(cè)序結(jié)果用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行分析。qRT-PCR 結(jié)果t-test 檢驗(yàn)顯著性；P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 差異極顯著。用GraphPad Prism 5.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染PCV2 MoDC 模型的鑒定

PCV2 Cap 蛋白是由ORF2 所編碼的病毒衣殼蛋白，是PCV2 目前唯一已知的結(jié)構(gòu)蛋白，具有良好的免疫原性，常用來(lái)作為PCV2 的檢測(cè)［22］。感染PCV2 的MoDC 培養(yǎng)48 h 后，］間接免疫熒光（IFA）檢測(cè)PCV2 Cap 蛋白，用熒光倒置顯微鏡觀察。未感染病毒的MoDC 正常細(xì)胞對(duì)照組（圖1A，圖1C）中未觀察到特異性綠色熒光；MoDC 在感染PCV2 48 h 后，熒光顯微鏡下可觀察到特異性的綠色熒光為Cap 蛋白（圖1D，圖1F），并且可以觀察到Cap 蛋白在MoDC 內(nèi)表達(dá)（圖4F）。結(jié)果表明，MoDC 可以被PCV2 感染，PCV2 體外感染MoDC 模型建立成功，達(dá)到后續(xù)提取外泌體的細(xì)胞要求。

圖1 PCV2 感染MoDC 48 h 后PCV2 Cap 蛋白分布Fig.1 Cap protein distribution of PCV2 after PCV2 infection with MoDC in 48 h

2.2 外泌體鑒定

DEX 與VDEX 鑒定結(jié)果如圖2 所示。粒徑檢測(cè)顆粒分析技術(shù)結(jié)果見圖2A，2 組外泌體直徑集中在120 nm 左右。從兩組MoDC 培養(yǎng)基上清中經(jīng)超速離心所得的沉淀物，免疫印跡檢測(cè)結(jié)果見圖2B，沉淀物均表達(dá)外泌體標(biāo)志性蛋白質(zhì)CD63 和TSG101。NTA 和WB 結(jié)果表明，超高速離心所得沉淀物為外泌體。

圖2 外泌體鑒定Fig.2 Identification of exosomes

2.3 DEX 和VDEX 差異表達(dá)miRNAs 比較分析

DEX 和VDEX 的miRNAs 表達(dá)量差異表達(dá)miRNAs 有908 個(gè)。表2 給出差異極顯著前10 個(gè)miRNA。差異表達(dá)miRNAs 火山圖（圖3）顯示，與DEX 組相比，VDEX 組差異表達(dá)顯著有504 個(gè)miRNAs（P<0.05），VDEX 組特異性高表達(dá)新miRNA 有3 個(gè)，分別是：miPC-3p-11758_454、miPC-3p-7555_705 和miPC-5p-3971_1298；特異性中度表達(dá)有61 個(gè)。DEX 組特異性高表達(dá)有3個(gè)，分別是：ssc-miR-4332_L-1R-1、ssc-miR-142-3p 和ssc-miR-150；特異性中表達(dá)有156 個(gè)，特異性低表達(dá)87 個(gè)。即PCV2 侵入樹突細(xì)胞外泌體以后激活了64 種miRNA 表達(dá)，遏止了246 個(gè)miRNA 表達(dá)。

圖3 差異表達(dá)miRNA 火山圖Fig.3 Volcano plot of differentially expressed miRNA

表2 PCV2 感染外泌體中差異極顯著miRNA（前10）Table.2 Highly differentiated miRNAs in PCV2-infected exosomes （Top 10）

2.4 miRNAs 聚類熱圖

圖4是用miRNA 差異極顯著前40 個(gè)miRNA聚類分析，特異性僅在DEX 中表達(dá)miRNA 有11個(gè)，僅在VDEX 組表達(dá)8 個(gè)；共表達(dá)miRNA 有21個(gè)：其中19 個(gè)miRNA 在VDEX 中顯著降低，僅有2 個(gè)上調(diào)。

圖4 差異表達(dá)miRNA 聚類熱圖Fig.4 Complex heatmap of differentially expressed miRNA

2.5 靶基因GO 富集分析

GO 富集分析氣泡圖顯示（圖5），差異miRNA的靶基因富集在細(xì)胞核中的數(shù)量最多，其次是蛋白結(jié)合功能；富集程度最高的是激酶活性、其次是氧化還原酶活性；靶基因富集數(shù)量多同時(shí)富集程度高是在細(xì)胞質(zhì)。結(jié)果表明差異miRNA 的靶基因可能廣泛參與調(diào)控細(xì)胞功能和生物學(xué)過(guò)程。

圖5 差異表達(dá)miRNA 靶基因GO 富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of differentially expressed genes in miRNA

2.6 靶基因KEGG 分析

KEGG 通路分析氣泡圖（圖6）顯示，差異miRNA 的靶基因富集在癌癥通路的數(shù)量最多，其次是單純皰疹病毒1 感染通路；富集程度最高的通路是T 細(xì)胞受體（TCR）信號(hào)通路，其次Th17 細(xì)胞分化通路、再者是B 細(xì)胞受體信號(hào)通路和FCγR-介導(dǎo)吞噬作用；靶基因富集數(shù)量多同時(shí)富集程度高的是內(nèi)吞作用通路。TNF 信號(hào)通路、人白細(xì)胞病毒1 感染（HTLV-1）、人類免疫缺陷病毒1 型感染（HIV-1）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎通路、流體剪切力與動(dòng)脈粥樣硬化、趨化因子信號(hào)通路等均與免疫相關(guān)。

圖6 差異表達(dá)miRNA 靶基因KEGG 富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of differentially expressed miRNA target genes

2.7 構(gòu)建miRNA 靶基因的網(wǎng)絡(luò)圖

選擇VDEX 組特異性高表達(dá)的3 個(gè)miRNAs，極顯著上調(diào)ssc-miR-10b 和PC-3p-29629_167 ，極顯著下調(diào)ssc-miR-140-3p_L-1、ssc-miR-532-5p、 ssc-miR-425-5p、 ssc-miR-210、 ssc-miR-144_R+1 和ssc-miR-34c 的靶基因及其富集KEGG 通路（表3）。把12 個(gè)miRNAs 預(yù)測(cè)靶基因作為研究對(duì)象，以紅色四邊形節(jié)點(diǎn)為miRNA，紫色圓形節(jié)點(diǎn)為對(duì)應(yīng)的靶基因，箭頭代表靶向關(guān)系，構(gòu)建miRNA-Target 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（圖7），其中VDEX 組特異性高表達(dá)miPC-3p-7555_705 處于中間位置，與ssc-miR-10b 共同調(diào)控TNF 表達(dá)，與特異性高表達(dá)miPC-5p-3971_1298 共同調(diào)控TRIM52 和SMAD3，與ssc-miR-140-3p_L-1 共同調(diào)控IL2 和PPP3CA，還有ssc-miR-532-5p 調(diào)控IL2，與ssc-miR-34c 共同調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子FOSL1。另外，IL-2 及受體家族IL2RG、IL2RA、IL2RB，原癌基因AKT 家族等、轉(zhuǎn)錄因子、NFKBIA、NFKBIE、NFATC1 家族均是與免疫調(diào)控密切相關(guān)的基因。

圖7 12 個(gè)miRNA-靶基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Network diagram of 12 miRNA-target genes

2.8 miRNA 測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證

在表達(dá)差異顯著miRNA 中進(jìn)一步篩選，保留P<0.001 和| Log2（FC）|≥2.0 的豬源已知miRNA，再參照KEGG 結(jié)果篩選可能參與病毒感染和免疫相關(guān)的目標(biāo)miRNA。最后選出10 個(gè)目標(biāo)miRNA：ssc-miR-199a-3p-R-1、ssc-miR-532-5p、ssc-miR-425-5p、ssc-miR-210、ssc-miR-144-R+1、ssc-let-7c、ssc-miR-107-R-2、ssc-miR-22-5p-R-1、ssc-miR-296-3p-R+1 和ssc-miR-10b。對(duì)篩選出10 個(gè)目標(biāo)miRNA 進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證，結(jié)果表明，與DEX 相比，ssc-miR-532-5p、ssc-miR-425-5p、ssc-miR-210、ssc-miR-144-R+1、ssc-let-7c、ssc-miR-107-R-2、ssc-miR-22-5p-R-1 和 sscmiR-296-3p-R+1 在VDEX 中表達(dá)量均顯著降低（P<0.05；圖8），與測(cè)序結(jié)果一致；ssc-miR-199a-3p-R-1 和ssc-miR-10b 在VDEX 中表達(dá)量顯著降低（P<0.05），與測(cè)序結(jié)果不一致，這可能由于我們未使用測(cè)序樣本進(jìn)行驗(yàn)證，并且這2 組基因表達(dá)量偏低，從而導(dǎo)致結(jié)果上下調(diào)不一致。

圖8 目標(biāo)miRNA qPCR 驗(yàn)證Fig.8 qPCR verification of target miRNA

3 討論

DC 是目前所知抗原遞呈功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，能有效激活初始T 細(xì)胞，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。Vincent 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，感染了PCV2 的DC 與T 細(xì)胞共培養(yǎng)一段時(shí)間后，雖然觀察到T 細(xì)胞與DC 產(chǎn)生了細(xì)胞接觸，但未觀察到病毒轉(zhuǎn)移。這表明，在PCV2 感染中，感染了PCV2 的DC 可能不通過(guò)細(xì)胞接觸的方式調(diào)節(jié)機(jī)體的抗PCV2 感染。DC 分泌的外泌體具有調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞細(xì)胞活動(dòng)的功能。Tkach 等［25］通過(guò)將DC 分泌的各類外泌體分別添加進(jìn)CD4+T 細(xì)胞培養(yǎng)體系中與T 細(xì)胞共孵育。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DC 分泌的外泌體均可以激活CD4+T 細(xì)胞，促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞增殖及分化。另外，在腫瘤研究中，發(fā)現(xiàn)外泌體還可以通過(guò)向受體細(xì)胞傳遞MHC Ⅰ、補(bǔ)體活化相關(guān)物質(zhì)以及抗原成分，促進(jìn)T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的活化，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)［26-28］。為了探究感染了PCV2 的DC 是否可以通過(guò)VDEX 途徑進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)獲得了DEX 與VDEX 中miRNA 差異表達(dá)譜，與DEX 相比，VDEX 中表達(dá)差異顯著的miRNA 有504 個(gè)（P<0.05），其中上調(diào)的有161個(gè)，下調(diào)的有343 個(gè)。對(duì)差異顯著的miRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)、GO 富集分析和KEGG 富集分析，差異顯著miRNA 共預(yù)測(cè)到13 204 個(gè)靶基因（P<0.05），GO 富集分析得到具有顯著性的GO 條目1752 條（P<0.05），KEGG 富集分析得到具有顯著性的通路203 條（P<0.05）。

GO 富集分析結(jié)果顯示，差異miRNA 的靶基因主要參與的生物學(xué)功能有轉(zhuǎn)錄調(diào)控（DNA 模板）、RNA 聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的正/負(fù)調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和氧化還原等過(guò)程，KEGG 通路富集顯示，差異miRNA 靶基因在TNF 信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、癌癥通路、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路、自噬通路和AMPK 信號(hào)通路等信號(hào)通路顯著富集。因此，DEX 與VDEX 的差異主要集中在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞核、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路等方面。這些差異表明，VDEX 可能通過(guò)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和T 細(xì)胞受體信號(hào)通路介導(dǎo)免疫過(guò)程。

其中ssc-miR-122 通過(guò)與PK-15 細(xì)胞中的3’UTR 結(jié)合，下調(diào)活化T 細(xì)胞5 核因子（NFAT5）和嘌呤霉素敏感氨基肽酶的表達(dá)，抑制PCV2 的蛋白質(zhì)表達(dá)和病毒DNA 復(fù)制［29］。miR-30a-5p 靶向自噬調(diào)節(jié)因子14-3-3 基因，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中發(fā)揮作用。miR-30a-5p 的過(guò)表達(dá)可以通過(guò)增強(qiáng)自噬來(lái)觸發(fā)PCV2 復(fù)制，而miR-30a-5p 的阻斷顯著降低了PCV2 的復(fù)制［30］。miR-15a 的上調(diào)通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白D1 和E 的降解促進(jìn)了PCV2 誘導(dǎo)的G0/G1 細(xì)胞周期阻滯，有助于病毒的有效復(fù)制［31］。在本研究中，ssc-miR-122 的上調(diào)以及miR-30a-5p 的下調(diào)可能解釋PCV2 在DC 細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到明顯的病毒復(fù)制。PCV2 通過(guò)上調(diào)miR-23a 和miR-29b，激活PI3K/Akt1 和p38 MAPK 信號(hào)，抑制IL-12p40 的表達(dá)。同時(shí)，抑制ssc-miR-23a 和ssc-miR-29b 可以減輕PCV2 對(duì)IL-12p40 的抑制作用，導(dǎo)致IL-12p40 表達(dá)和Th1 細(xì)胞群增加［32］。IL-12p40 是IL-12 的p40 亞基，其可以誘導(dǎo)Th1 的促炎功能，從而將先天免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)聯(lián)系起來(lái)［33］。提示ssc-miR-23a 和ssc-miR-29b可能與T 細(xì)胞極化和宿主免疫反應(yīng)有關(guān)。在PCV2 亞臨床感染豬中miRNA 126-3p，miRNA 126-5p，let-7d-3p，mir-129a 和mir-let-7b-3p 上調(diào)，而mir-193a-5p，mir-574-5p 和mir-34a 下調(diào)，推測(cè)這些miRNA 可以參與與免疫系統(tǒng)相關(guān)的途徑［34］。

本研究通過(guò)結(jié)合差異miRNA 顯著性P 值，F(xiàn)old-change 以及KEGG 分析結(jié)果，選出可能參與VDEX 介導(dǎo)免疫反應(yīng)的10 個(gè)目標(biāo)miRNA。在這10 個(gè)miRNA 的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)中，存在調(diào)控T 細(xì)胞增殖分化的靶點(diǎn)。ssc-miR-10b 靶向IL2RA 基因，IL2RA 可以通過(guò)激活調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）來(lái)抑制效應(yīng)T 細(xì)胞的活化和增殖［35，36］。ssc-miR-532-5p、ssc-miR-107-R-2 和ssc-miR-296-3p-R+1 靶向TAF1 基因，TAF1 是CD4+CD25+FoxP3+Treg 細(xì)胞主要轉(zhuǎn)錄子FoxP3 的啟動(dòng)子，有促進(jìn)Treg 分化增殖的作用［37］。ssc-miR-107-R-2 靶向STAT3，STAT5 基因，研究發(fā)現(xiàn)STAT3 和STAT5 可作用于Treg 的分化過(guò)程，未成熟樹突狀細(xì)胞外泌體中miR-683 可以通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3，STAT5 的表達(dá)促進(jìn)Treg 分化［38］。

隨后，我們對(duì)目標(biāo)miRNA 進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證，檢測(cè)miRNA 在正常組和病毒組中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)qPCR 結(jié)果與測(cè)序結(jié)果基本一致。由此可知，VDEX 可能是通過(guò)調(diào)控T 細(xì)胞的增殖分化來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。雖然本研究獲得了感染PCV2 的MoDC 外泌體中差異表達(dá)miRNA 的一些信息，但仍然存在一些不足，本研究?jī)H限于基因水平，缺乏在動(dòng)物模型中的驗(yàn)證，我們將在后期試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證本次發(fā)現(xiàn)。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)比較DEX 和VDEX 中差異表達(dá)miRNA 來(lái)進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異miRNA 靶基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并且多集中于T 細(xì)胞受體信號(hào)通路。由此我們推測(cè)PCV2 感染后表達(dá)量變化最大的13 種miRNA 可能是VDEX 調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的效應(yīng)物質(zhì)之一。本試驗(yàn)為深入研究PCV2 與DC 感染的相互作用以及對(duì)PCV2 的防治提供了新思路。